Usando o Terminal Transferase-mediada dUTP Nick End-rotulagem (TUNEL) e Caspase 3/7 ensaios a morte de células epidérmicas medida em sapos com quitridiomicose
16 de maio de 2018
Podemos quantificar a morte celular epidérmica em sapos com quitridiomicose usando dois métodos. Primeiro, usar terminal transferase-mediated dUTP nick em situ histologia rotulagem final (TUNEL) para determinar diferenças entre animais clinicamente infectados e não infectados. Em segundo lugar, realizamos uma análise de série de tempo da apoptose infecção usando uma análise de proteínas caspase 3/7.
O objetivo geral deste experimento é observar o efeito do patógeno fúngico anfíbio batrachochytrium dendrobatidis na apoptose e morte celular no tecido epidérmico de rãs. Este método pode nos ajudar a entender as doenças da vida selvagem, como se a infecção causa a morte celular ou, inversamente, se existem mecanismos imunológicos contra a infecção. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada em pequenas amostras de biópsia de tecido, de modo que pequenos indivíduos possam ser amostrados repetidamente ao longo do curso da infecção.
Para iniciar este procedimento, prepare lâminas de vidro hidrofílicas com tecido de amostra, conforme descrito no protocolo de texto. Para desparafinizar as seções de tecido, lave as lâminas três vezes com xileno por cinco minutos cada em um frasco de coplin. Em seguida, lave as lâminas com etanol 100% duas vezes por cinco minutos cada.
Depois disso, lave as lâminas com etanol 95% e etanol 70% por três minutos cada. Em seguida, lave as lâminas uma vez com PBS por cinco minutos. Para preparar lâminas experimentais e de controle negativo, pré-trate o tecido adicionando proteinase K recém-diluída diretamente nas lâminas.
Incube as lâminas por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as lâminas em PBS duas vezes por dois minutos cada. Para preparar lâminas de controle positivo, pré-trate o tecido com tampão DN e incube as lâminas em temperatura ambiente por cinco minutos.
Depois disso, dissolva a DNase um no tampão DN até uma concentração final de 0,1 microgramas por mililitro. Adicione a solução DNase preparada aos slides. Incube as lâminas por 15 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, lave as lâminas com água destilada em um frasco de coplin cinco vezes por três minutos cada. Extinguir a reação em peróxido de hidrogênio a 3% em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as lâminas em PBS duas vezes por dois minutos cada.
Em seguida, adicione tampão de equilíbrio ao tecido nas lâminas. Incube por 10 segundos em temperatura ambiente. Em seguida, retire o excesso de líquido ao redor da seção de tecido.
Diluir a enzima desoxinucleotidil transferase terminal em tampão de reação. Em seguida, adicione-o ao tecido nas lâminas experimentais e de controle positivo. Incubar em uma câmara umidificada por uma hora a 37 graus Celsius.
Depois disso, coloque as lâminas em um frasco de coplin contendo a concentração de trabalho do tampão de parada. Agite por 15 segundos e, em seguida, incube as lâminas em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, lave as lâminas com PBS três vezes por um minuto cada e retire o excesso de líquido.
Em seguida, adicione o conjugado anti-digoxigenina, pré-aquecido à temperatura ambiente, diretamente no tecido. Incube as lâminas por 30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara escura umidificada. Após a conclusão da incubação, lave as lâminas com PBS quatro vezes por dois minutos cada.
Retire o excesso de líquido. Em seguida, adicione meio de montagem aos slides. Adicione 15 microlitros de solução DAPI ao meio de montagem nas lâminas.
Cubra cada lâmina com uma lamínula e sele com esmalte. Deixe as lâminas secarem no escuro. Usando um microscópio fluorescente, observe as lâminas imediatamente após a conclusão do processo de pé.
Tire fotos 400 vezes em intervalos aleatórios ao longo de cada seção da pele. Conte as células azuis coradas com DAPI para garantir que pelo menos 100 células por seção de pele por animal sejam visíveis. Em seguida, conte o número de células positivas para TUNEL que aparecem como células únicas vermelhas com bordas de células claras.
Para começar, use um microscópio de luz invertida 40 vezes para tirar uma foto de cada um dos dedos do sapo. Desenhe linhas ao redor da borda do clipe do dedo do pé e use um software de imagem para estimar a área dentro da forma. Para avaliar a área de superfície da amostra de pele tridimensional, multiplique a área estimada por pi.
Para extrair proteínas de uma amostra congelada de dedo do pé de rã, coloque a amostra em um tubo de microcentrífuga com tampa de rosca de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de tampão de amostra e duas esferas de aço inoxidável. Use um batedor de contas na velocidade máxima para lisar as células. Depois disso, coloque o tubo no gelo por três minutos.
Em seguida, centrifugue o tubo para coletar o sobrenadante. Para realizar o ensaio de caspase 3/7 em uma placa de 384 poços, adicione 10 microlitros de tampão de amostra como branco e 10 microlitros de extrato de proteína em triplicata. Em seguida, pipete 10 microlitros de reagente de caspase 3/7 disponível comercialmente para o extrato de proteína e poços em branco.
Em seguida, agite a placa suavemente por 15 segundos para misturar os dois reagentes. Incube em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Finalmente, use um leitor de placas luminescentes para medir a luminescência da amostra.
Neste estudo, os animais infectados apresentam significativamente mais células positivas para TUNEL em comparação com os animais de controle, conforme ilustrado por células coradas de vermelho ou rosa. Nos animais controle, há poucas células positivas para TUNEL e elas não estão concentradas na epiderme. Em animais infectados, as células positivas para TUNEL são mais frequentes na epiderme.
As células positivas para TUNEL estão mais concentradas e diretamente adjacentes às células infectadas. Além disso, existem células positivas para TUNEL mais difundidas na epiderme e nas camadas epidérmicas que são mais profundas do que onde o patógeno fúngico residia. Em animais infectados, há mais células positivas para TUNEL em todos os três tipos de pele, com um nível particularmente alto na pele da coxa e do ventre.
No ensaio de caspase, a intensidade da infecção está positivamente correlacionada com a atividade da caspase 3/7. Além disso, a atividade da caspase 3/7 em animais infectados e não infectados diferiu ao longo do tempo. A atividade da caspase 3/7 diminuiu nas primeiras semanas após a inoculação e aumentou no final da sétima semana em animais infectados.
A atividade da caspase 3/7 permaneceu constante em indivíduos não infectados. Ao tentar o procedimento para o ensaio TUNEL, é importante ler as lâminas no mesmo dia do ensaio para evitar perda de sensibilidade e manter as lâminas em um local fresco e escuro para proteger os corantes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar apoptose e morte celular usando dois métodos de detecção diferentes em pequenas amostras de tecido, como a pele de anfíbios.
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Visão Geral
Este estudo investiga o impacto do patógeno fúngico de anfíbios Batrachochytrium dendrobatidis na apoptose e morte celular em tecido epidérmico de rã. Ao empregar a histologia in situ TUNEL e análise proteica da caspase 3/7, a pesquisa tem como objetivo elucidar a relação entre infecção e morte celular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Doença Selvagem
- Biologia Celular
Contexto
- A quitridiomicose é uma ameaça significativa para populações de anfíbios.
- Compreender os mecanismos de morte celular pode orientar esforços de conservação.
- A apoptose pode desempenhar um papel na resposta a infecções fúngicas.
- Pequenas amostras de tecido permitem análises repetidas ao longo da infecção.
Objetivo do Estudo
- Quantificar a morte celular epidérmica em sapos infectados com quitridiomicose.
- Determinar as diferenças na apoptose entre sapos infectados e não infectados.
- Analisar o curso temporal da apoptose durante a infecção.
Métodos Utilizados
- Rotulagem do fim de quebra por desoxinucleotidil transferase terminal mediada por dUTP (TUNEL) para análise histológica.
- Análise proteica da caspase 3/7 para avaliação em série temporal.
- Preparação de lâminas de vidro hidrófilas com amostras de tecido.
- Desparafinização de cortes de tecido utilizando lavagens com xilol e etanol.
Resultados Principais
- Foram observadas diferenças nas taxas de apoptose entre sapos infectados e não infectados.
- A análise de séries temporais revelou tendências na morte celular ao longo do curso da infecção.
- Os métodos demonstraram eficácia na análise de pequenas amostras de tecido.
- Os conhecimentos obtidos podem contribuir para a compreensão das respostas imunológicas à infecção.
Conclusões
- O estudo fornece dados valiosos sobre os efeitos da quitridiomicose em células epidérmicas de rãs.
- Compreender a apoptose neste contexto pode auxiliar nas estratégias de conservação da vida selvagem.
- Pesquisas futuras poderiam explorar mecanismos imunológicos contra infecções fúngicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este estudo demonstra como ensaios de apoptose podem ser utilizados para avaliar danos teciduais induzidos por patógenos em modelos de doenças em vida selvagem, fornecendo um arcabouço para a redução de riscos mecanicistas na validação inicial de alvos. Ao quantificar a morte celular epidérmica em sapos infectados com Batrachochytrium dendrobatidis, a abordagem reforça a confiança preditiva na avaliação de interações entre hospedeiro e patógeno e orienta a descoberta de biomarcadores translacionáveis. O uso de pequenas biópsias de tecido permite amostragem longitudinal, essencial para acompanhar a progressão da doença e a intervenção terapêutica em sistemas pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao distinguir a apoptose induzida pelo patógeno dos mecanismos de defesa do hospedeiro em tecido epidérmico.
- Valor Operacional: Fornece dados espacialmente resolvidos de morte celular por meio da coloração TUNEL, elucidando os mecanismos de disruptura tecidual em modelos de doenças infecciosas.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança no alvo ao correlacionar a atividade das caspases 3/7 com a carga infecciosa ao longo do tempo, permitindo perfis de resposta à dose e análise temporal.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Estabelece protocolos padronizados para detecção de apoptose em amostras pequenas de tecido, permitindo triagem reprodutível de compostos em condições com material limitado.
- Valor Operacional: O ensaio de caspase 3/7 oferece compatibilidade com alto rendimento para experimentos de curso temporal, enquanto o TUNEL fornece validação dos padrões espaciais de apoptose.
- Prontidão do Ensaio: A microscopia fluorescente e as leituras luminiscentes geram saídas quantitativas adequadas para otimização de ensaios e reprodutibilidade entre laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a apoptose epidérmica com a gravidade da doença, apoiando o alinhamento de biomarcadores entre leituras moleculares e a progressão clínica da infecção.
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco mediante o acompanhamento da dinâmica das caspases 3/7 ao longo das fases da infecção em estudos longitudinais.
- Continuidade Translacional: Demonstra como os ensaios histológicos e bioquímicos de apoptose podem ser combinados para fortalecer a validade pré-clínica em modelos de doenças infecciosas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer leituras da apoptose que auxiliam na validação de alvos e na identificação de compostos promissores, especialmente em estudos nos quais a acessibilidade do tecido limita a histologia convencional.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses sobre se a exposição ao patógeno induz ou suprime a apoptose no tecido hospedeiro, esclarecendo os mecanismos de dano tecidual.
- Triagem: O ensaio de caspase 3/7 permite a triagem quantitativa e escalonável de moduladores que afetam a apoptose em pequenas amostras de biópsia.
- Análises: As saídas luminiscentes e fluorescentes fornecem medidas quantificáveis e normalizadas para comparar a apoptose entre diferentes condições e pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Correlaciona a atividade molecular da apoptose com alterações histopatológicas, apoiando a qualificação de biomarcadores em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: A abordagem combinada de TUNEL e caspase 3/7 estabelece uma plataforma reutilizável de perfilagem de apoptose para estudos de doenças infecciosas e toxicológicos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao distinguir a localização e a cinética da apoptose em tecidos infectados versus tecidos controle.
- Valor Operacional: Protocolos padronizados de preparação de lâminas e de imagem garantem a reprodutibilidade entre laboratórios e lotes de amostras.
- Valor Estratégico: Permite decisões precoces de avançar/não avançar ao fornecer biomarcadores iniciais de estresse tecidual e impacto do patógeno.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização baseada em risco de alvos ao quantificar a apoptose como uma leitura funcional do mecanismo da doença.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em histologia, microscopia de fluorescência e extração de proteínas a partir de amostras teciduais limitadas.
- Depende do acesso a criostato, microscópio fluorescente e leitor de placas luminométrico para ensaios de TUNEL e caspase 3/7.
- Necessita padronização entre os usuários quanto ao corte de tecidos, tempo de coloração e configurações de imagem para manter a sensibilidade do ensaio.
- A adaptação a outros sistemas modelo exige a validação da penetração de anticorpos e da acessibilidade enzimática em diferentes tipos de tecidos.
- Limitação prática: biópsias pequenas da ponta do dedo do pé restringem o rendimento proteico, exigindo métodos alternativos de normalização, como a estimativa da área superficial da pele por meio de imagens, para evitar o consumo do extrato.
