Name: Promotor captura Oi-c: Alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a técnica Promoter Capture Hi-C para mapear interações cromossômicas de longo alcance entre promotores e elementos reguladores. Este método avança a compreensão da arquitetura tridimensional do genoma e regulação gênica.

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Agradecemos Valeriya Malysheva pela leitura crítica do manuscrito e ajuda especializada com a Figura 1. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de pesquisa médica, UK (Sr/L007150/1) e UK biotecnologia e Conselho de pesquisa de ciências biológicas, UK (BB/J004480/1).

Os autores não têm nada a divulgar.

Design modular do promotor capturar Hi-C
Promotor capturar Hi-C destina-se especificamente a enriquecer bibliotecas Hi-C para interações envolvendo promotores. Essas interações compõem apenas um subconjunto de produtos da ligadura presentes em uma biblioteca de Hi-C.
Captura Hi-C pode ser facilmente modificado para enriquecer as bibliotecas de Hi-C para qualquer região genômica ou regiões de interesse, alterando o sistema de captura. Regiões de captura podem ser contínua segmentos genômicos44,45,46,48, potenciadores que foram identificadas no PCHi-C (' reverter capturar Hi-C'35), ou DNase eu hipersensíveis sites49 . O tamanho do sistema de captura pode ser ajustado dependendo do escopo experimental. Por exemplo, Dryden et al. 519 fragmentos de isca em três desertos de gene associados com câncer de mama44-alvo. O sistema de captura por Martin et al. destinos de ambos os segmentos genômicos contínuos ('Região Capture': 211 regiões genômicas no total; 2.131 fragmentos de restrição) e selecionado os promotores (3.857 promotores de gene)45.
SureSelect bibliotecas estão disponíveis em escalas diferentes tamanho: 1 kb para 499 kb (5.190 – 4.806), de 500 kb para 2,9 Mb (5.190-4.816) e 3 Mb de 5.9 Mb (5.190 – 4.831). Como cada captura individual biotina-RNA é 120 nucleotides longos, estes capturar sistemas acomodar um máximo de 4.158, 24.166 e 49.166 individuais de captura de sondas, respectivamente. Isso corresponde a 2.079, 12.083 e 24.583 fragmentos de restrição do alvo, respectivamente (Observe que os números de fragmentos de restrição são limites inferiores com base no pressuposto de que as duas sondas de captura individuais podem ser projetadas para cada restrição fragmento — na realidade devido à sequências repetitivas, isto não será o caso para cada restrição do fragmento (ver também figura 1B, C), resultando em um maior número de fragmentos de restrição targetable por um número constante de captura disponíveis sondas ).
O protocolo descrito aqui é baseado na utilização de uma enzima de restrição com um site de reconhecimento bp 6 para descobrir a interações de longo alcance. Usar uma enzima de restrição com um site de reconhecimento bp 4 para maior resolução de interações mais proximais é também possível40,49.
Limitações do PCHi-C
Uma limitação inerente de todos os ensaios de captura de conformação cromossomo é que sua resolução é determinada pela enzima de restrição, utilizada para a geração de biblioteca. Interações que ocorrem entre elementos de DNA localizados no fragmento de restrição mesmo são invisíveis para os ensaios de 'tipo C'. Além disso, no PCHi-C, em alguns casos mais de um site de início de transcrição pode ser localizado no mesmo promotor contendo fragmento de restrição, e PIRs em alguns casos abrigam as duas marcas de histona ativo e repressivo, tornando-se difícil identificar que regulamentar elementos de mediam as interações e prever a saída regulamentar das interações do promotor. Usando enzimas de restrição com 4 locais de reconhecimento do bp atenua esta questão, mas vem à custa de muito maior complexidade de biblioteca Hi-C (Hi-C bibliotecas geradas com 4 bp reconhecimento local enzimas de restrição são pelo menos 100 vezes mais complexas do que o Hi-C bibliotecas geradas com 6 bp reconhecimento local enzimas de restrição) e os custos associados para sequenciamento de próxima geração.
Outra limitação é que o atual protocolo PCHi-C requer milhões de células como material, impedindo a análise de interações de promotor em tipos de células raras de partida. Uma versão modificada do PCHi-C para habilitar o interrogatório de contatos de promotor em populações de células com 10.000 a 100.000 células (por exemplo durante o desenvolvimento embrionário precoce ou células-tronco hematopoiéticas), portanto, seria uma adição valiosa à captura Oi-C caixa de ferramentas.
Finalmente, como todos os métodos que se baseiam na fixação de formaldeído, PCHi-C registra apenas as interações que são 'congeladas' no ponto de fixação de tempo. Assim, para estudar a cinética e dinâmica de interações de promotor, são necessários métodos tais como a microscopia de célula viva de super-resolução ao lado PCHi-C.
Métodos para dissecar a organização espacial de cromossomo em alta resolução
A vasta complexidade de bibliotecas cromossômicas interação proíbe a identificação fiável de produtos da interação entre dois fragmentos de restrição específica, com significância estatística. Para contornar este problema, captura de sequência tem sido usada para enriquecer ou Hi-C33,34,40,44 ou 3 C50,51 bibliotecas para interações específicas. A grande vantagem do uso de bibliotecas de bibliotecas mais 3C Hi-C para a etapa de enriquecimento é que Hi-C, ao contrário de 3C, inclui uma etapa de enriquecimento para produtos genuínos da ligadura. Como consequência, a percentagem de leituras válidas em bibliotecas PCHi-C é de aproximadamente 10-fold superior em captura-C bibliotecas50, que continha cerca de 5 – 8% válido lê depois da filtragem de HiCUP. Sahlen et al compararam diretamente captura-C para HiCap, que como PCHi-C utiliza bibliotecas Hi-C para enriquecimento de captura, em contraste com captura-C, que usa bibliotecas C 3. Consistente com nossos achados, encontraram que captura-C bibliotecas são compostas principalmente de fragmentos un-ligados40. Além disso, as bibliotecas HiCap tinham uma complexidade maior do que a captura-C bibliotecas40.
Uma variante de captura-C, chamado geração captura-C52 NG captura-C usa um oligo por fim do fragmento de restrição, como estabelecido anteriormente em33,PCHi-C34, em vez de sobreposição de sondas utilizadas no original Protocolo de captura-C50. Isso aumenta a porcentagem de leituras válidas em relação ao captura-C modestamente, mas NG captura-C emprega duas rodadas sequenciais de enriquecimento de captura, e os ciclos de um número relativamente elevado de PCR (ciclos de 20 a 24 no total, em comparação com 11 ciclos normalmente para PCHi-C), que inevitavelmente resulta em números mais altos de duplicatas de sequência e baixa complexidade de biblioteca. Em julgamento experiências durante a otimização do PCHi-C, verificou-se que a percentagem de exclusivo (ou seja, não duplicado) ler pares rondou apenas 15% quando usamos 19 ciclos PCR (13 ciclos pre-capture + 6 ciclos pós-captura; dados não mostrados), no entanto otimização para um menor número de ciclos PCR, normalmente produz 75-90% pares leitura únicas. Assim, reduzir substancialmente o número de ciclos de PCR aumenta a quantidade de dados da sequência informativa.
Um recente método combina ChIP com Hi-C para focar cromossômicas interações mediadas por uma proteína específica de interesse (HiChIP53). Em comparação com ChIA-PET54, que é baseado em uma lógica semelhante, HiChIP dados contém um número maior de leituras de sequência informativa, permitindo a interação de maior confiança, chamando53. Será muito interessante comparar diretamente o correspondente HiChIP e conjuntos de dados Hi-C capturar uma vez eles se tornam disponíveis (por exemplo, usando um anticorpo contra a Smc1a de unidade de cohesin de HiChIP53 com captura Hi-C para todos os Smc1a vinculado a restrição fragmentos) lado a lado. Uma diferença inerente entre essas duas abordagens é que capturar Hi-C não depende da imunoprecipitação da cromatina e, portanto, é capaz de interrogar cromossômicas interações independentemente da ocupação de proteína. Isso permite a comparação de organização do genoma 3D na presença ou ausência de ligação do fator específico, como tem sido usado para identificar o PRC1 como um regulador chave do mouse ESC genoma espacial arquitetura7.
PCHi-C e GWAS
Estudos de associação de genoma-larga (GWAS) revelaram que maior que 95% das doenças associadas variantes de sequência estão localizadas em regiões não-codificantes do genoma, muitas vezes a grandes distâncias de genes codificantes de proteínas55. Variantes GWAS são frequentemente encontrados em estreita proximidade com DNase I sites hipersensíveis, que é uma marca registrada de sequências com potencial actividade regulamentar. PCHi-C e capturar Hi-C têm sido amplamente utilizados para vincular os promotores a loci de risco GWAS implicados no câncer de mama44, câncer colorretal48e doença auto-imune35,,45,46. Um PCHi-C estudar em 17 diferentes humana células hematopoiéticas tipos encontrados SNPs associadas à doença auto-imune foram enriquecidos em PIRs em células linfoides, Considerando que variantes de sequência associadas com traços específicos de plaquetas e glóbulos vermelhos foram encontradas predominantemente em os macrófagos e eritroblastos, respectivamente de35,56. Assim, promotor específico tipo de tecido, interactomes descoberto pelo PCHi-C pode ajudar a entender a função do não-codificantes associada a doença variantes de sequências e identificar novos genes de doença potencial para intervenção terapêutica.
Características das regiões do promotor-interagindo
Várias linhas de evidência link promotor interactomes para controle de expressão do gene. Primeiro, vários estudos PCHi-C demonstraram que regiões genômicas, interagindo com os promotores de genes expressos (altamente) são enriquecidas em marcas associadas com atividade potenciador, como H3K27 acetilação e p300 vinculação33,34 , 37. encontramos uma correlação positiva entre o nível de expressão do gene e o número de realçadores interagindo, sugerindo que os efeitos aditivos de resultado de realçadores na expressão aumentada do gene níveis34,35. Em segundo lugar, de ocorrência natural expressão loci característica quantitativa (eQTLs) é enriquecidos em PIRs que estão conectados para os mesmos genes cuja expressão é afetado pelo eQTLs35. Em terceiro lugar, integrando viagem57 e dados PCHi-C, Cairns et al encontraram que viagem repórter genes mapeamento para PIRs em rato CES mostram repórter mais forte expressão do gene do que genes repórter em locais de integração em regiões não-promotor-interagindo 58, indicando que o PIRs possuem actividade regulamentar transcriptional. Juntos, estes achados sugerem que o promotor interactomes descobertos pelo PCHi-C em vários mouse e tipos de células humanas incluem chaves reguladoras módulos para controle de expressão de gene.
É interessante notar que os realçadores representam apenas uma pequena fração (~ 20%) de todos os PIRs descobertos por PCHi-C33,34. Outros PIRs poderiam ter funções estruturais ou topológicas ao invés de funções reguladoras transcriptional diretas. No entanto, há também evidências que PCHi-C pode descobrir elementos de DNA com função reguladora que não abriga marcas potenciador clássica. Em uma linhagem de células linfoides humana, o promotor de BRD7 foi encontrado para interagir com uma região desprovida de marcas de potenciador que foi demonstrada possuir atividade potenciador de ensaios de gene repórter33. Elementos reguladores com características semelhantes podem ser mais abundantes do que atualmente apreciada. Por exemplo, uma tela baseada em CRISPR para regulamentar DNA elementos identificados não marcadas elementos reguladores (UREs) que controlam a expressão gênica, mas são desprovidas de potenciador marca59.
Em outros casos, PIRs foram mostrados para marcas de cromatina associadas com repressão transcriptional do porto. PIRs e promotores interagindo vinculados pelo PRC1 no rato CES estavam envolvidos em uma extensa rede espacial dos genes reprimidos tendo que o repressivo marca H3K27me37. Em células humanas lymphoblastoid, um elemento distante interagindo com o promotor BCL6 reprimida transgene repórter gene expressão33, sugerindo que ele pode funcionar para repress a transcrição BCL6 em seu contexto nativo.
PIRs enriquecidos para ocupação da proteína do isolador de cromatina CTCF humana CES e CNE37 pode representar ainda outra classe de PIRs. Coletivamente, estes resultados sugerem que o PIRs abrigam uma coleção de atividades reguladoras do gene ainda para ser funcionalmente caracterizada.

Acumular evidência sugere que a organização tridimensional do genoma desempenha um papel funcional importante em uma variedade de processos nucleares, incluindo gene ativação1,2,3, repressão4 ,5,6,7,8, recombinação9,10, reparação de DNA11, DNA replicação12,13, e senescência celular14. Potenciadores de distantes encontram-se em estreita proximidade espacial com os promotores regulam15,16,17, que é essencial para o controle da expressão de gene espácio-temporal adequada. Exclusões de potenciador mostram que potenciadores distais são essenciais para alvo gene transcrição18,19,20,21,22e 'forçado a cromatina loop' demonstra que amarrar projetado entre um intensificador e seu promotor alvo no locus do Hbb é suficiente para conduzir a ativação transcricional23. Além disso, rearranjos do genoma que trazem genes sob o controle de potenciadores de uma gravidez ectópica podem resultar na ativação do gene inapropriado e doença24,25,26. Juntos, estes exemplos ilustram que atrapalha-promotor interações são essenciais para o controle do gene e exigem o Regulamento apertado para garantir a expressão do gene apropriado. O ser humano e genomas do mouse cada estima-se que abrigam potenciadores de ao redor 1 milhão. Para a maioria destes potenciadores, genes-alvo são desconhecidos, e as 'regras' entre promotores e realçadores são mal compreendidas. Atribuir transcriptional potenciadores de seus genes-alvo, portanto, permanece um grande desafio em decifrar controle de expressão de genes de mamíferos.
Nossa compreensão da arquitetura do genoma tridimensional foi revolucionada pela introdução de 3C27 (captura de conformação do cromossomo) e suas variantes28,29,30,31 . A mais poderosa destas técnicas, Hi-C (captura de conformação de cromossomo alto throughput) é projetada para identificar todo o conjunto de interações cromossômicas dentro de uma população celular. Oi-C bibliotecas, geralmente geradas a partir de milhões de células, são altamente complexas, com um estimado 1011 produtos independente da ligadura entre fragmentos de ~ 4 kb no genoma humano32. Como consequência, reprodutível e confiável identificação das interações entre restrição individual de fragmentos (tais como aqueles que contêm um promotor ou potenciador) de dados Hi-C não são viáveis a menos Hi-C bibliotecas são submetidas a sequenciamento ultraprofundas, que não é uma solução economicamente viável para os laboratórios preparando Hi-C bibliotecas rotineiramente. Para contornar esta lacuna, nós desenvolvemos o promotor capturar Hi-C para enriquecer especificamente promotor-contendo produtos de ligadura de bibliotecas Hi-C. Enfocamos os promotores por duas razões. Primeiro, contatos atrapalha-promotor foram mostrados para ser crucial para os níveis de expressão de gene apropriado em numerosos estudos (ver referências acima), e em segundo lugar, como promotores são em grande parte invariável entre tipos de células, o mesmo sistema de captura de isca pode ser usado para interrogar o circuito regulador em vários tipos de células e condições. Nossa abordagem baseia-se na solução de hibridização das bibliotecas Hi-C com dezenas de milhares de 120mers biotinilado RNA complementar ao promotor-contendo produtos de ligadura Hi-C e subsequente captura em grânulos magnéticos streptavidin-revestido. Isso resulta em bibliotecas PCHi-C, com muito menor complexidade comparada à biblioteca de Hi-C original, focando apenas a identificação de fragmentos que são ligados para promotores em significativamente altas frequências.
Nós usamos PCHi-C em um número de humanos e tipos de células de rato para contribuir para uma melhor compreensão do controle de expressão do gene por descobrindo regiões de interação promotora distal de longo alcance com função reguladora putativa, bem como não-aleatória contatos do promotor-promotor no espaço tridimensional do núcleo. Os estudos mapeou centenas de milhares de contatos atrapalha-promotor através de numerosas células tipos33,34,35,36,37,38, 39, identificado organização mediada por Polycomb repressivo complexo espacial do genoma em células-tronco embrionárias de rato7, demonstrada em larga escala a religação do promotor interactomes durante a diferenciação celular37, 38 , 39e vinculados não-codificantes associada a doença de sequências variantes de genes promotores35.
PCHi-C é um método ideal para mapear o genoma-largo conjunto de sequências de DNA, interagindo com os promotores. Abordagens relacionadas, tais como capturar Hi-C de contínuas regiões genômicas (ver discussão) são o método de escolha para obter perfis de interação de alta resolução para regiões genômicas selecionadas. PCHi-C e Hi-C capturar são extremamente semelhantes do experimental ponto de vista (a única diferença é a escolha do sistema de captura), para que os conselhos e orientações que nós fornecemos são aplicáveis a ambas as abordagens. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada do PCHi-C. Podemos delinear a lógica e o projeto de um experimento de PCHi-C, fornecer um protocolo de geração de biblioteca PCHi-C passo a passo e ilustrar como a qualidade das bibliotecas PCHi-C pode ser monitorizada em várias etapas no protocolo para produzir dados de alta qualidade.

<table><tbody><tr><td>Solução de paraformaldeído a 16% (vol/vol)</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS) filtrado estéril</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de filtro de baixa retenção</td><td>Starlab</td><td>S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 e S1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau de biologia molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl&nbsp;</td><td>Coquetel</td> de inibidores de protease <td>Life Technologies 24740-011</td><td></td></tr><tr><td>(sem EDTA)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de restrição 2 (10x NEBuffer 2)</td>Tubo LoBind de DNA <td>B7002</td><td></td> <td>da New England Biolabs</td></tr><tr><td>, 1.5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td></td></tr><tr><td>Tubo DNA LoBind, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>20% (wt/vol) SDS&nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>20% (vol/vol) Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HindIII, 100 U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18253-013</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>Life Technologies</td><td>18254-011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18255-018</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mM Biotina-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerase I grande (Klenow) fragmento 5000 unidades/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase reaction buffer&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>100x 10mg/ml Albumina de Soro Bovino&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase, 1 U/&mu; L&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinante, grau PCR&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>20 000 vezes; g tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>VWR</td><td>525-0156</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fenol pH 8.0&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Clorofórmio: Álcool Isoamílico 25:24:1&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio pH 5.2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen&nbsp;</td>Kit de Extração de Gel <td>QIAquick Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Purificação PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de restrição 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202</td><td></td></tr><tr><td>NheI, 100U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131</td><td></td></tr><tr><td>Micro TUBE AFA Fiber Pré-fenda tampa de pressão 6x16mm frascos& nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>Para</td></tr><tr><td>contas de sonicação SPRI (Agencourt AMPure XP)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dATP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18252-015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerase 3000 unidades/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 10000 unidades/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo menos 5000 unidades/mL&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de reação de ligação rápida&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B6058</td><td></td></tr><tr><td>NEB DNA Ligase rápida&nbsp;</td>Adaptador PE <td>M2200</td><td></td> <td>da New England Biolabs</td></tr><tr><td>1.0 (5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC AGGAATGCCGAG-3')</td><td>Adaptador PE Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.0 (5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3')</td><td>Kit de PCR de Diagnóstico de Iluminação NEB Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PE PCR primer 1.0 (5'-AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE PCR primer 2.0 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GATCGGTCTCGGCATTCCT GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3')&nbsp;</td><td>Tiras de PCR Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>410022 e 401425</td><td></td></tr><tr><td>Kit de adaptador completo SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE&nbsp;</td><td>A Agilent Technologies</td><td>931108</td><td></td></tr><tr><td>a biblioteca personalizada SureSelect de 3 a 5,9 Mb</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-4831</td><td>mouse de design personalizado ou sistema PCHi-C humano</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>E220: ultra-sonicador focado de alto desempenho</td><td>Corvaris</td><td>E220</td><td></td></tr></tbody></table>

promotor captura oi-c: alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

A organização tridimensional do genoma está ligada à sua função. Por exemplo, elementos reguladores tais como potenciadores transcriptional controlam a expressão espaço-temporal dos seus genes alvo através do contato físico, muitas vezes ponte genômica distâncias consideráveis (em alguns casos centenas de kilobases) e ignorando genes nas proximidades. O genoma humano abriga uma potenciadores de 1 milhão estimado, a grande maioria dos quais têm desconhecido alvos de gene. Atribuição de regiões reguladoras distais para seus genes-alvo, portanto, é crucial entender controle de expressão do gene. Nós desenvolvemos o promotor capturar Hi-C (PCHi-C) para permitir a detecção de todo o genoma de regiões de promotor-interagindo distais (PIRs), para todos os promotores em uma única experiência. No PCHi-C, altamente complexo Hi-C bibliotecas especificamente são enriquecidas para sequências de promotor através de seleção em solução híbrida com milhares de iscas biotinilado RNA complementares até o fim de todos os fragmentos de restrição que contêm promotor. O objectivo é então suspenso promotor sequências e seus parceiros de interacção frequente como potenciadores e outros elementos reguladores potenciais. Após o sequenciamento de emparelhado-fim do elevado-throughput, um teste estatístico é aplicado para cada fragmento de restrição promotor-ligados para identificar PIRs significativos no nível de fragmento de restrição. Nós usamos PCHi-C para gerar um atlas de interações de longo alcance promotor em dezenas de humanos e tipos de células de rato. Estes mapas de interactome promotor têm contribuído para uma maior compreensão do controle da expressão de gene mamíferos atribuindo putativos regiões reguladoras de seus genes-alvo e revelando as redes de interação espacial preferencial do promotor-promotor. Esta informação também tem alta relevância para a compreensão de doenças genéticas humanas e a identificação de potenciais genes de doença, vinculando não-codificantes associada a doença sequenciar variantes em ou perto de sequências de controle para seus genes-alvo.

Promotor de capturar Hi-C tem sido usada para enriquecer o rato7,34,36,39 e humano33,35,37,38 Hi-C bibliotecas para interações do promotor. Um protocolo semelhante (chamado HiCap) tem sido descrito por Sandberg grupo40. A figura 1A mostra o fluxo de trabalho esquemático para promotor capturar Hi-C. No protocolo descrito aqui, Hi-C bibliotecas são geradas usando a ligadura no núcleo41, que resulta em um número significativamente reduzido de ligadura espúrias produtos42. Para PCHi-C, mouse altamente complexo ou bibliotecas de Hi-C humanas estão sujeitos a na solução de hibridização e capturar usando 39.021 biotinilado RNAs complementares para 22.225 rato contendo promotor HindIII fragmentos da limitação ou 37.608 biotinilado RNAs segmentação 22.076 humano contendo promotor HindIII fragmentos da limitação, respectivamente. Promotor, contendo fragmentos de restrição pode ser direcionado em uma ou ambas as extremidades por individual biotinilado RNAs (figura 1B). Nós achamos que a captura de ambos termina melhorada a cobertura de cada um dos promotores (Figura 1; sequência primas leituras) quase duas vezes, como esperado. Assim, sempre que possível (ou seja, nas regiões não repetitivas), aconselhamos usar biotinilado RNAs complementares para ambas as extremidades de um fragmento de restrição para ser capturado.
Para avaliar a qualidade de biblioteca PCHi-C na fase inicial durante a preparação da biblioteca, realizamos dois controles após ligadura do ADN e purificação, como descrito anteriormente,31. A primeira é usar pares específicos da primeira demão para amplificar produtos ligadura como 3C27. Nós usamos pares da primeira demão (tabela 1) para amplificar produtos de invariável da ligadura de longo alcance do tipo de célula, tal como entre o gene Myc e seus conhecidos potenciadores localizado aproximadamente 2MB distância (Figura 2A) ou entre genes do Hist1 locus ( separados por 1,5 Mb) e entre duas regiões situadas nas proximidades linear (controle de curto alcance).
O segundo controle de qualidade é realizado para determinar a eficiência da incorporação de biotina durante o preenchimento de Klenow-mediada da restrição local saliências com biotina-dATP. Preenchimento de Klenow sucesso e resultados subsequentes sem corte-extremidade de ligadura no desaparecimento do site original restrição entre as moléculas de DNA de um produto de ligadura e no caso de HindIII na formação de um novo site de reconhecimento NheI (Figura 2B ). A relação entre o HindIII NheI produto de ligadura digerido é uma leitura direta da eficiência de incorporação de biotina. Uma biblioteca de Hi-C de má qualidade vai mostrar um elevado nível de digestão HindIII, Considerando que qualidade de bibliotecas têm quase completa NheI digestão dos produtos da ligadura (Figura 2B).
Após a preparação de biblioteca de Hi-C (ou seja, depois de estreptavidina-biotina puxar para baixo de produtos de ligadura Hi-C tamanho selecionados, ligadura de adaptador e pre-captura PCR), a distribuição de tamanho e integridade da biblioteca Hi-C é avaliada pelo Bioanalyzer (Figura 2 C). O mesmo controle é realizado no final da preparação de biblioteca PCHi-C (ou seja, após a captura de hibridação do promotor-contendo produtos de ligadura e pós-captura PCR). Comparação dos perfis Hi-C e PCHi-C Bioanalyzer mostra que, como esperado, bibliotecas Hi-C são muito mais concentradas do que as bibliotecas PCHi-C correspondentes, mas a distribuição de tamanho das bibliotecas é altamente similar, indicando que a captura de intervir PCHi-C não introduz um viés de tamanho (Figura 2, D).
Após o sequenciamento de ponta emparelhado, o lê PCHi-C é mapeado, qualidade controlada e filtrada usando o pipeline de HiCUP43. Alta qualidade PCHi-C bibliotecas contêm entre 70-90% 'válido pares' (ou seja, emparelhado-sequência de leituras entre dois fragmentos de restrição que não são vizinhas no mapa genoma linear; Figura 3A, B). Usando a ligadura no núcleo protocolo41,42, a percentagem de trans ler pares (i.e., emparelhado-sequência de leituras entre dois fragmentos de restrição que estão localizados em diferentes cromossomos) são geralmente baixos, entre 5 e 25%, refletindo a existência de territórios cromossómicos e indicando a qualidade de boa biblioteca. Comparação direta da percentagem de 'pares válidos' entre bibliotecas Hi-C e seus correspondentes PCHi-C bibliotecas35, mostra que em todos os casos, a porcentagem de pares válidos é maior nas bibliotecas PCHi-C (Figura 3B). Isto é acompanhado por uma redução da percentagem de leituras não válido 'mesmo fragmento interno' em PCHi-C (Figura 3). Isso é esperado, como a etapa de captura não só enriquece para promotor-contendo produtos de ligadura, mas também para fins de fragmento de restrição, devido a posição da captura de oligos relativa à restrição de fragmentos (ver figura 1B).
Após a filtragem de HiCUP, podemos determinar a eficiência de captura. PCHi-C bibliotecas contêm três tipos de leituras de sequência válida após filtragem de HiCUP: 1.) promotor: genoma lê (ou seja, leituras entre um fragmento de promotor capturados e um fragmento de restrição HindIII não-promotor em qualquer lugar no genoma) 2.) promotor: promotor lê (leituras entre dois fragmentos capturados promotor) 3.) genoma: genoma lê (produtos de ligadura de fundo Hi-C onde nenhum dos parceiros da ligadura produto mapeia para um promotor capturado). Estas são descartadas antes da análise a jusante.
Alta qualidade PCHi-C bibliotecas têm eficiências de captura (soma das categorias 1 e 2 acima) entre 65-90% (Figura 3D). Uma comparação direta com bibliotecas Hi-C mostra que PCHi-C resulta em uma ~ 15-fold enriquecimento para promotor-produtos que contenham ligadura (Figura 3D), em alguns casos 17-fold. Isso é perto o hipotético máximo (19.6-fold) enriquecimento para PCHi-C, que depende da percentagem de fragmentos de restrição do genoma abrangidas pelo sistema de captura. Maior enriquecimento pode ser alcançado através da concepção de sistemas de captura direcionamento menos restrição fragmentos44,,45,46.
Análise do promotor interactomes demonstra a célula tipo e especificidade linhagem33,34,35, com alterações pronunciadas durante a diferenciação celular37,38,39 . Figuras 4 e 5 mostram exemplos de dinâmica de especificidade e diferenciação de linhagem em promotores específicos. Por exemplo, ALAD é constitutivamente expressa em todas as células, mas a sua expressão é upregulated em eritroblastos47. O promotor ALAD entra em contato com vários fragmentos distais em todas as células hematopoiéticas e se engaja em interações adicionais especificamente em eritroblastos (Figura 4). IL-8 mostra interações não estatisticamente significantes em células B, poucas interações em células T, mas dezenas de interações em células da linhagem mieloide, incluindo interações específicas do tipo de célula em (monócitos, neutrófilos e megacariócitos A Figura 5). Estes exemplos demonstram como PCHi-C pode ser usado para desvendar o tipo de célula específica interactomes e identificar regiões promotor-interagindo com potencial regulamentar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig1.jpg"> Figura 1 : Promotor capturar Hi-C lógica e captura de isca design. (A) fluxo de trabalho esquemático do PCHi-C. Ligadura em núcleo Hi-C41,42 (I) é seguida na solução de hibridização com iscas biotinilado RNA (II) visando os fragmentos de restrição de humanos (retratado aqui) ou (III) de promotores de genes de rato. (B) projeto de isca para PCHi-C. Iscas de captura de RNA biotinilado (vermelhas linhas curvas) destinam-se contra as extremidades do promotor, contendo fragmentos de restrição (cinza; note que as sequências de promotor se (vermelho) só são alvo de iscas de captura o RNA se eles estão localizados em restrição fragmento de extremidades). Produtos de ligadura consistindo de promotor contendo fragmentos da limitação (cinzento) e suas interação fragmentos de restrição (amarelo e verde) são isoladas através de hibridação de sequência-complementaridade entre isca de RNA e DNA alvo e subsequentes estreptavidina-biotina pulldown, conforme mostrado na eficiência de captura a. (C) comparação de PCHi-C para promotor, contendo fragmentos de restrição alvo de um RNA isca captura sonda vs duas sondas de captura de isca de RNA (ver esquema em B). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig2.jpg"> Figura 2 : Controles de qualidade pré-sequenciamento PCHi-C. (A) deixou, esquemático da justaposição espacial entre o promotor e o PIR, resultando em um produto de ligadura de Hi-C consiste de um fragmento de restrição contendo promotor (cinza; sequência de promotor em vermelho) e um fragmento de restrição de PIR (amarelo). Certo, DNA gel de electroforese, mostrando exemplos de produtos de Hi-C ligadura amplificados usando pares da primeira demão específicas (como descrito no esquema da esquerda). (B) à esquerda, exemplos representativos de restrição HindIII, NheI e HindIII/NheI digere de produtos de ligadura Hi-C (produtos PCR apresentados na). Bem, esquema de DNA sequência após ligadura da Hi-C após vencida (topo) ou sucesso (parte inferior) do dNTP Klenow de preenchimento de junções de restrição e posterior ligadura. (C) representante Hi-C biblioteca bioanalyzer perfil (diluição de 1/5). (D) representante PCHi-biblioteca bioanalyzer perfil C (sem diluição). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig3.jpg"> Figura 3 : PCHi-C pós-sequenciamento controles de qualidade. (A) comparação de percentual válido sequência ler pares após HiCUP43 processamento no PCHi-C vs correspondente bibliotecas Hi-C (dados de Javierre et al, 201635). (B) o representante HiCUP PCHi-C resultado mostrando válido ler pares e outras categorias de sequência que são descartadas antes da análise a jusante (dados de Javierre et al, 201635). (C) comparação de percentual 'mesmo fragmento interno' lê depois HiCUP processamento no PCHi-C vs correspondente bibliotecas Hi-C (dados de Javierre et al, 201635). (D) a comparação de sequência de porcentagem lê envolvendo fragmentos de anzóis promotor (eficiência de captura) no PCHi-C vs correspondente bibliotecas Hi-C (dados de Javierre et al, 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig4.jpg"> Figura 4: ALAD perfil PCHi-C em células hematopoiéticas humanas. Interações promotor de tipos de células mieloides são mostradas como arcos azuis e interações promotor de tipos de células linfoides são mostradas como arcos roxos. Interações específicas eritroblasto são indicadas por setas vermelhas (dados de Javierre et al, 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig5.jpg"> Figura 5 : IL8 Perfil PCHi-C em células hematopoiéticas humanas. Interações promotor de tipos de células mieloides são mostradas como arcos azuis e interações promotor de tipos de células linfoides são mostradas como arcos roxos. Interações específicas de monócitos são indicadas pelas setas verdes, interações específicas de neutrófilos são indicadas por setas vermelhas e uma interação específica megacariócito é indicada por uma seta marrom (dados de Javierre et al, 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="9">Humana</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td colspan="3">Sequência de</td>
			<td>Cromossomo</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Iniciar GRCh38/hg38</td>
			<td>Final GRCh38/hg38</td>
			<td>Combinações de cartilha para testar interações 3C e incorporação de biotina</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF64 Dekker</td>
			<td colspan="3">GCATGCATTAGCCTCTGCTGTTCTCTGAAATC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116803960</td>
			<td>116803991</td>
			<td>usar em combinação com hs AHF66 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF66 Dekker</td>
			<td colspan="3">CTGTCCAAGTACATTCCTGTTCACAAACCC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116810219</td>
			<td>116810248</td>
			<td>usar em combinação com hs AHF64 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>locus MYC HS</td>
			<td colspan="3">GGAGAACCGGTAATGGCAAA</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127733814</td>
			<td>127733833</td>
			<td>uso em combinação com hs MYC +1820 ou hs MYC-538</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC +1820</td>
			<td colspan="3">AAAATGCCCATTTCCTTCTCC</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>129554527</td>
			<td>129554547</td>
			<td>usar em combinação com o locus MYC hs</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC-538</td>
			<td colspan="3">TGCCTGATGGATAGTGCTTTC</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127195696</td>
			<td>127195716</td>
			<td>usar em combinação com o locus MYC hs</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 F</td>
			<td colspan="3">AAGCAGGAAAAGGCATAGCA</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>26207174</td>
			<td>26207193</td>
			<td>usar em combinação com hs HIST1 R</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 R</td>
			<td colspan="3">TCTTGGGTTGTGGGACTTTC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>27771575</td>
			<td>27771594</td>
			<td>usar em combinação com hs F HIST1</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="9">Mouse</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Sequência de</td>
			<td>Cromossomo</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Iniciar GRCm38/mm10</td>
			<td>Final GRCm38/mm10</td>
			<td>Combinações de cartilha para testar interações 3C e incorporação de biotina</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TCATGAGTTCCCCACATCTTTG</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84841090</td>
			<td>84841111</td>
			<td>usar em combinação com mm Calr2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CTGTGGGCACCAGATGTGTAAAT</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84848519</td>
			<td>84848541</td>
			<td>usar em combinação com mm Calr1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TATCAAGGGTGCCCGTCACCTTCAGC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163098</td>
			<td>125163123</td>
			<td>usar em combinação com Gapdh4 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGCTTTTATAGCACGGTTATAAAGT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163774</td>
			<td>125163799</td>
			<td>usar em combinação com Gapdh3 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGAGGAGGGAAAAGGAGTGATT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>52212829</td>
			<td>52212850</td>
			<td>usar em combinação com mm Hoxa13</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CAGGCATTATTTGCTGAGAACG</td>
			<td>6</td>
			<td>-</td>
			<td>52253490</td>
			<td>52253511</td>
			<td>usar em combinação com mm Hoxa7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTAATGGTGTCACTAACTGG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23571284</td>
			<td>23571305</td>
			<td>usar em combinação com Hist1h3e ou mm Hist1h4i</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTTTGATGAGTTGGTGAAG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23566541</td>
			<td>23566561</td>
			<td>usar em combinação com mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TTGGGCCAAAGCCTATATGA</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>22043085</td>
			<td>22043104</td>
			<td>usar em combinação com mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Sequências de Primer para controle de qualidade de humanos e bibliotecas de rato Hi-C.

Elementos reguladores de DNA, como potenciadores, controlam a expressão gênica fisicamente contactando promotores de genes alvo, muitas vezes através de interações cromossômicas de longo alcance, abrangendo grandes distâncias genômicas. Promotor de capturar Hi-C (PCHi-C) identifica interações significativas entre promotores e regiões distais, permitindo a atribuição de potenciais sequências reguladoras de seus genes-alvo.

Promotor captura Oi-c: Alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Uma vez que os elementos regulatórios, como os intensificadores transcricionais, podem estar localizados a grandes distâncias genômicas de seus genes-alvo, que eles regulam por meio de interações cromossômicas de longo alcance, o objetivo do Promoter Capture Hi-C é vincular os elementos reguladores do gene aos seus genes-alvo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da estrutura e função do genoma, como a forma como a arquitetura tridimensional de um genoma afeta o controle da expressão gênica. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a detecção de interações significativas do promotor, uma única restrição da solução.As implicações dessa técnica se estendem à terapia porque ela pode vincular variantes de sequência associativa de doenças não codificantes em ou próximas a sequências de controle regulatório a seus genes-alvo. Comece com um mínimo de 20 milhões de células por experimento. Para células em suspensão, colete e centrifugue células a 400 vezes g e 20 graus Celsius por três minutos.Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 30,625 mililitros de meio com 10% de FBS à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 4.375 mililitros de paraformaldeído sem metanol a 16% até uma concentração final de 2%Fixe as células por 10 minutos em temperatura ambiente com uma mistura suave em um balancim. Sacie a reação adicionando 5 mililitros de glicina gelada molar recém-preparada.Misture por cinco minutos com um balanço suave em temperatura ambiente. Em seguida, incube no gelo por 15 minutos com inversão ocasional. Em seguida, centrifugue as células em suspensão a 760 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 50 mililitros de PBS gelado pH 7,4. Por fim, centrifugue as células a 400 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante. Após a lise celular, conforme descrito no protocolo de texto, lave os núcleos celulares com tampão de restrição 1,25x 2.Para fazer isso, ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão gelado e transfira os núcleos ressuspensos para um tubo de 1,5 mililitro. Gire os núcleos a 760 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos antes de remover o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 1790 microlitros de tampão de restrição 1,25x 2.Em seguida, divida a suspensão em cinco alíquotas, cada uma contendo cinco a 10 milhões de núcleos celulares em 358 microlitros. Adicione 11 microlitros de 10% de peso por volume SDS por alíquota e agite a 950 rotações por minuto por 30 minutos a 37 graus Celsius em um termomixer. Se aparecerem aglomerados de células, dissocie-os pipetando, evitando fazer bolhas.Em seguida, adicione 75 microlitros de 10% Triton X-100 por alíquota e agite a 950 rpm e 37 graus Celsius por 15 minutos em um termomixer. Adicione 12 microlitros de 100 unidades por microlitro de HindIII por alíquota. Incube a 37 graus Celsius durante a noite enquanto agita a 950 rpm em um termomixer.Após a digestão, realize PCR quantitativo conforme detalhado no protocolo de texto. Em seguida, adicione 60 microlitros de mistura mestre de biotinilação por alíquota e misture. Incubar as alíquotas a 37 graus Celsius por uma hora, agitando a 700 rpm por cinco segundos a cada 30 segundos.Após uma hora, coloque as alíquotas no gelo. Execute a biblioteca Hi-C conforme detalhado no protocolo de texto. Transferir entre 500 nanogramas e um micrograma da biblioteca Hi-C para um novo tubo e, em seguida, evaporar a amostra num concentrador de vácuo até secar.Ressuspenda a biblioteca Hi-C evaporada adicionando 3,6 microlitros de água de grau de biologia molecular, 2,5 microlitros de bloqueador 1, 2,5 microlitros de bloqueador 2 e 0,6 microlitros de bloqueador personalizado. Transfira a amostra para um poço de uma nova tira de tubo de PCR, feche-a com a tira de tampa de PCR e coloque a amostra no gelo. Rotule o poço como D para DNA Hi-C.Prepare o buffer de hibridização conforme descrito no protocolo de texto. Incube o tampão a 65 graus Celsius por cinco minutos em um termomixer. Transfira o tampão para um poço de uma nova tira de tubo de PCR, feche-o com a tira de tampa de PCR e mantenha em temperatura ambiente.Rotule o poço como H para buffer de hibridização. Em um poço de uma nova tira de tubo de PCR, misture cinco microlitros de 100 nanogramas por microlitro de sondas de RNA biotiniladas, 0,5 microlitros de inibidor de RNase SRNase B e 1,5 microlitros de água de grau de biologia molecular. Feche a tira do tubo PCR com uma tira de tampa PCR e coloque no gelo.Rotule o tubo como R para RNA. Configure a máquina de PCR conforme detalhado no protocolo de texto. Proceda o mais rápido possível durante todos os procedimentos enquanto a máquina de PCR estiver funcionando para evitar a evaporação da amostra.Coloque a tira de tubo de PCR D na máquina de PCR, feche a tampa da máquina de PCR e inicie a reação de PCR. Quando o programa de PCR atingir 65 graus Celsius, abra a tampa da máquina de PCR e coloque a tira de tubo H PCR na máquina de PCR. Feche a tampa da máquina de PCR e incube por três minutos.Em seguida, abra a tampa da máquina de PCR, coloque a tira de tubo de PCR R na máquina de PCR e feche a máquina de PCR. Após dois minutos, abra a tampa da máquina de PCR e todas as tiras de tubos de PCR. Transfira 13 microlitros do poço H para o poço R e, em seguida, todo o volume do poço D para o poço R.Pipet para cima e para baixo três vezes para misturar a reação e fechar a tira do tubo de PCR.Remova as tiras de tubo de PCR H e D e feche a tampa da máquina de PCR. Incube a reação a 65 graus Celsius por 24 horas. Adicione 60 microlitros de esferas magnéticas acopladas a estreptavidina em um novo tubo.Coloque o tubo no suporte de separação magnética por um minuto antes de remover o sobrenadante. Ressuspenda os grânulos com 200 microlitros de 1x tampão de ligação e gire por três minutos em temperatura ambiente e 15 rpm em uma roda giratória. Gire suavemente o tubo em uma centrífuga de bancada por dois a três segundos para coletar a amostra.Depois de colocar o tubo no suporte de separação magnética por três minutos, remova o sobrenadante. Repita esta lavagem duas vezes. Em seguida, ressuspenda os grânulos em 200 microlitros de 1x tampão de ligação.Abra a máquina de PCR e a tira de tubo de PCR enquanto o programa de PCR ainda está em execução e transfira a reação de hibridização para o tubo com as esferas magnéticas. Incubar a reação e os grânulos à temperatura ambiente durante 30 minutos numa roda rotativa a três rpm. Recupere as contas no suporte de separação magnética e remova o sobrenadante transparente.Depois de ressuspender os grânulos em 500 microlitros de tampão de lavagem 1, incube a amostra por 15 minutos a 20 graus Celsius enquanto agita a 950 rpm em um termomisturador. Mais uma vez, recupere as contas e remova o sobrenadante claro. Agora suspenda novamente as contas em 500 microlitros de tampão de lavagem 2 e misture.Incube a amostra por 10 minutos a 65 graus Celsius enquanto agita a 950 rpm em um termomixer. Repita esta lavagem com tampão de lavagem 2 mais duas vezes. Em seguida, coloque a amostra no suporte de separação magnética, remova o sobrenadante transparente e ressuspenda os grânulos em 200 microlitros de 1x tampão de restrição 2.Depois de recuperar os grânulos e remover o sobrenadante novamente, ressuspenda os grânulos em 30 microlitros de 1x tampão de restrição 2. Esta figura mostra o perfil de interação Hi-C de captura do promotor para o promotor IL8 em 17 tipos de células hematopoiéticas humanas. As interações do promotor dos tipos de células linfóides são mostradas como arcos roxos e as interrupções do promotor dos tipos de células mieloides são mostradas como arcos azuis.As interações específicas dos monócitos são indicadas por setas verdes, as interações específicas dos neutrófilos são indicadas por setas vermelhas e uma interação específica dos megacariócitos é indicada por uma seta marrom. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar com a maior precisão possível. Não é magia negra, mas é um protocolo demorado, então pequenos erros afetarão negativamente a qualidade dos dados no final.Seguindo este procedimento, outros métodos, como a edição do epigenoma do genomore CRISPR / Cas9, podem ser realizados para interrogar a função biológica das regiões que interagem com o promotor descobertas pelo promotor Capture Hi-C. Depois de assistir a este vídeo, esperamos que você tenha uma boa compreensão de como implementar o promotor Capture Hi-C em seu laboratório.

promoter-capture-hi-c-high-resolution-genome-wide-profiling-promoter

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

O método de Hi-C permite a identificação imparciais, de todo o genoma de interações cromatina (1). Oi-C casais ligadura proximidade e seqüenciamento massivamente paralelo. Os dados resultantes podem ser usados ​​para estudar a arquitetura genômica em múltiplas escalas: resultados iniciais identificadas características como territórios cromossomo, a segregação da cromatina abertas e fechadas, e estrutura da cromatina na escala megabase.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Este é um método para identificar novas proteínas DNA-interagindo em loci de destino específico, baseando-se na captura de sequência-específicos da cromatina de quitosana para análises subsequentes proteomic. Nenhum conhecimento prévio sobre potenciais proteínas obrigatórias, nem modificações de célula são necessários. Inicialmente desenvolvido para o fermento, a tecnologia agora foi adaptada para células de mamíferos.

Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos

A identificação das interações físicas entre genes e dos elementos reguladores é um desafio, mas tem sido facilitada pelos métodos de captura de conformação de cromossomo. Esta modificação no protocolo de 4C-seq atenua o viés PCR, minimizando a amplificação excessiva de modelos PCR e maximiza o mappability de leituras, incorporando um passo de digerir adição da enzima de restrição.

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

Relatamos a aplicação da captura de conformação de cromossomos quantitativos seguida de sequenciamento de alto throughput em corpos embrionários gerados a partir de células-tronco embrionárias. Esta técnica permite identificar e quantificar os contatos entre melhoradores putativos e regiões promotoras de um determinado gene durante a diferenciação de células-tronco embrionárias.

Identificação de contatos intensificadores-promotores em corpos embrionários por captura quantitativa de conformação de cromossomo (4C)

Este protocolo descreve o método Capture Hi-C usado para caracterizar a organização 3D de regiões genômicas alvo de tamanho megabaseado em alta resolução, incluindo limites de domínios topologicamente associados (TADs) e interações de cromatina de longo alcance entre elementos regulatórios e outros elementos de sequência de DNA.

Decifrando a organização da cromatina 3D de alta resolução via captura Hi-C

ATAC-seq é um método de sequenciamento de DNA que usa a transposase mutante hiperativa, Tn5, para mapear mudanças na acessibilidade da cromatina mediadas por fatores de transcrição. O ATAC-seq permite a descoberta dos mecanismos moleculares subjacentes às alterações fenotípicas nas células cancerígenas. Este protocolo descreve procedimentos de otimização para ATAC-seq em tipos de células epiteliais, incluindo células cancerígenas.

Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Apresentamos um fluxo de trabalho sem codificação para que os biólogos identifiquem intensificadores de genes específicos do tecido usando apenas ferramentas baseadas em navegador. Nosso protocolo aproveita marcas públicas de histonas H3K4me1 / H3K27ac e dados Hi-C, permitindo que pesquisadores sem experiência em programação acessem, analisem e identifiquem possíveis elementos regulatórios associados a seus genes de interesse.

Um fluxo de trabalho baseado na web para selecionar intensificadores específicos de genes e tecidos

Este protocolo fornece um pipeline computacional simplificado para quantificar transcritos de intensificadores nascentes. Ao integrar a acessibilidade da cromatina, a característica da cromatina e os dados transcricionais, ele permite a detecção precisa e a análise específica da atividade do intensificador em regiões intragênicas complexas, mantendo-se acessível a pesquisadores sem treinamento extensivo em bioinformática.

Um pipeline computacional para quantificação de RNA intensificador intergênico/intragênico em células-tronco embrionárias de camundongo

Aprenda a técnica Promoter Capture Hi-C para mapear interações cromossômicas de longo alcance entre promotores e elementos reguladores. Este método avança a compreensão da arquitetura tridimensional do genoma e regulação gênica.

Promotor captura Oi-c: Alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor

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