Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para identificar compostos que interrompem a ligação do ligante de Chemokine fluorescente-etiquetadas CXC 12 a CXC Chemokine Receptor 4
10 de março de 2018
Um fluxo de ensaio de ligação celular baseados em citometria é descrito que é usado principalmente como uma ferramenta de triagem para identificar compostos que inibem a ligação de um ligante de chemokine CXC fluorescente etiquetada 12 (CXCL12) para o receptor do chemokine CXC 4 (CXCR4).
O objetivo geral do ensaio baseado em células é identificar moléculas que se ligam a um receptor acoplado à proteína G. Com base em sua capacidade de competir com um ligante marcado com fluorescência pela ligação ao receptor. O ensaio de ligação à competição pode apoiar a descoberta de medicamentos para receptores acoplados à proteína G.
Como demonstraremos com este protocolo para o receptor de quimiocina, CXC4. A principal vantagem desse método é que as células vivas são usadas para analisar a ligação receptiva em vez das preparações de memória. E que o uso de sondas de marcação de radioatividade seja evitado.
Embora este método tenha sido inicialmente configurado para estudar a ligação ao receptor de quimiocina CXCR4, ele também pode ser desenvolvido para outros GPCR para os quais existem ligantes marcados com fluorescência. Para começar, dispense 100 microlitros de solução composta em uma placa inferior clara de 96 poços arredondados, de acordo com um layout experimental predefinido. Adicione 50 microlitros de suspensão celular de um reservatório de reagente na placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal.
Incube a placa por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, adicione 50 microlitros de 100 nanogramas marcados com fluorescência por mililitro CXCL12 de um reservatório de reagente semelhante aos poços da placa de 96 poços. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro.
Em seguida, centrifugue a placa de 96 poços a 400 vezes a gravidade por cinco minutos à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante das células peletizadas virando a placa. Seque o prato em um lenço de papel.
Adicione 200 microlitros de tampão SA fresco de um reservatório de reagente aos poços usando uma pipeta multicanal. Proceder imediatamente à centrifugação da placa, durante cinco minutos, a 400 vezes a gravidade à temperatura ambiente. Remova novamente o sobrenadante, virando a placa e secando-a em um lenço de papel.
Finalmente, ressuspenda suavemente o pellet celular em 200 microlitros de 1% de paraformaldeído dissolvido em PBS. Esta etapa corrigirá as células. Para analisar as amostras por citometria de fluxo, inicie o dispositivo e abra o software correspondente.
Selecione os parâmetros celulares a serem visualizados em um formato de bloco de pontos, como área de dispersão direta, área de dispersão lateral e, em uma visualização de histograma, o canal de detecção de quatro flúor. Escolha uma amostra. Por exemplo, uma amostra de controle negativo, para realizar o gating de uma população de células homogênea definida com base nos parâmetros de dispersão direta e lateral.
Adaptar as regulações para carregar as células no dispositivo de citometria de fluxo. Selecione três misturas antes da injeção. Selecione a injeção automática de 100 microlitros de células fixadas e use uma taxa de fluxo de amostra de 1,5 microlitros por segundo.
Execute o exemplo selecionando adquirir dados. Os parâmetros de dispersão direta e lateral para esta amostra, bem como a detecção de quatro flúor, agora aparecerão na tela. Agora, selecione a ferramenta de controle de software.
Com base na visualização do gráfico de pontos de dispersão direta e lateral, predefina uma população de células homogênea e viável por gating. Selecione para analisar 20.000 eventos por amostra. Isso significa que, para cada amostra, 20.000 células que se enquadram em portas predefinidas serão eventualmente analisadas.
A aquisição de dados continuará até que esse número de eventos seja atingido. Inicie a execução selecionando primeiro os poços a serem analisados. Em seguida, seleciona poços de execução.
O dispositivo de citometria de fluxo agora analisará essas amostras uma a uma, registrando a intensidade média de fluorescência para cada amostra. O que corresponde ao sinal fluorescente médio das 20.000 células que se enquadram na porta predefinida. Por fim, realize a análise dos dados conforme descrito no protocolo.
Após a pré-incubação de células jurkat com altas concentrações de AMD3100, antagonista CXCR4 não estabelecido e específico. A intensidade média de fluorescência que reflete a ligação do CXCL12 marcado é quase totalmente reduzida aos níveis de fundo. Isso demonstra a ligação altamente específica de CXCL12 a CXCR4 expressa em células jurkat.
Compostos que são incapazes de competir com CXCL12 marcado pela ligação ao receptor CXCR4, como o antagonista CCR5 Maraviroc, não afetarão a intensidade média de fluorescência. Em contraste, compostos altamente ativos farão isso de maneira dependente da dose. Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de ligação receptiva de competição usando células vivas e citometria de fluxo.
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Visão Geral
Este artigo descreve um ensaio celular de ligação baseado em citometria de fluxo, com o objetivo de identificar compostos que inibem a ligação de CXCL12 a CXCR4. O método utiliza células vivas para analisar a ligação ao receptor, evitando o uso de marcadores radioativos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Ensaios de ligação celular
- Receptores acoplados à proteína G
- Descoberta de fármacos
Antecedentes
- CXCL12 é uma quimiocina que se liga a CXCR4, um receptor acoplado à proteína G.
- A identificação de inibidores dessa ligação pode auxiliar no desenvolvimento de medicamentos.
- Métodos tradicionais frequentemente envolvem radioatividade, o que este ensaio procura evitar.
- O uso de células vivas fornece uma representação mais precisa das interações biológicas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver uma ferramenta de triagem para identificar compostos que inibem a ligação de CXCL12 ao CXCR4.
- Demonstrar as vantagens do uso de células vivas em ensaios de ligação.
- Apoiar os esforços de descoberta de fármacos para receptores acoplados à proteína G.
Métodos Utilizados
- Citometria de fluxo para analisar ligação celular.
- Uso de ligantes marcados com fluorescência para avaliar competição de ligação.
- Ensaios com células vivas para avaliar interações de receptores.
- Evitação de marcação radioativa na configuração experimental.
Resultados Principais
- O ensaio identifica com sucesso compostos que inibem a ligação de CXCL12.
- A análise de células vivas fornece dados mais relevantes em comparação com métodos tradicionais.
- O método é eficaz para triagem de candidatos potenciais a fármacos.
- Os resultados apoiam a viabilidade do uso deste ensaio na descoberta de fármacos.
Conclusões
- O ensaio baseado em citometria de fluxo é uma ferramenta valiosa para identificar inibidores de CXCR4.
- O uso de células vivas aumenta a precisão dos estudos de ligação.
- Evitar a radioatividade simplifica o processo experimental.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio de ligação por competição baseado em citometria de fluxo permite que equipes de biofármacos identifiquem moléculas pequenas que interrompem as interações entre CXCL12 e CXCR4, um alvo importante em pipelines de oncologia e doenças inflamatórias. Ao utilizar células vivas e ligantes fluorescentes, o método evita o uso de radioatividade, fornecendo ao mesmo tempo dados de ligação fisiologicamente relevantes. Ele auxilia na validação precoce de alvos e na identificação de compostos líderes, fornecendo leituras quantitativas e reprodutíveis para a priorização de compostos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a medição dos efeitos diretos de compostos na ligação receptor-ligante em um contexto celular nativo.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura funcional que reduz os riscos associados ao CXCR4 como alvo, por meio da confirmação mecanicista da atividade do composto.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar compostos com perfis de inibição dependentes da dose, indicativos de interação com o alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de inibição da ligação por meio da intensidade média de fluorescência, permitindo a análise da relação estrutura-atividade.
- Valor Operacional: Adaptável ao formato de placa de 96 poços, aumentando a produtividade em campanhas de triagem, mantendo a consistência do ensaio.
- Reutilizabilidade: Estabelece uma plataforma padronizada aplicável a outros GPCR, quando ligantes fluorescentes estiverem disponíveis, reduzindo o esforço de re-desenvolvimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Utiliza células vivas de Jurkat para refletir a expressão fisiológica de receptores e a dinâmica de ligação, melhorando a relevância translacional.
- Valor Operacional: Gera dados compatíveis com avaliações pré-clínicas subsequentes ao confirmar os efeitos de compostos específicos para o alvo.
- Mitigação de Riscos: Reduz falsos positivos ao distinguir inibidores específicos de CXCR4 de compostos não específicos (por exemplo, o maraviroc não apresenta efeito).
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, fornecendo dados de ligação que orientam a progressão de hits para compostos líderes. Ele complementa a triagem fenotípica ao acrescentar profundidade mecanicista à caracterização dos compostos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação da interrupção induzida por compostos na ligação de CXCL12 ao CXCR4 em células vivas.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio por meio de etapas padronizadas de incubação, lavagem e fixação, compatíveis com leituras por citometria de fluxo.
- Análises: Fornece a intensidade média de fluorescência como saída quantitativa para comparação da potência e eficácia de compostos em diferentes doses.
- Pesquisa Translacional: Utiliza uma linhagem celular relevante para doenças (Jurkat) que expressa CXCR4, vinculando dados de ligação a possíveis impactos terapêuticos em câncer e inflamação.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma modular de ligação transferível entre alvos GPCR, maximizando o retorno sobre o investimento em desenvolvimento de ensaios.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva no engajamento do alvo ao demonstrar ligação específica e deslocável de CXCL12 a CXCR4.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de manipulação padronizada de células, tempos de incubação e protocolos de seleção em citometria de fluxo.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao filtrar compostos que não apresentam atividade específica pelo alvo no início da descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco ao identificar compostos com perfis claros de inibição dependentes da dose.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em operação de citometria de fluxo, compensação e estratégias de seleção de populações de células viáveis.
- Depende do acesso a citômetros de fluxo capazes de detectar sinais fluorescentes no canal apropriado (por exemplo, FITC ou equivalente).
- Necessita padronização da preparação celular, diluição de compostos e condições de incubação entre os lotes de triagem.
- A adaptação a outros RCPGs requer o desenvolvimento ou aquisição de ligantes marcados fluorescentemente específicos para o receptor-alvo.
- Limitações práticas incluem a duração do ensaio (~90 minutos mais o tempo de análise) e a necessidade de otimização da concentração do ligante para garantir razões sinal-ruído robustas.
