O protocolo de mplexas para Multi-omic análises de amostras de solo

Este método é usado nos campos proteômico, metabolômico e lipidômico, ajudando a obter informações abrangentes sobre as mudanças moleculares que ocorrem nas comunidades microbianas associadas ao solo devido a perturbações ambientais. A principal vantagem dessa técnica é que a obtenção de vários analitos de uma única amostra de solo aumenta a precisão e a exatidão, diminuindo o tempo e o esforço de preparação da amostra. Para começar, para cada amostra de solo de 20 gramas, pese 10 gramas em dois tubos separados de 50 mililitros compatíveis com metanol / clorofórmio.

Use tubos de plástico feitos de PTFE, pois o clorofórmio lixiviará a maioria dos plásticos, contaminando as amostras. Adicione aproximadamente 10 mililitros de aço inoxidável lavado com clorofórmio e contas de granada a cada tubo. Em seguida, enquanto estiver no gelo, adicione quatro mililitros de água fria ultrapura a cada tubo e transfira as amostras em um balde de gelo para uma capela.

Usando uma pipeta sorológica de vidro de 25 mililitros, adicione rapidamente 20 mililitros de clorofórmio gelado dois a um ao volume / volume de metanol aos tubos. Aperte as tampas e transforme a mistura de solo em solução. O clorofórmio-metanol ajuda a quebrar a parede celular dos procariontes e também inativa as atividades enzimáticas.

Em seguida, conecte os tubos a acessórios de vórtice de tubo de 50 mililitros e vórtice horizontalmente por 10 minutos a quatro graus Celsius dentro de uma geladeira, se possível. Em seguida, coloque as amostras dentro de um freezer de 80 graus Celsius negativos por aproximadamente 15 minutos para resfriá-las completamente. Em seguida, usando um sonicador de sonda dentro de uma capela de exaustão, sonice cada amostra com uma sonda de seis milímetros e 1/4 de polegada a 60% de amplitude por 30 segundos no gelo.

Após a sonicação, coloque as amostras em um freezer negativo de 80 graus Celsius, pois a sonicação pode gerar muito calor. Depois de repetir as etapas horizontais de vórtice, sonicação e congelamento, centrifugue as amostras a 4.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por cinco minutos. Neste ponto, a amostra será separada na camada metabólita superior, na camada intermediária da proteína e na camada lipídica inferior.

Coloque as amostras no gelo. Em seguida, dentro de uma capela de exaustão, use uma pipeta sorológica de vidro de 10 mililitros para transferir as camadas superiores de metabólitos dos dois tubos de 50 mililitros para um grande frasco de vidro. Agora, incline levemente o tubo de 50 mililitros para liberar a camada intermediária da proteína para que ela flutue livremente sobre a camada lipídica inferior.

Em seguida, usando uma espátula de laboratório de cabeça chata de aço inoxidável limpa, retire cuidadosamente as duas camadas intermediárias de proteínas e coloque-as juntas em um novo tubo de 50 mililitros. Usando uma pipeta sorológica de vidro de 25 mililitros, transfira as camadas lipídicas inferiores para um grande frasco de vidro. Adicione 20 mililitros de metanol gelado aos dois tubos com detritos e ao tubo com a camada intermediária de proteínas.

Vortex brevemente os tubos e centrifugue os grânulos de detritos e a camada intermediária de proteínas a 4.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, decantar o metanol para um recipiente de resíduos perigosos dentro de uma hotte. Congele as proteínas e os pellets de detritos em nitrogênio líquido e seque-os em um liofilizador por cerca de duas horas.

Adicione 20 mililitros de tampão de solubilização de proteína em tampão tris de 50 milimolares, pH 8,0, a cada um dos pellets de detritos e 10 mililitros ao tubo de camada intermediária de proteína. Na capela de exaustão, sonicar as amostras a 20% de amplitude por 30 segundos para colocá-las em solução. Vortex as amostras por dois minutos.

Em seguida, coloque a amostra de camada intermediária de proteína em um rotador de tubo de laboratório a 50 graus Celsius por 30 minutos para solubilizar a proteína. Transforme horizontalmente as amostras de detritos em vórtice por mais 10 minutos para lisar quaisquer células intactas restantes. Em seguida, gire com as amostras de intercalar de proteínas pelos 20 minutos restantes.

Centrifugue todas as amostras a 4.500 vezes a gravidade à temperatura ambiente por 10 minutos e colete o sobrenadante de cada tubo por amostra em dois tubos de 50 mililitros. Adicione 10 mililitros de tampão de solubilização ao pellet de camada intermediária de proteína. Em seguida, sonice e vortex o pellet de volta à solução.

Após a centrifugação, combine igualmente os sobrenadantes nos dois tubos de 50 mililitros com os sobrenadantes de pellets de detritos e centrifugue os tubos em um rotor de caçamba de ângulo fixo a 8.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 10 minutos para repelir quaisquer detritos restantes. Divida os sobrenadantes em dois tubos de 50 mililitros. Em seguida, usando uma pipeta sorológica de vidro de 10 mililitros, adicione 7,5 mililitros de TCA a cada tubo.

Vortex as amostras em solução. Em seguida, coloque as amostras em um freezer negativo de 20 graus Celsius por duas horas a durante a noite. Para granular a proteína precipitada, centrifugue a amostra a 4.500 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 10 minutos e decanta o sobrenadante em resíduos.

Adicione 10 mililitros de acetona 100% gelada a cada pellet de proteína. Vortex os tubos e combine como pellets em um tubo. Centrifugue e decanta a acetona.

Usando um volume menor de acetona, lave o pellet duas vezes e transfira a suspensão para um tubo de 1,5 ou dois mililitros para a centrifugação final. Transvasar o sobrenadante em resíduos e deixar secar invertido sobre um toalhete de papel numa hotte durante cerca de 20 minutos. Dependendo do tamanho do pellet, adicione 100 a 200 microlitros do tampão de solubilização de proteínas.

Sonicate e transforme o pellet em solução. Observe que a amostra pode ser viscosa devido a substâncias húmicas precipitadas junto com a proteína, que será removida com uma centrifugação subsequente. Finalmente, agite a amostra em uma incubadora ou agitador a 300 rpm e 40 graus Celsius por 30 minutos, para solubilizar a proteína em solução antes de prosseguir para a digestão da proteína ou congelamento instantâneo para processamento futuro.

Usando o protocolo MPLEx demonstrado neste vídeo, 3.376 peptídeos, 105 lipídios e 102 metabólitos polares foram extraídos do solo da pradaria nativa do Kansas, e a extração de proteínas do protocolo é comparada a kits de extração de proteínas e extrações SDS usando LC-MS/MS de fase reversa. Ao comparar inicialmente três repetições do kit comercial de extração de proteínas e dos métodos SDS, apenas 12% dos peptídeos se sobrepuseram entre as duas técnicas, mostrando a complexidade da comunidade microbiana e os diferentes efeitos de extração. Após a comparação de MPLEx com um kit comercial de extração de proteínas e extratos de SDS, cerca de 38% dos peptídeos observados usando o método MPLEx também foram detectados ao usar o SDS e/ou extrações de kit comercial.

Considerando o número de espécies na comunidade bacteriana do solo do Kansas e seu metagenoma, a sobreposição de identificações de peptídeos é razoável. Como mostrado aqui, a ampla aplicabilidade da abordagem MPLEx foi avaliada anteriormente usando o archaeon S.acidocaldarius, um consórcio de unicianobactérias, tecido do córtex cerebral de camundongos, urina humana e folhas de A.thaliana. Em todos os casos, o número de proteínas observadas no método MPLEx foi semelhante ao dos controles, indicando sua utilidade para muitos tipos diferentes de amostras.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter proteínas, metabólitos e lipídios de uma única amostra de solo. Ao tentar este procedimento, é importante ser flexível, pois todos os tipos de solo são diferentes. Por exemplo, o tamanho da camada intermediária de proteínas varia, dependendo da biomassa do solo e das substâncias húmicas presentes no solo.

Não se esqueça de que trabalhar com clorofórmio pode ser extremamente perigoso, e precauções como trabalhar em uma capela devem sempre ser tomadas ao tentar este procedimento.