Name: Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a analisar a formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos usando ensaios combinados de adesão, matriz de polissacarídeos e dispersão. Este protocolo permite caracterizar a dinâmica de biofilmes em condições que simulam o trato gastrointestinal.

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Agradecemos a Rachael B. Chanin e Alejandro Llanos-cocho para assistência técnica. Agradecemos a Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski e Bobby Cherayil para as estirpes utilizadas neste estudo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de alergia e K22AI104755 de Grant de doenças infecciosas (serologia). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

1. preparação dos reagentes
<ol><li>Médio de sais biliares: para preparar o caldo tryptic soja (TSB) contendo 0,4% (peso/volume) de sais biliares, resuspenda 200 mg de sais biliares em 50ml TSB autoclavado. Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Fazer meio fresco semanalmente. Notas: Os sais biliares rotineiramente utilizados é uma mistura 1:1 de colato de sódio e sódio Deoxycholate do isolado de vesículas de ovinos e bovinas. Como demonstrado anteriormente4, a presença de glicose foi necessária para a formação de biofilme induzida por sais biliares. TSB tem adicionado glicose em relação ao caldo de Luria-Bertani (LB); e, por conseguinte, foi suficiente para induzir a formação de biofilme em Shigella e outros patógenos entéricos analisados. Dependendo as bactérias a serem analisados, podem ser necessária a concentrações diferentes de glicose ou açúcar diferentes exigências.</li>
	<li>0,5 violeta de cristal % p/v em água: dissolver 2,5 g de cristal violeta em 500 mL de água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm.</li>
	<li>Concanavalina A (ConA) conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC): reconstituir o estoque em 1X PBS. Diluir o estoque de 10 mg de concentrado com 400 μL de 1X PBS a uma concentração final de 25 µ g/mL e proteger da luz.</li>
	<li>PBS + glicose: Dissolver glicose 0,2 g em 10 mL 1X PBS (glicose 2% w/v final). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso.</li>
	<li>PBS + sais biliares: Dissolver 40 mg em 10 mL 1X PBS (0,4% w/v de sais biliares finais). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso.</li>
	<li>PBS + glicose e sais biliares: dissolver 40 mg de sais biliares e glicose 0,2 g em 10 mL 1X PBS (0,4% w/v de sais biliares e 2% p/v glucose final). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso.</li>
	<li>Prepare-se placas de ágar LB.</li>
	<li>Correção de formaldeído/glutaraldeído: 810 adicione formaldeído de µ l (solução-mãe de 37%, 3% de concentração final) e 125 µ l o glutaraldeído (solução estoque de 25%, 0,25% de concentração final) para 14 mL 1X PBS. Misture bem e armazenar a 4 ° C. A correção deve ser fria para o uso adequado. Atenção: A correção é tóxica e requer a eliminação de resíduos perigosos.</li>
	<li>Solução para montagem antidesgaste: usar antidesgaste para montagem solução contendo 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) mancha para inibir fotobranqueamento de amostras de microscopia de imunofluorescência, enquanto o ADN das bactérias de coloração fluorescente.</li>
</ol>2. preparação de bactérias
<ol><li>Cresce durante a noite culturas das cepas bacterianas para ser testado por inocular 3 mL de TSB com uma colônia única, bem isolada em um tubo estéril de cultura. Incube a 37 ° C com agitação a 225 rpm para incubação overnight (16-24 h). Nota: Cepas devem ser restreaked dos estoques de congelador cada 2 a 4 semanas e mantida em placas não mais de 2 semanas de idade.</li>
</ol>3. fase sólida aderência ensaio
Nota: Este teste quantifica bactérias aderentes, usando um método de placa de 96 poços. As bactérias são crescidas estaticamente em placas de fundo plano. Lavar roupa é realizada para remover as bactérias não-aderentes e aderentes bactérias são coradas com violeta de cristal. A mancha de violeta cristal vincula peptidoglicano na parede celular bacteriana e pode ser solubilizada usando etanol. O número de bactérias aderentes é determinado com base na retenção de violeta cristal.
<ol><li>Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + sais biliares (BS).</li>
	<li>Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.</li>
	<li>Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição).</li>
	<li>Em uma placa de 96 poços estéril, clara, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de mídia (TSB e TSB + BS) para ser testado.</li>
	<li>Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado em três poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado.</li>
	<li>Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente.</li>
	<li>Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como 'em branco'. Confirme que o meio de controle é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados se existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias.</li>
	<li>Remova o meio de cultura usando uma linha de vácuo, inclinar suavemente a placa e lentamente por aspiração do meio na borda inferior do poço. Não se esqueça de coletar todos os meio de cultura sem interromper a população bacteriana aderente localizada na superfície de plástico. Se a matriz EPS foi produzido durante o tempo de incubação, a matriz será ser visualizada como um precipitado branco. Não perturbe a matriz EPS.</li>
	<li>Delicadamente lave os poços uma vez com 200 µ l de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo.</li>
	<li>Inverta a placa para secar. Permita um mínimo de 20 min para secar. Nota: Uma vez que o biofilme deve ser secado completamente antes de coloração, o protocolo pode ser pausado neste passo por algumas horas ou até mesmo durante a noite. O tempo de secagem adicionado não irá alterar o procedimento de coloração enquanto Secagem incompleta afetarão a quantificação dos resultados e reprodutibilidade.</li>
	<li>Adicione 150 µ l de violeta de cristal de 0,5% para cada experimental e controle bem.</li>
	<li>Incube durante 5 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lave os poços uma vez com 400 µ l de água destilada. O volume adicionado ajuda a remover a mancha violeta de cristal residual dos lados dos poços. Remova a lavagem com a linha de vácuo.</li>
	<li>Lave os poços cinco vezes com 200 µ l de água destilada. Remova a lavagem com a linha de vácuo. Nota: A lavagem completa é importante para a quantificação. Quando os poços em branco são clara da água destilada e não contêm qualquer mancha residual violeta de cristal, prossiga para a próxima etapa.</li>
	<li>Inverta a placa para seco, protegido da luz. Certifique-se de secagem completa da placa conforme mencionado acima.</li>
	<li>Destain os poços com 200 µ l de etanol a 95%. Incube a placa no agitador por 30 min. Para evitar a evaporação, particularmente em umas mais altas temperaturas, execute esta etapa a 4 ° C.</li>
	<li>Usando um leitor de placas, registo o OD540. Nota: O comprimento de onda de absorbância máxima de violeta cristal está perto de 590 nm. A literatura relata uma faixa de OD540 - OD5954,13,14,15,16 de absorvância de cristal violeta; assim, escolha um comprimento de onda disponível com base no leitor.</li>
</ol>4. deteção de Matrix EPS
Nota: Estes ensaios complementares quantificar e visualizar o EPS. Em ambos, EPS é detectada usando uma lectina vincular polissacarídeos. A proteína fluorescente conjugado permite a quantificação (passo 4.1) ou visualização (etapa 4.2).
<ol><li>Detecção semi-quantitativa de EPS<ol>
<li>Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS.</li>
		<li>Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.</li>
		<li>Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (um 01:50 diluição).</li>
		<li>Em uma placa de 96 poços estéril, preta, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de meio a ser testado. Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado nos poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado.</li>
		<li>Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente.</li>
		<li>Transfira o meio de cultura para uma placa de 96 poços claros com uma pipeta, idealmente uma pipeta multicanal. Seja cauteloso para coletar todo o meio de cultura sem interromper a população aderente e/ou o EPS localizado na superfície de plástico. Posta de lado.</li>
		<li>Fixe a placa preta para 15 min RT usando 200 µ l/poço do formaldeído/glutaraldeído em 1X PBS.</li>
		<li>Enquanto a população aderente é fixação, avalie a fração sobrenadante da etapa 4.1.6. Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como 'em branco'. Confirme que o meio de controle é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento.<ol>
<li>Alternativamente, o ensaio inteiro pode ser executado em um prato fundo preto transparente. Nessas circunstâncias, os valores de600 OD podem ser gravados e o meio de cultura pode ser posteriormente descartado antes de prosseguir para a etapa 4.1.7. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados no caso, existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Remover a correção e eliminação de resíduos perigosos.</li>
		<li>Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo por inclinar suavemente a placa e aspirando lentamente a lavagem na borda inferior do poço.</li>
		<li>Adicionar 150 µ l/poço de 25 µ g/mL ConA-FITC e incube por 15 min no RT</li>
		<li>Delicadamente, lave duas vezes com 200 µ l de PBS.</li>
		<li>Adicione 150 µ l de PBS a cada poço. Gravar a fluorescência em 488 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualização de microscopia confocal da produção de EPS e cálculo da espessura do biofilme<ol>
<li>Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS.</li>
		<li>Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.</li>
		<li>Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição).</li>
		<li>Configure uma placa de 24 estéril com 12 mm estéril ronda as lamelas de vidro. Adicione 400 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de meio a ser testado.</li>
		<li>Adicionar 400 µ l de cultura inoculada poços em duplicado e repita até que todas as condições experimentais são banhadas.</li>
		<li>Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente.</li>
		<li>Confirme visualmente crescimento na condição TSB, crescimento e precipitado EPS (branco) no TSB + condição de BS e não há crescimento e/ou precipitado branco em poços de controle estéril. Remova os sobrenadantes.</li>
		<li>Correção para 15 min em RT usando 200 µ l/poço de solução de formaldeído/glutaraldeído em 1X PBS.</li>
		<li>Remova a correção e descarte de resíduos perigosos.</li>
		<li>Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo.</li>
		<li>Adicionar 150 µ l/poço de 25 µ g/mL ConA-FITC e incube por 15 min no RT</li>
		<li>Delicadamente, lave duas vezes com 200 µ l/poço de PBS.</li>
		<li>Montar com solução de antidesgaste para montagem com DAPI. Nota: A solução é uma solução de montagem de ready-made, com base em glicerol contendo DAPI para preservar a etiqueta fluorescente enquanto simultaneamente a coloração do DNA em células bacterianas para visualização como um corante de contraste. Siga as direções e recomendações do kit para tempos de incubação antes da imagem latente de amostras. O DAPI mancham o procedimento pode ser realizado antes da aplicação de solução de antidesgaste para montagem que não contenha DAPI.</li>
		<li>Avalie pela microscopia confocal. Em um microscópio confocal, defina o laser para 495 nm/519 nm excitação/emissão para visualização FITC. Como um segundo laser 360 nm/460 nm excitação/emissão de Visualizar DAPI. Localize o biofilme, centrando-se no canal DAPI. Usar canais da DAPI e FITC para determinar a espessura total e definir a parte superior e inferior da imagem latente as fronteiras. Grave imagens de toda a sua espessura Z-pilha capturando imagens cada 0,25 µm após definir perímetros para a parte superior e inferior da pilha-z. Para obter mais informações sobre microscopia confocal, consulte publicações pelo Paddock et al 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>Reconstrua as imagens 3D no ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) para visualizar a formação de biofilme completo e calcular a espessura do biofilme. A espessura média obtida para S. flexneri sais biliares induzidos biofilmes foi 14 µm4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ensaio de dispersão
Nota: Neste ensaio, a desmontagem do biofilme através de dispersão bacteriana é detectada. Aqui, biofilmes maduros são estabelecidos e posteriormente (normalmente no dia seguinte), os meios de comunicação são substituídos com PBS ou completadas PBS. O componente sobrenadante é então avaliado para quantificar o número de bactérias que podem ter dissociada do biofilme.
<ol><li>Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS.</li>
	<li>Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.</li>
	<li>Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição).</li>
	<li>Em uma placa de 96 poços estéril, clara, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de mídia a ser testado.</li>
	<li>Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado três poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado.</li>
	<li>Incube a placa para 4-24 h a 37 ° C estaticamente.</li>
	<li>Antes de continuar, aquecer a PBS, PBS glicose, PBS + sais biliares e PBS + sais biliares + glicose a 37 ° C. Prepare estas diariamente frescos de reagentes.</li>
	<li>Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como 'em branco'. Confirme que o meio é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados se existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias.</li>
	<li>Remova o meio de cultura usando uma linha de vácuo. Não se esqueça de coletar todos os meio de cultura sem interromper a população aderente localizada na superfície de plástico.</li>
	<li>Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo.</li>
	<li>Substituir a lavagem com 130 µ l/poço das seguintes três poços cada: PBS, PBS glicose, PBS + sais biliares e PBS + sais biliares + glicose. Estes reagentes devem ser pré-aquecido a 37 ° C.</li>
	<li>Incubar a placa por 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Retire cuidadosamente a placa de incubadora a 37 ° C. Transferi os sobrenadantes para uma placa de 96 poços fresca, estéril.</li>
	<li>Usando um bloco de 96 poços placa ou diluição, preparar o 10-fold (01:10) diluições em série do líquido sobrenadante em PBS estéril. Nota: A série de diluição deve variar de não diluída a 10-6 , dependendo da estirpe bacteriana a ser testado. Experiências piloto podem ser realizadas para determinar o intervalo ideal de diluição.</li>
	<li>Detectar a placa de 5 µ l de cada diluição em ágar LB usando uma pipeta multicanal. Incube a 37 ° C durante a noite. Contagem das colónias no próximo dia e conta para o factor de diluição, ao determinar a recuperação unidades formadoras (CFU). Para calcular a dispersão por cento em relação a 1 x controle de PBS (fixado em 100%), divida a recuperação CFU de cada condição de tratamento da recuperação CFU das amostras de controlo de PBS 1x. Nota: As placas de mídia de rotina para a estirpe bacteriana de interesse também podem ser usadas. Por exemplo, Shigella pode ser revestido em placas de vermelho Congo. Certifique-se que as placas estão secas por técnicas adequadas de ponto-chapeamento.</li>
</ol>

Os autores têm sem divulgações.

Análise da formação de biofilme é um desafio devido a natureza dinâmica dos biofilmes e a variabilidade entre as cepas, materiais, laboratórios e ensaios. Aqui, apresentam-se várias estratégias para determinar a formação de biofilme em patógenos entéricos, após exposição de sais biliares, com uma visão experimental fornecida para promover a reprodutibilidade. Existem considerações adicionais para garantir a reprodutibilidade. Primeiro e acima de tudo, recomendamos executar independente de pelo menos três experiências de ...

Formação de biofilme é uma estratégia de sobrevivência bacteriana importante induzida durante condições ambientais adversas. Exposição aos compostos bactericidas como antibióticos ou alterações nos nutrientes ou disponibilidade de oxigênio induz um estado estressado em bactérias que podem ser aliviados através da formação de biofilme. Um biofilme é caracterizado pela fixação bacteriana de uma superfície ou outras bactérias e é acompanhado pela secreção de uma matriz EPS, composto principalmente de polissacarídeos1,2,3. Formação de biofilme é um processo dinâmico, no qual uma cascata de eventos culmina na formação de uma comunidade bacteriana aderente maduro1,2,3. As bactérias produzem adesinas para facilitar a fixação cedo enquanto deslocamento adesina perfis de expressão de gene para fortalecer o acessório durante a maturação do biofilme. Simultaneamente, a produção de EPS ocorre ao brasão da comunidade bacteriana em uma matriz para proteger as células contra o estressor inicial. Contido dentro do biofilme de bactérias são de crescimento lento; e como tal, a maioria dos antibióticos processa ineficaz. Além disso, o crescimento lento economiza energia até que as condições mudam para favorecer o crescimento bacteriano1,2,3. Depois de tem passado as duras condições, bactérias dispersarem o biofilme e retomar um lifestyle planctônicos1,2,3. Tradicionalmente, os biofilmes são observados em superfícies e representam um desafio clínico persistente devido a reservatórios de infecção presentes em cateteres e dispositivos de em-moradia a1,2,3.
Formação de biofilme foi recentemente descrita por vários patógenos entéricos; bactérias que infectam o intestino delgado ou cólon4. Para espécies de Shigella , , a infecção ocorre no cólon humano após um trânsito através da maioria do tracto gastrointestinal. Durante a passagem através do intestino, Shigella é exposto a bílis; um detergente degradante de lipídios secretado no intestino para facilitar a digestão de lipídios enquanto simultaneamente mata a maioria das bactérias5. Patógenos entéricos têm uma capacidade única de resistir os efeitos bactericidos da bile6. Nossa análise recente utilizado na vivo-como combinações de glicose e de sais biliares para demonstrar a formação de biofilme robusto em S. flexneri , bem como outras espécies de Shigella, patogênica Escherichia colie Salmonela4. Anteriormente, a Salmonella enterica sorovar Typhi mostrou-se para formar um biofilme induzida por bile devido à colonização exclusivo da vesícula biliar durante a infecção crônica7,8,9, 10. Além disso, pesquisas anteriores com Vibrio11e Campylobacter12 demonstraram a formação de biofilme em resposta a bile. Portanto, as análises estendido as observações de formação de biofilme induzida por bile para outros patógenos e ajudam a estabelecer a demonstração de uma resposta de patógeno entérico conservada a bile. Ao contrário de biofilmes crônicas em que transcrição do gene bacteriano é limitada e senescência celular pode ocorrer1,2,3, propomos que o biofilme induzida por bile entérico é mais transitório na natureza. Este transiente, virulenta biofilme é caracteriza por uma rápida desmontagem (como visto no ensaio de dispersão) e reforçada a expressao de genes de virulência observado no biofilme população4,6. 
Como formação de biofilme é um processo dinâmico, multifacetado e o uso de sais biliares, como um fator primário só foi recentemente descrito por patógenos entéricos mais, as ferramentas e técnicas utilizadas são únicas e criativas aplicações dos métodos tradicionais. Assim, aqui apresentados são três estratégias complementares para quantificar várias características importantes da formação de biofilme induzida por sais biliares, incluindo a aderência bacteriana, produção da matriz EPS e a dispersão de bactérias viáveis desde o biofilme. Estas técnicas têm sido utilizadas principalmente para pesquisa com Shigella; e, por conseguinte, a avaliação de outros patógenos entéricos pode exigir otimização. No entanto, dados positivos de todos os três ensaios apoiar a identificação de biofilmes e estabelecer protocolos podem ser reproduzidos para a formação de biofilme induzida por sais biliares.

<table><tbody><tr><td>Caldo de soja tríptico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cristal Violeta</td><td>Sigma</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalina-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sais biliares</td><td>Sigma</td><td>B8756-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura de 14 mL, 17 x 100 mm, plástico, estéreis</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard-set antifade com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo plano de 96 poços (transparentes)</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo plano de 96 poços (pretas)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo plano de 24 poços (transparentes)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro 12mm, redondas</td><td>Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas de 96 poços</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas fluorescentes</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal ou Fluorescente Microscópio</td><td>Nikon A1 microscópio</td><td></td><td></td>confocal</tr><tr><td>37&deg; C Shaking Incubator</td><td>New Brunswick Scientific Excella E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&deg; Incubadora de placas C</td><td>Thermolyne Series 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Formação de biofilme é um processo dinâmico, vários estágios que ocorre em bactérias sob condições ambientais adversas ou momentos de estresse. Para patógenos entéricos, uma resposta de estresse significativo é induzida durante o trânsito gastrointestinal e após a exposição de bile, um componente normal da digestão humana. Para ultrapassar os efeitos bactericidos da bile, muitos patógenos entéricos formam um biofilme hipótese para permitir a sobrevivência, quando em trânsito através do intestino. Aqui nós apresentamos metodologias para definir a formação de biofilme por meio de ensaios de fase sólida aderência bem como deteção de matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e visualização. Além disso, a avaliação da dispersão de biofilme é apresentada para imitar a análise de eventos, desencadeando a liberação de bactérias durante o processo de infecção. Coloração violeta cristal é usado para detectar bactérias aderentes em um ensaio de aderência de placa de 96 poços de alta produtividade. Avaliação de produção de EPS é determinada por dois ensaios, nomeadamente microscopia coloração da matriz EPS e análise semi-quantitativa com uma lectina de ligação de polissacarídeo conjugado fluorescente. Finalmente, dispersão de biofilme é medido através de contagens de colônia e chapeamento. Dados positivos de vários ensaios apoiar a caracterização de biofilmes e podem ser utilizados para identificar a formação de biofilme induzida por sais biliares em outras cepas bacterianas.

Na Figura 1, a formação de biofilme é induzida na maior parte do crescimento de seguir testadas seis patógenos entéricos em meios contendo sais biliares. Um aumento significativo de bactérias aderentes após exposição de sais biliares é observada em quase todas as cepas testadas. A exceção é enteroaggregative e. coli (CEEA); no entanto, observe a observação induzida do Δaaf mutante4. Os resultados indicam que...

Este protocolo permite que o leitor a analisar a formação de biofilme induzida por sais biliares em patógenos entéricos, usando uma abordagem multifacetada para capturar a natureza dinâmica dos biofilmes bacterianos avaliando aderência, formação de matriz extracelular de substâncias poliméricas, e dispersão.

Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

O objetivo geral deste protocolo de formação e avaliação de biofilme é determinar a capacidade dos patógenos bacterianos entéricos de formar um biofilme, especialmente em condições que imitam o trânsito gastrointestinal e a exposição a sais biliares. Os métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da patogênese bacteriana, como a capacidade dos patógenos entéricos de sobreviver às duras condições de sais biliares do trato gastrointestinal. A principal vantagem das técnicas é que os resultados combinados dos três ensaios suportam a caracterização aprofundada da formação de biofilme em resposta à exposição a sais biliares para cada patógeno.Primeiro tivemos a ideia dos métodos combinados, dada a necessidade de quantificar totalmente a formação de biofilme induzida por sais biliares em Shigella flexneri. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque aspectos do ensaio podem limitar a reprodutibilidade. Portanto, preste atenção às etapas críticas, para garantir a reprodutibilidade.Demonstrando os procedimentos estarão membros do meu laboratório, Kourtney Nicherson, pós-doutorando, e Alejandro Llanos, pesquisador clínico. Primeiro, rotule dois tubo

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O ensaio descreve um meio rápido de medir a formação de biofilme no início de bactérias e fungos. Este método utiliza uma placa de microtitulação, como o substrato para formação de biofilme microbiano, e do biofilme é visualizada utilizando cepa cristal violeta. O ensaio fornece tanto um ensaio qualitativo ou quantitativo para a formação de biofilme cedo.

Dish microtitulação Assay formação de biofilme

Biofilmes microbianos são geralmente constituídos por subpopulações distintas de células especializadas. De célula única análise destas subpopulações requer a utilização de repórteres fluorescentes. Aqui nós descrevemos um protocolo para visualizar e monitorar vários...

Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

Fonte: Tay, S. B., et al. Perturbação Antivirulenta de Biofilmes Patogênicos usando lactonases modificadas para apagamento do quórum.  J. Vis. Exp. (2016)O vídeo demonstra um método para quantificar a biomassa de biofilme em uma bactéria patogênica, comparando controles não tratados com amostras tratadas com uma enzima que apaga quórum. A enzima interrompe a sinalização bacteriana durante a incubação inicial, reduzindo a adesão celular. Após lavagem e incubação adicional, poços de controle...

Quantificação da Supressão de Biofilme Induzida por Enzimas em Bactérias Patógenas

O vídeo demonstra um ensaio de aderência em fase sólida para avaliar a formação de biofilme. Em uma placa de vários poços, as bactérias em meios suplementados com sais biliares aderem a superfícies sólidas, formando biofilmes, o que é confirmado por colorimetria por meio de coloração com cristal violeta e tratamento com etanol.

Um ensaio de aderência de fase sólida para avaliar a formação de biofilme

Este vídeo demonstra um método baseado em fluorescência para quantificar a formação de biofilme induzida por sais biliares. Após a adição de sais biliares na cultura de uma bactéria entérica patogênica, a produção de biofilme é detectada usando uma lectina fluorescente que se liga aos polissacarídeos na matriz de substância polimérica extracelular (EPS) do biofilme.

Um ensaio para estudar a formação de biofilme induzida por sal de bile por meio da detecção de matriz EPS

O vídeo mostra um ensaio de dispersão de biofilme usando uma placa de vários poços. O tampão e o tratamento com glicose desmontam o biofilme, liberando bactérias, enquanto os sais biliares induzem o estresse, retendo as bactérias na substância polimérica extracelular protetora. Maior dispersão com tampão e glicose confirma a desmontagem bem-sucedida do biofilme, estimada pela medição das unidades formadoras de colônias.

Detecção de desmontagem de biofilme por meio de um ensaio de dispersão

Este estudo apresenta o desenvolvimento de metodologias reprodutíveis para estudar inibidores de biofilme e seus efeitos sobre a multicelularidade de Bacillus subtilis.

Metodologias para o estudo<em&gt; B. subtilis</em&gt; Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

Este protocolo descreve um novo método para crescer e qualitativamente analisar biofilme bacteriano sobre hifas fúngicas por microscopia confocal e eletrônica.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Este protocolo descreve uma abordagem que combina métodos estáticos e dinâmicos para avaliar a eficácia de peroxiácidos orgânicos para erradicar biofilmes na indústria de laticínios. Esta abordagem também pode ser usada para testar a eficácia de novas formulações biológicas ou químicas para o controle de biofilmes.

Avaliação da Eficácia dos Perácidos Orgânicos na Erradicação de Biofilmes Laticínios Usando uma Abordagem Combinando Métodos Estáticos e Dinâmicos

Este protocolo descreve a preparação do inóculo, a quantificação do biofilme em placas de microtitulação usando corante violeta cristal, a contagem viável em biofilmes e a visualização de biofilmes de Acinetobacter.

Quantificação, Avaliação de Viabilidade e Estratégias de Visualização para Biofilmes de Acinetobacter

Aprenda a analisar a formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos usando ensaios combinados de adesão, matriz de polissacarídeos e dispersão. Este protocolo permite caracterizar a dinâmica de biofilmes em condições que simulam o trato gastrointestinal.

Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

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