Name: Construção do fago sintética exibida Fab biblioteca com diversidade sob medida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Aprenda a construir bibliotecas sintéticas de anticorpos exibidos em fagos com diversidade sob medida para imunologia. Este método substitui técnicas tradicionais de hibridoma, permitindo o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos de alta afinidade sem imunização animal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores apreciam Dr. Frederic Fellouse do laboratório Sidhu para comentários críticos na construção de biblioteca do Kunkel método com base sintética do fago Fab. Os autores apreciam Sra. Alevtina Pavlenco e outros membros do laboratório Sidhu para ajuda valiosa de alta eficiência electro-competente a preparar células de e. coli e dU-ssDNA de alta qualidade. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant No.: 81572698, 31771006) para DW e pela Universidade de ShanghaiTech (Grant No.: F-0301-13-005) ao laboratório de engenharia de anticorpo.

<ol><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28799485">Monoclonal Antibodies: A Review.</a> Curr Clin Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+watch+in+2017%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Antibodies to watch in 2017.</a> MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).</li>
<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li>
<li>Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hybridoma+revolution%3A+an+offshoot+of+basic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The hybridoma revolution: an offshoot of basic research.</a> Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).</li>
<li>Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal-Friendly+Affinity+Reagents%3A+Replacing+the+Needless+in+the+Haystack%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack.</a> Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).</li>
<li>Hutchison, C. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li>
<li>Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSidhu%2C+SS+%22Phage+Display+in+Biotechnology+and+Drug+Discovery%22">Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery</a>. , CRC Press. (2005).</li>
<li>Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mapping+of+protein+functional+epitopes+by+combinatorial+alanine+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).</li>
<li>Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display-derived+human+antibodies+in+clinical+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy.</a> MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).</li>
<li>Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic therapeutic antibodies.</a> Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).</li>
<li>Adams, J. J., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antibody+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic antibody technologies.</a> Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+for+selection+of+novel+binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phage display for selection of novel binding peptides.</a> Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).</li>
<li>Persson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDR-H3+diversity+is+not+required+for+antigen+recognition+by+synthetic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies.</a> J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).</li>
<li>Lefranc, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT+unique+numbering+for+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+variable+domains+and+Ig+superfamily+V-like+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.</a> Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).</li>
<li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+between+Peptostreptococcus+magnus+protein+L+and+a+human+antibody+reveals+structural+convergence+in+the+interaction+modes+of+Fab+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins.</a> Structure. 9 (8), 679-687 (2001).</li>
<li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Staphylococcus+aureus+protein+A+domain+complexed+with+the+Fab+fragment+of+a+human+IgM+antibody%3A+structural+basis+for+recognition+of+B-cell+receptors+and+superantigen+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).</li>
<li>Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Kunkel+mutagenesis+protocol+for+constructing+primary+and+secondary+phage-display+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries.</a> Methods. 58 (1), 10-17 (2012).</li>
<li>Chen, G., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+generation+of+synthetic+antibody+libraries+for+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display.</a> Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).</li>
<li>Padlan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+antibody+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the antibody molecule.</a> Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).</li>
<li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+phosphoramidites%3A+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li>
<li>Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFellouse%2C+FA+%22Making+and+Using+Antibodies%3A+A+Practical+Handbook%22">Making and Using Antibodies: A Practical Handbook</a>. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).</li>
<li>Fantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+antibody+library+diversity+through+next+generation+sequencing+and+technical+error+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation.</a> PLoS One. 12 (5), e0177574(2017).</li>
<li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+in+library+selection+projects%3A+what+insight+does+it+bring%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?</a> Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).</li>
<li>Perelson, A. S., Oster, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+studies+of+clonal+selection%3A+minimal+antibody+repertoire+size+and+reliability+of+self-non-self+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination.</a> J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).</li>
<li>Miersch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high+throughput+selection+from+phage-displayed+synthetic+antibody+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries.</a> J Vis Exp. (95), e51492(2015).</li>
<li>Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity%2C+developability+and+functional+size%3A+the+holy+grail+of+combinatorial+antibody+library+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation.</a> Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).</li>
<li>Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapeutics+-+the+evolving+patent+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22N+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antibody therapeutics - the evolving patent landscape.</a> N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Para construir a elevada diversidade, fago-exibido Fab bibliotecas, controle de qualidade, pontos de verificação são necessários para monitorar vários estágios do processo de construção, incluindo a competência de células electro-competentes, qualidade do modelo dU-ssDNA, eficiência de CCC-dsDNA síntese, sendo o título após electroporation, Fab de dobramento e diversidade de aminoácidos de CDRs pela análise de sequência de clones Fab-fago.
Alto rendimento e pureza de dU-ssDNA é essencial para ...

Celia tem amplas aplicações variando de pesquisa básica para o diagnóstico de doença e terapêutica. A partir de 2016, mais de 60 mAbs foram aprovados pelos Estados Unidos, Food and Drug Administration (USFDA) para tratamento clínico de doenças auto-imunes, câncer e doenças infecciosas1,2.
Em 1975, Kohler e Milstein relataram uma técnica para a geração contínua de anticorpos de uma única especificidade clonal de uma fonte de celular, conhecida como 'hibridomas' e esta técnica posteriormente tornou-se uma pedra angular na medicina e na indústria3 ,4. Geração de mAbs por esse método requer várias etapas, incluindo a produção de antígeno, imunização de rato, extração dos linfócitos B, fusão de células B com células de mieloma para formar células de hibridoma imortal, seleção de clone e para aplicações terapêuticas, humanização é necessário para evitar o anticorpo de humano anti-rato (HAMA)4,5. No entanto, para esta tecnologia, antígenos incluindo proteínas altamente conservadas, patógenos e toxinas são relativamente ineficazes em desencadear uma resposta imune na vivo por mAb produção5.
Em 1978, Hutchison et al relataram o uso do oligonucleotide para mutagénese direto de um resíduo em um single-stranded bacteriófago vírus6. Em 1985, Smith relatou que fragmentos do gene estrangeiro podem ser fundidos em quadro com o gene que codifica a proteína de casaco do fago III e, portanto, podem ser exibidos na superfície do fago sem comprometer sua infecciosidade7. Estas obras de pioneirismo estabelecido uma base para a posterior construção de bibliotecas do fago-exibido anticorpos imunes, ingênuo, e sintético formulários com o formato de cadeia única variável fragmento (scFv) e fragmento de ligação do antígeno (Fab) para terapêutica mAb desenvolvimento8,9. Do ponto de vista técnico, desenvolvimento de anticorpo baseados na exposição do fago oferece uma abordagem complementar ao desenvolvimento baseado em hibridoma mAb que pode ajudar a contornar as limitações de que alguns antígenos podem representar e a humanização que processar anticorpos derivados do hybridoma exigem muitas vezes5. A partir de 2016, 6 phage display-derivado mAbs foram aprovadas no mercado, incluindo Humira, dentre os mais bem sucedidos mAbs utilizados para tratamento da artrite reumatoide, e muitos candidatos de anticorpo exibição-derivado do fago estão atualmente em vários estágios de clínica investigação10.
Para imunológico e ingênuo do fago anticorpo as bibliotecas, a diversidade de complementaridade-determinando regiões (CDRs) na cadeia leve e pesada é derivada do repertório imune natural (ou seja, de células B). Em contraste, a diversidade de CDRs em bibliotecas de anticorpo sintético do fago é inteiramente artificial. Abordagens sintéticas para construção da biblioteca fornecem controle preciso sobre o design de diversidade de sequência e oferecem oportunidades de estudos mecanicistas da estrutura de anticorpo e função11,12. Além disso, o quadro de bibliotecas sintéticas pode ser otimizado antes da construção da biblioteca para facilitar a jusante, o desenvolvimento industrial em grande escala11,12.
Em 1985, Kunkel relatou uma abordagem de mutagénese baseado em modelo single-stranded DNA (ssDNA) para introduzir mutações local-dirigido em bacteriófago M13 eficientemente13. Esta abordagem foi posteriormente usada extensamente para a construção de bibliotecas do fago é exibido. Oligonucleotídeos de DNA sintetizados quimicamente projetados para introduzir a diversidade na Fab CDRs são incorporados em um phagemid com um modelo de coluna vertebral do anticorpo. Neste processo, o phagemid é expresso como um ssDNA contendo uracil (dU-ssDNA) e os oligonucleotides são recozidos para os CDRs e estendidos para sintetizar o DNA de cadeia dupla (dsDNA) na presença de T7 DNA polimerase e T4 DNA ligase. Finalmente, o ds-DNA gerado pode ser introduzido em Escherichia coli por eletroporação.
Para elevada diversidade, construção de biblioteca do fago-exibido, eletroporação de alta tensão de uma mistura de dois componentes de células electro-competente e covalentemente dsDNA circular fechado (CCC-dsDNA) deve ser preparado cuidadosamente. Et al . Sidhu modificado a preparação de células competentes de electro e DNA de métodos tradicionais e biblioteca melhorou muito diversidade14.
Neste protocolo, descrevemos um método para construção de sintético do fago-exibido Fab bibliotecas com diversidades de 109-1010 obtenível com uma única eletroporação. A Figura 1 mostra uma visão geral da biblioteca de construção incluindo: 1) preparação de alta eficiência de célula electro-competente; 2) extração de dU-ssDNA; 3) método do Kunkel baseado mutagénese dirigida do oligonucleotide; 4) electroporation e cálculo do tamanho da biblioteca; 5) proteína/L base ELISA para dobrar e avaliação de diversidade funcional; e 6) análise de sequências de ADN da diversidade. Todas as cepas, reagentes e equipamentos estão listados na tabela do Material. A tabela 1 mostra a configuração de reagente.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,0 M H3PO4</td><td>Fisher</td><td>AC29570</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M Tris, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>10 mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330-019</td><td></td></tr><tr><td>100 mM ditiotreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP misture</td><td>a solução GE Healthcare</td><td>28-4065-60</td><td>contendo 25 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTP.</td></tr><tr><td>3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-76-02</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE</td><td>Invitrogen</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina, carburador</td><td>Sigma</td><td>C1389</td><td>100 mg/mL em água,&nbsp; 0.22 &mu; m filtrar-esterilizar, concentração de trabalho: 100 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Cloranfenicol, cmp</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>100 mg/mL em etanol, 0,22 &mu; m filtrar-esterilizar, concentração de trabalho: 10 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9620G</td><td></td></tr><tr><td>Ágar granulado</td><td>VWR</td><td>J637-500G</td><td></td></tr><tr><td>H2O2 substrato da peroxidase</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-65-02</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Canamicina, ou</td><td>Fisher</td><td>AC61129</td><td>50 mg/mL em água,&nbsp; 0,22 &mu; m filtrar-esterilizar, concentração de trabalho: 50 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>94046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>U19C015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Fisher</td><td>ND2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td>Fisher SS256</td><td>! CUIDADO NaOH causa queimaduras.</td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Fisher</td><td>BP233</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado de proteína A-HRP</td><td>Invitrogen</td><td>101123</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin M13 Kit</td><td>Qiagen</td><td>22704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extração de gel</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificação</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante L</td><td>Fisher</td><td>77679</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleotídeo quinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T7 DNA polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina, tet</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td>50 mg/ml em água, 0. 22 &mu; m filtrar-esterilizar, concentração de trabalho: 10 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher</td><td>0123-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>25 mg/mL em etanol, concentração de trabalho: 0,25 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>VWR</td><td>DF0127-08</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td><></td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Cepas</td><<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>E.coli CJ236</td><td>New England Biolabs</td><td>E4141</td><td>Genótipo: dut-&nbsp; ung-&nbsp; thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Usado para a preparação de dU-ssDNA.</td></tr><tr><td>E.coli SS320</td><td>Lucigen</td><td>60512</td><td>Genótipo: [F'proAB+lacIq lacZ&Delta; m15 tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 &Delta; (araABC-leu)7679 &Delta; lacX74 galUgalK rpsL thi. Otimizado para eletroporação de alta eficiência e produção de bacteriófagos filamentosos.</td></tr><tr><td>M13KO7</td><td>New England Biolabs</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa </td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2-cm gap cubeta de eletroporação</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 poços 2mL Placas de poços profundos</td><td>Fisher</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>Imunoplacas Maxisorp de 96 poços</td><td>Frascos</td> com <td>151759</td><td></td></tr><tr><td>defletores</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5811000096</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM-630 eletroporador</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnético barras de agitação</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher centrífuga</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador de alta velocidade</td><td>TAITEK</td><td>MBR-034P</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de microplacas</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-9002</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador de líquidos para 96 e 384 poços</td><td>RAININ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de canal mutil</td><td>RAININ</td><td>E4XLS</td><td></td></tr><tr><td>Amicon concentrador</td><td>Merck</td><td>UFC803096</td><td></td></tr></tbody></table>

construção do fago sintética exibida fab biblioteca com diversidade sob medida

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Demanda por anticorpos monoclonais (mAbs) em pesquisa básica e a medicina está a aumentar anualmente. Tecnologia de hibridomas tem sido o método dominante para o desenvolvimento do mAb desde o seu primeiro relatório em 1975. Como uma tecnologia alternativa, métodos de exibição do fago para desenvolvimento do mAb estão cada vez mais atraentes desde que Humira, o primeiro anticorpo derivados do fago e um dos mAbs seller, foi aprovado para o tratamento clínico da artrite reumatoide em 2002. Como um não-animal com base em tecnologia de desenvolvimento do mAb, exposição do fago ignora imunogenicidade do antígeno, humanização e manutenção de animais que são necessárias de desenvolvimento de anticorpo do hybridoma tradicional tecnologia baseada. Neste protocolo, descrevemos um método para construção de sintético do fago-exibido Fab bibliotecas com diversidades de 109-1010 obtenível com uma única eletroporação. Este protocolo é composto por: 1) preparação de alta eficiência de célula electro-competente; 2) extração de uracil contendo ADN single-stranded (dU-ssDNA); 3) método do Kunkel baseado mutagénese dirigida do oligonucleotide; 4) electroporation e cálculo do tamanho da biblioteca; 5) ensaio da proteína/L base imunoenzimático (ELISA) para dobrar e avaliação de diversidade funcional; e 6) análise de sequências de ADN da diversidade.

Seguindo o fluxograma da construção biblioteca Fab (ver Figura 1), estamos preparados M13KO7 auxiliar do fago previamente infectado Escherichia coli SS320 electro-competente células. A eficiência dessas células electro-competente é estimada como 2 X 109 UFC / µ g, quando foi usado para construção de biblioteca, espinha dorsal da Fab phagemid (Figura 4).
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para a construção de uma biblioteca de anticorpo sintético do fago-exibido com diversidade sob medida. Anticorpos sintéticos têm aplicações amplas de pesquisa básica para o diagnóstico da doença e terapêutica.

Construção do fago sintética exibida Fab biblioteca com diversidade sob medida

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer aos leitores uma experiência prática detalhada na construção de uma biblioteca de anticorpos humanos sintéticos exibida por fagos com diversidade personalizada. As bibliotecas de anticorpos sintéticas exibidas em fagos têm grande potencial para substituir as técnicas tradicionalmente baseadas em hibridoma para o desenvolvimento terapêutico de anticorpos monoclonais, ignorando a necessidade de imunização animal e a subsequente humanização de anticorpos. A vantagem da biblioteca de anticorpos sintéticos é que a diversidade personalizada é introduzida em uma estrutura de anticorpos usando informações sobre a diversidade posicional que suportam a interação de alta afinidade e propriedades proteicas desejáveis.Além da utilidade prática, as bibliotecas de anticorpos sintéticos também podem ser usadas para sondar experimentalmente o papel de aminoácidos específicos nas interações biomoleculares, apoiando assim sua própria melhoria contínua. Este procedimento será demonstrado pelo estudante de pós-graduação chamado Zhenwei Zhong e pelo Doutor Shin-chen Hou de nosso laboratório. Ser

construction-synthetic-phage-displayed-fab-library-with-tailored

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos a técnica de exibição de fagos para isolar fagos pré-projetados que expressam proteínas com alta afinidade com a proteína-alvo.

Usando a exibição de fagos para selecionar proteínas com alta afinidade com uma proteína-alvo

A exibição em fagos é uma técnica poderosa para captura de proteínas ou fracções de proteínas que interagem com uma molécula de interesse imobilizada. Uma vez tomada uma decisão sobre o tipo de biblioteca de cDNA de fagos para criar e tela, o protocolo descrito aqui permite a seleção de afinidade eficiente levando à identificação de interagentes.

Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

Um método é descrito com acompanhamento visual para a realização escaláveis, selecções de alto rendimento de bibliotecas combinatórias de anticorpos sintéticos exibidos em fagos contra centenas de antigénios simultaneamente. Usando esta abordagem paralela, isolámos fragmentos de anticorpos que exibem uma elevada afinidade e especificidade para diversos antígenos que são funcionais em imunoensaios convencionais.

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

Uma nova geração de plataformas de transcrição-tradução livre de célula foi projetada para construir sistemas bioquímicos em vitro através da execução de circuitos de gene. Neste artigo, descrevemos como bacteriófagos, como MS2, ΦΧ174 e T7, são sintetizados a partir de seu genoma usando um Escherichia coli célula livre todos os sistema de TXTL.

Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

Os protocolos descritos permitem a construção, caracterização e seleção (contra o destino de escolha), de uma biblioteca de "domainome", feita a partir de qualquer fonte de DNA. Isto é conseguido por um pipeline de pesquisa que combina diferentes tecnologias: a exibição do fago, repórter dobrável e sequenciamento de próxima geração com uma ferramenta web para análise de dados.

Interactome-Seq: Um protocolo para a construção da biblioteca de Domainome, a validação e a seleção por Phage Display e a próxima geração de sequenciamento

Criar sistemas quimicamente induzidos da dimerização da proteína com afinidade e especificidade desejadas para toda a ligand pequena da molécula dada teria muitas aplicações biológicas da detecção e do atuação. Aqui, descrevemos um método eficiente e generalizável para a engenharia de novo de sistemas de dimerização quimicamente induzidos através da seleção manada de uma biblioteca de anticorpos combinatorial de domínio combinatório exibida por fago.

Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

A ubiquização é uma modificação pós-translacional de proteínas críticas, que tem sido implicada em inúmeras doenças humanas. Este protocolo detalha como o display phage pode ser utilizado para isolar novas variantes de ubiquitina que podem ligar e modular a atividade de ligaduras E3 que controlam a especificidade, eficiência e padrões de ubiquização.

Usando o Phage Display para desenvolver moduladores variantes de Ubiquitin para Ligases E3

Um método simples para a identificação de patógenos bacterianos prioridade é a utilização de fagos repórter geneticamente modificadas. Estes fagos repórter, que são específicas para sua espécie de hospedeiro particular, são capazes de transdução rapidamente uma resposta de sinal bioluminescentes para células hospedeiras. Relata-se o uso de fagos repórter para a detecção...

&quot;Bioluminescent &#39;Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para monitorar o comportamento de células individuais de diferentes bactérias no tempo usando automatizado de microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Além disso, fornecem diretrizes como analisar as imagens de microscopia.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

Nós descrevemos um método eficiente para separar single-stranded DNA, dupla fita de DNA e RNA de moléculas ambientais comunidades viral. Os ácidos nucleicos são fracionados por cromatografia em fase de hidroxiapatita com concentrações crescentes de fosfato contendo buffers. Este método permite o isolamento de todos os tipos de ácido nucléico viral a partir de amostras ambientais.

Separação de Single-stranded DNA, Double-stranded DNA e RNA de uma Comunidade Ambiental Viral Usando Cromatografia hidroxiapatita

Aprenda a construir bibliotecas sintéticas de anticorpos exibidos em fagos com diversidade sob medida para imunologia. Este método substitui técnicas tradicionais de hibridoma, permitindo o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos de alta afinidade sem imunização animal.

Construção do fago sintética exibida Fab biblioteca com diversidade sob medida

Explorar mais vídeos