Name: Recombinante colágeno peptídeo Microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a expandir células em microcarregadores macroporosos para engenharia de tecidos usando um sistema de biorreator de perfusão. Este método permite entregar células de forma biocompatível sem etapas de colheita.

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A pesquisa que conduz a estes resultados recebeu financiamento da União Europeia sétimo quadro programa FP7/2007-2013 sob contrato de concessão n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Agradecemos Carolien van Spreuwel-Goossens da Fujifilm fabricação Europe B.V., a assistência técnica durante a fabricação de RCP e Werner Stracke do Instituto Fraunhofer para silicato pesquisa ISC, para obter assistência com a análise de SEM.

hBMSCs foram isolados da cabeça do fêmur de pacientes de osteoartrite submetidos à cirurgia de substituição de cabeça do fêmur. O procedimento foi realizado sob a aprovação do Comitê de ética Local da Universidade de Wuerzburg e consentimento informado dos pacientes. Células endoteliais microvasculares primárias foram isoladas a partir de biópsias do prepúcio de doadores juvenis. Seu representante legal fornecido completo consentimento informado por escrito. O estudo foi aprovado pelo Conselho de ética local da Universidade de Wuerzburg (votação 182/10).
1. isolamento de hBMSCs e HDMECs
<ol><li>Medula óssea-derivado mesenquimais estromais células humanas (hBMSCs)<ol>
<li>Remova o osso esponjoso da cabeça do fêmur, usando uma colher estéril. Nota: O osso esponjoso aparece como uma substância granular e solta dentro do osso cortical, que é duro e rígido. Pode ser necessário raspar partes do osso esponjoso do osso cortical por meio de um bisturi.</li>
		<li>Inserir o osso esponjoso removido em dois tubos de 50 mL. O volume do osso esponjoso pode variar de 5 a 10 mL de acordo com a dimensão da cabeça do fêmur removido durante a cirurgia de substituição da anca.</li>
		<li>Lavagem com DMEM-F12 (mistura 1:1 do meio DMEM e presunto F12), encher o tubo com aproximadamente 30 mL de meio.</li>
		<li>Agitar o tubo manualmente, de forma longitudinal, para 5 s para deixar células adiposas fora do osso esponjoso. Centrifugação a 300 x g e 22 ° C por 5 min.</li>
		<li>Aspire com uma pipeta graduada de plástico, a camada de células de gordura e aproximadamente 20 mL de sobrenadante restante. Deixe a média suficiente para cobrir o osso esponjoso.</li>
		<li>Encha os tubos com 10 ml de DMEM-F12 e agitar vigorosamente longitudinalmente pela mão, para 10-15 s, para permitir que as células para fora.</li>
		<li>Transferência de 10-15 mL de suspensão de células com uma pipeta graduada de plástico dos tubos para um novo tubo de 50 mL.</li>
		<li>Repita 2 - 3 vezes da etapa 1.1.6 pool juntos a suspensão de eritrócitos obtidos até o osso esponjoso coletado no tubo de 50 mL é branco.</li>
		<li>Transferi a suspensão de células com uma pipeta graduada de plástico para dois novos tubos, evitando a aspiração a pelota de colágeno depositada no fundo dos tubos de 50 mL.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de célula x 300 g e 22 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante por aspiração-lo com uma pipeta graduada de plástico.</li>
		<li>Adicione 40 mL de DMEM-F12 10% FCS 1% caneta/Strep 50 µ g/mL ascorbato-2-fosfato em um terceiro tubo. Transferi 5ml deste meio para cada tubo contendo o centrifugado. Re-suspender as pelotas de célula de cintilação o fundo dos tubos vigorosamente e as suspensões celulares de transferência para o tubo contendo meio único.</li>
		<li>OPCIONAL: Diluir 100 µ l de suspensão de células para a contagem de células, diluição 1: 100 primeiro com PBS e depois 01:10 em azul de Tripan, adicionando 15 µ l da primeira diluição de 15 µ l de DPBS e 30 µ l Trypan azul para obter um DPBS: relação de Trypan azul de 1:1. Conte as células com uma câmara de Neubauer padrão.</li>
		<li>Sementes das células em 109 células/175 cm2 T-balão em 25 mL de meio, conforme descrito em 1.1.11. Alternativamente, divida a suspensão de células inteiras em frascos de cultura de células de2 até dez 175 cm sem contar. Nesta fase, os hBMSCs não são distinguíveis das hemácias, que grandemente em maior número. hBMSCs aparecerá como colônias esparsas (1-2/balão) ao longo dos primeiros 7 dias.</li>
		<li>Médio de mudança após 4 dias de semeadura para permitir a interação das células do sangue com o hBMSCs. Após a primeira troca de médio, mude o médio a cada 2-3 dias. Realizar o câmbio médio completamente, removendo o meio de cultura com uma pipeta graduada de plástico, lavar duas vezes com DPBS (pela adição de 10 mL de DPBS para as células aderentes e remover completamente o DPBS com uma pipeta graduada de plástico) e em seguida, adicionar 20 mL de meio fresco, como descrito em 1.1.11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Humanas células endoteliais microvasculares dérmicas (HDMECs)<ol>
<li>Tratar as biópsias de pele e isolar os HDMECs de acordo com protocolos previamente publicados21. Brevemente, após a separação da derme com a epiderme, incube a derme em tripsina por 40 min a 37 ° C e 5% de CO2. Após o tempo de incubação, transferir a derme para uma placa de Petri contendo meio de cultura e riscar cada parte com o uso de um bisturi. Transferir a suspensão de eritrócitos obtidos para um tubo de plástico de 50 mL e centrifugar durante 5 min à 300 x g e 22 ° C. Conte a suspensão de células utilizando uma câmara de Neubauer e sementes em uma densidade de 1,2 x 104 células/cm2. Mude o meio completamente todos os outros dias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. instalação e esterilização dos frascos de girador, RCP microcarriers e biorreator
<ol><li>Frascos de girador e RCP microcarriers<ol>
<li>Um dia antes dos experimentos, set-up o spinner frascos e prepará-los para a esterilização por autoclave. Nota: Deixe as tampas dos frascos girador solta e, quando possível, esterilizá-los em uma posição ereta.<ol>
<li>Embrulhe separadamente os frascos de girador com folha de alumínio ao redor as tampas de lado para evitar a contaminação durante o desempacotamento. Enrole os frascos com 1-2 camadas de papel alumínio para autoclave para minimizar os riscos de contaminação após a esterilização.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pese a quantidade necessária de RCP se microcarriers em 20 mL de DPBS. Nota: 30 mg é necessária por balão girador. Deixe hidratar pelo menos 1h antes da esterilização de calor em autoclave (121 ° C por 15 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biorreator de perfusão<ol>
<li>Utilize o sistema de biorreator descrito para produzir tecido vascularizado equivalentes20. Este biorreator consiste de um navio, no qual é colocado o biomatriz, um reservatório médio e uma garrafa de pressão.<ol>
<li>Conectar-se a embarcação com o reservatório a médio e a garrafa de pressão através de tubos de silicone (ver Figura 3). Deixar as tampas soltas e colocá-lo em um saco de plástico do autoclave, fechar bem e colocar isso em um segundo saco plástico de autoclave. Esterilize em autoclave.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cultura de hBMSCs e HDMECs na RCP se microcarriers
Nota: Os HDMECs usados para propagar o microcarriers RCP foram rotulados com RFP por transdução Lentivirus. Este protocolo foi modificado após um protocolo previamente publicado5.
<ol><li>Deixe a RCP se microcarriers resolver ao fundo e lave-os com 10 mL de meio de cultura. Repeti 3 vezes.</li>
	<li>Lave frascos de girador com 10 mL de meio de cultura.</li>
	<li>Adicione 30 mg de RCP se microcarriers por balão girador em 8 mL de meio de cultura. Equilibrar os frascos de girador que contém o microcarriers RCP em 37 ° C e 5% CO2 por 30 min, antes da semeadura das células. Nota: Isto é baseado no peso seco aproximado de microcarriers RCP antes da esterilização.</li>
	<li>Semente de 5 x 105 hBMSCs ou HDMECs (trecho 3) por balão girador em 2 mL de meio de cultura.</li>
	<li>Coloque os frascos de girador na placa de agitador e iniciar agitando a 90 rpm por 5 min e descanso para 55 min, a 37 ° C e 5% CO2, para um total de incubação estático/dinâmico de 1 h. Repita 4 vezes.</li>
	<li>Adicione 10 mL de meio de cultura celular por balão girador e comece a contínua agitação a 95 rpm. Incube a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Com o uso de uma micropipeta colher amostras em µ l de 1, 4 e 7:333 dias para DNA conteúdo (~ 0,5 mg), 1000 µ l para análise SEM (~ 1,5 mg) e 333 µ l para a coloração ao vivo/morto (~ 0,5 mg). Nota: Isto é baseado no peso seco aproximado de microcarriers RCP antes da esterilização.</li>
	<li>10 mL de meio de cultura de todos os outros dias de mudança. Por isso, espere até que o RCP microcarriers resolver ao fundo e Aspire cuidadosamente 10 mL do balão Fiandeiro, com o uso de uma pipeta de 10 mL e em seguida, adicionar 10 mL de meio de cultura fresco.</li>
	<li>Manter as culturas na placa agitador fixado em 95 rpm, a 37 ° C e 5% CO2 por 7 dias.</li>
</ol>4. conteúdo DNA, análise de SEM, viver morto manchando e brotando do ensaio
<ol><li>Conteúdo de DNA<ol>
<li>Com o uso de uma micropipeta, colete aproximadamente 0,5 mg de microcarriers de cada frasco de girador (contido em 333 µ l de suspensão) e a transferência de um tubo de plástico de 2 ml. Nota: Isto é baseado no peso seco aproximado de microcarriers RCP antes da esterilização.</li>
		<li>Lave uma vez com 1 mL de DPBS e, em seguida, Aspire o sobrenadante.</li>
		<li>Remover o restante DPBS em um Liofilizador e o microcarriers liofilizado para posterior normalização de peso.</li>
		<li>Congele as amostras a-80 ° C durante pelo menos 6 h.</li>
		<li>Incubar as amostras a 60 ° C durante a noite com 300 papaína µ l 5 U/mL.</li>
		<li>Estabelecer as curvas de titulação adequada, seguindo as instruções de manufacturer´s de ensaio de quantificação (por exemplo, ensaio de PicoGreen dsDNA) kit e realizar a medição do sinal fluorescente em 520 nm, com um detector de luminescência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de digitalização<ol>
<li>Colete ca. 1 mg de microcarriers de cada balão girador e a transferência de um tubo de plástico de 2 mL.</li>
		<li>Lave microcarriers uma vez com 1 mL de DPBS.</li>
		<li>Remover DPBS e incubar em 1 mL de etanol a 70% por 1h.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e incubar em 1 mL de etanol a 80% por 1h.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e incubar em 1 mL de etanol a 90% por 1h.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e incubar em 1 mL de etanol a 100% por 1h.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e incubar em 1 mL de hexamethyldisilazane por 10 min.</li>
		<li>Abra a tampa e deixe a amostras secar durante a noite sob uma capa de química.</li>
		<li>Corrigir as amostras em suporte apropriado e proceder à análise de SEM, de acordo com protocolos estabelecidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DAPI e coloração Live/mortos<ol>
<li>No dia 2, 4 e 7 após semeadura sobre o microcarriers de célula colete 0,5 mg de microcarriers de cada balão girador e transferência para um tubo de plástico de 2 mL. Lave uma vez com 1 mL de DPBS.</li>
		<li>DAPI<ol>
<li>Corrigi as amostras por 10 min em suficiente paraformaldeído 4% para cobri-los.</li>
			<li>Lave uma vez com 1 mL de DPBS.</li>
			<li>Incube a temperatura ambiente com a solução de coloração por 45 min num agitador de balanço.</li>
			<li>Detectar um sinal fluorescente de DAPI em um microscópio de fluorescência com um filtro de emissão 420 nm e adquirir imagens.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ao vivo/morto de coloração<ol>
<li>Incube as amostras em 500 µ l de solução de tintura de Live/mortos. Mantenha as amostras a 37 ° C por 20 min, protegido da luz.</li>
			<li>Lave uma vez com 1 mL de DPBS.</li>
			<li>Detecta o sinal de fluorescência das células vivas com um filtro de emissão 490 nm e de células mortas com um filtro de emissão 545 nm em um microscópio de fluorescência. Adquira imagens.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Brotação de ensaio para HDMECs<ol>
<li>Mix 330 µ l de solução de colágeno R 0.4%, 170 µ l de ácido acético 0,1% e 50 µ l de M199 médio em um tubo plástico de 15 mL. Manter-se no gelo.</li>
			<li>Tome ~0.375 mg de microcarriers (250 µ l) com o uso de uma micropipeta. Transfira para um tubo de plástico de 1,5 mL, aguardar o microcarriers RCP resolver ao fundo e retire o meio completamente. Nota: Isto é baseado no peso seco aproximado de microcarriers RCP antes da esterilização.</li>
			<li>Adicione o volume de NaOH 0,2 N necessário para neutralizar a mistura de colágeno e imediatamente misture com o microcarriers RCP. Nota: Determinar a quantidade necessária de NaOH 0,2 N antecipadamente, adicionando-o à mistura até mudança de pH (vire de cor amarela para rosa) e em seguida, colocando a mistura na incubadora por 1 min, após o qual deve ser formado um gel.</li>
			<li>A mistura de microcarriers de RCP-gel de colágeno em um poço de uma placa de 24 da placa. Incube a 37 ° C e 5% de CO2 por 30 min.</li>
			<li>Adicione 200 µ l do fator vascular de crescimento endotelial (por exemplo, meio de cultura VascuLife VEGF-Mv). Incube a 37 ° C e 5% de CO2 por 24 h.</li>
			<li>Observar sob um microscópio de contraste de fase invertido, usando um objeto de ampliação, de 10x e adquirir imagens.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. biomatriz semeadura e começo do sistema do biorreator para HDMECs
<ol><li>Um dia antes de começar as culturas de biorreator, cortar BioVaSc aberto (o biomatriz) longitudinalmente no lado antimesenteric e corrigi-lo em um quadro de policarbonato previamente desinfetado (ver Figura 3A, B). Nota: O BioVaSc é um biomatriz obtido de um segmento decellularized jejunal porcina, preparado como anteriormente publicado21. Nota: como o quadro de policarbonato não pode ser esterilizado pelo calor, desinfectá-la pela incubação 20 min no banho sônica (40KHz) seguido de incubação de 3 vezes em etanol a 70% por 25 min. Em seguida, lave o quadro 3 vezes com DPBS estéril.<ol>
<li>Coloque o sistema biomatriz-frame em uma placa de Petri de 100mm e preenchê-lo com o fator de crescimento endotelial vascular + 1% penicilina estreptomicina (caneta/Strep).</li>
		<li>Equilibrar o biomatriz incubando durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após desanexação e contagem das células, injete 10 x 107 HDMECs em 1000 µ l de meio de cultura até vasculatura preservada do biomatriz, com o uso de uma seringa de 2 mL. Nota: Injete ~ 700 µ l através da entrada arterial e ~ 300 µ l através da saída de veia.</li>
	<li>Incube a 37 ° C e 5% de CO2 para 3 h, para permitir a fixação da célula.</li>
	<li>Abasteça o sistema de biorreator com 350 mL do fator de crescimento endotelial vascular + 1% caneta/Strep e incubar a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Coloque o quadro no interior da embarcação de bioreator. Conecte os pedículos arteriais e venosos ao navio.</li>
	<li>Inicie perfusão conectando o sistema do biorreator de uma bomba peristáltica. Ajustar a pressão de 10 ± 1 mmHg e amplitude.</li>
	<li>Aumente a pressão gradual cada hora até chegar a 100 mmHg de pressão, amplitude ± 20.</li>
	<li>Manter o sistema de biorreator por 7 dias sob estas condições, a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
</ol>6. adição de RFP-HDMECs para o biomatriz
<ol><li>Mix 330 µ l da solução de colágeno R de 0,4%, 170 µ l de ácido acético 0,1% e 50 µ l de M199 médio em um tubo Falcon de 15ml. Manter-se no gelo.</li>
	<li>Retire os frascos de girador microcarriers a RCP. Remova completamente o meio de cultura.</li>
	<li>Adicione o volume de NaOH 0,2 N necessário para neutralizar a mistura de colágeno e imediatamente misture com o microcarriers RCP.</li>
	<li>Adicione a mistura de microcarriers de RCP-gel de colágeno no lúmen do biomatriz. Permita a gelificação por 30 min.</li>
	<li>Em paralelo, mudar o meio do biorreator, removendo o meio completamente e em seguida, adicione a 350 mL de fresco, pré aquecido, fator de crescimento endotelial vascular + 1% caneta/Strep.</li>
	<li>Ligar o biorreator à bomba peristáltica e configurar a pressão a 100 ± 20 mmHg e amplitude.</li>
	<li>Mude o médio a cada 7 dias.</li>
	<li>Manter o biorreator na cultura durante 21 dias.</li>
</ol>7. análise e leituras de culturas de biorreator
<ol><li>Preparação das amostras<ol>
<li>Desconecte o biomatriz bioreator e removê-lo do quadro de policarbonato.</li>
		<li>Corte a peça obtida em 6 seções: 2 para MTT, 2 para incorporação/coloração de parafina e 2 para análise SEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incorporação de parafina<ol>
<li>Colocar as seções em um prato de Petri e lavar com bastante DPBS para cobri-los. Descarte o DPBS.</li>
		<li>Corrigi as seções em paraformaldeído 4% durante a noite.</li>
		<li>Preparar as fitas para a incorporação de parafina e executá-lo de acordo com protocolos padrão.</li>
		<li>Preparar as seções em blocos de parafina e cortar amostras de 3 µm para coloração H & E, com o uso de um micrótomo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H & E mancha<ol>
<li>Mancha rehidratadas seções de acordo com protocolos padrão32.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de digitalização<ol>
<li>Colocar as seções em um prato de Petri e lavar com bastante DPBS para cobri-los. Descarte o DPBS.</li>
		<li>Corrigi as seções com glutaraldeído de 4,75% durante a noite.</li>
		<li>Execute cadeia de desidratação, com o aumento da concentração de etanol 50% a 100%.</li>
		<li>Cobrir as seções com hexamethyldisilazane (HMDS) por 10 min. descarte o HMDS usado e adicionar HMDS fresco.</li>
		<li>Permitir que as seções para secar durante a noite sob a coifa e depois preparar as amostras para a imagem latente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brometo de 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)<ol>
<li>Misture o reagente MTT com o fator crescimento endotelial vascular, em uma concentração de 1 mg/mL.</li>
		<li>Incube as seções na solução MTT para 90 min a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
		<li>Observe as estruturas vasculares e microcarriers célula-semeado macroscopicamente ou sob um microscópio de campo claro, para detectar células metabolicamente ativas. Adquira imagens.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Os autores não têm nada para divulgar.

Um dos principal objetivos da microcarrier é a expansão das células, mantendo a sua diferenciação para entregar as células para o local de necessidade. O método representado introduzir RCP microcarriers onde as células foram capazes de anexar, proliferar e colonizar o microcarriers com densidade de pilha alta. Isto foi observado pelo live/dead coloração, em que mais de 90% de células viáveis foram detectados enquanto apenas poucas células mortas foram obtidas após 7 dias de culturas dinâmicas. Da mesma forma, as imagens ...

Um problema geral em aplicações de engenharia de tecido é produzir uma massa de células alta com o fenótipo de diferenciação correta na localidade de necessidade. A aplicação de microcarriers para abordar esta questão começou em 1967 com o aumento da importância à data nos campos tais como a engenharia de tecidos ortopédicos para geração em grande escala de pele, ossos, cartilagens e tendões1. Eles permitem a manipulação de culturas aderentes em maneiras semelhante da suspensão de culturas2 expandindo células em substratos (3D) tridimensionais de microescala. Assim, as células experimentam um fornecimento de nutrientes homogêneo e interações célula-matriz, que levam a melhor manutenção na vivo3,4 diferenciação que muitas vezes é perdida ao longo do tempo em 2D se aproxima de5. Uma maior taxa de superfície e o volume - levando-o à célula maior rendimentos6,7, superior de gás e nutrientes taxas de câmbio, comparando a sistemas estáticos8, a possibilidade de regular e sujeita a cultura a física estímulos de9e o potencial para intensificação do processo de expansão7 são ainda mais vantagens. Vários recursos tais como o diâmetro, densidade, porosidade, carga de superfície e propriedades de adesão10,11 distinguem as diferentes disponíveis comercialmente micro e macro-operadoras. No entanto, dentre a principal vantagem é sua entrega potencial como microtissues com defeito de local ou demanda.
Para aplicações da tecnologia de microcarrier em engenharia de tecido ósseo, ilustramos em um anterior relatório12 a produção de um novo microcarrier tipo constituído de um colágeno recombinante peptídeo (RCP, comercialmente disponível como Cellnest). Esta nova microcarrier permite o GMP-compatível com a escala de produção de andaime e célula, conforme necessário para a entrega da célula em um cenário clínico. Neste contexto, ajuste de estabilidade do andaime, taxa de degradação e propriedades de superfície através da escolha adequada de uma estratégia adequada de reticulação permite adaptar a técnica para o aplicativo selecionado, tipo de interesse de célula ou tecido13-alvo. Em particular, o emprego potencial desta microcarrier como um sistema de entrega de celular injetável para aplicação terapêutica14 torna particularmente interessantes em um ambiente clínico.
Neste trabalho, ilustramos, por conseguinte, o processo de cultivo para o isolamento e a expansão de medula óssea-derivado mesenquimais estromais células humanas (hBMSCs) e dérmicas microvasculares endoteliais células humanas (HDMECs) na recombinação de colágeno-I-baseada microcarriers peptídeo-baseado e sua preparação para a entrega em um ambiente clínico. Além disso, descrevemos a protocolos adicionais úteis para a manutenção da viabilidade celular após a implantação.
Viabilidade celular após o implante na verdade é fortemente dependente da vascularização15,16,,17, que garante a troca de oxigênio e nutrientes e facilita a remoção do lixo. Biorreatores constituem uma abordagem para superar os desafios de vascularização em engenharia de tecidos e manter a viabilidade celular, através de perfusão de meio de cultura, fornecendo assim, oxigénio e nutrientes18. Aqui, podemos ilustrar um in vitro método para avaliar a capacidade de migração das células endoteliais microvasculares do microcarriers a RCP para um biomatriz e sua capacidade de contribuir para o novo de vascularização e angiogênese. Este biomatriz é um segmento decellularized de suínos jejuno denominado BioVaSc (andaime biológico vascularizado), rica em colágeno e elastina e com conservas de estruturas vasculares, que inclui uma artéria alimentação uma drenagem veia de19 que tem sido aplicado para questões de implantação20.

<table><tbody><tr><td>Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>20395.01</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindoldicloridrato (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533.001</td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica Kern EG 2200-2NM</td><td>Kern & Sohn GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascorbate-2-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Biorreator</td><td>Presidente de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, Wuerzburg, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de campo claro Axiovert 40C</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellnest</td><td>Fujifilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (15 mL, 50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de colágeno R 0,4%</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>47254.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Modificado, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio</td></tr><tr><td>Eosina 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177.01000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T171.4</td><td>Soro fetal desnaturado</td></tr><tr><td>para bezerro (FCS)</td><td>Bio& VENDA</td><td>FCS. ADD.0500</td><td>microscópio de fluorescência não inativado por calor</td></tr><tr><td>BZ-9000</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haematoxylin</td><td>Morphisto</td><td>10231.01000</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisilazane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td>grau de reagente, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Incubadora para biorreator</td><td>Cadeira de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, Wuerzburg, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração dupla de células vivas/mortas</td><td>Fluka</td><td>04511KT-F</td><td></td></tr><tr><td>Placa agitadora magnética</td><td>2Mag</td><td>80002</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td>10X</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas Tecan Infinite M200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha 21G 16mm</td><td>VWR</td><td>613-5389</td><td></td></tr><tr><td>Papaína de látex de mamão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4762</td><td>pó liofilizado, &ge; 10 unidades/mg de proteína</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio Quanti-iT PicoGreen dsDNA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P087</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Varredura Supra 25</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de sódio 1.0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Frascos giratórios (25 mL)</td><td>Seringa Wheaton</td><td>356879</td><td></td></tr><tr><td>1 mL</td><td>VWR</td><td>720-2561</td><td></td></tr><tr><td>Frascos para cultura de tecidos (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2)</td><td>TPP Techno Plastik Products AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF-Mv</td><td>Lifeline tecnologia celular</td><td>LL-0005</td><td></td></tr></tbody></table>

recombinante colágeno peptídeo microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Engenharia de tecidos é um campo promissor, focado no desenvolvimento de soluções para a crescente demanda em tecidos e órgãos em relação a fins de transplante. O processo para gerar tais tecidos é complexo e inclui uma combinação apropriada de tipos de células específicas, andaimes e estímulos físicos ou bioquímicos para orientar a diferenciação e crescimento celular. Microcarriers representam uma ferramenta atraente para expandir as células em um microambiente de tridimensional (3D), uma vez que fornecem maior superfície-para rácios de volume e imitar mais de perto a situação na vivo em comparação com métodos tradicionais bidimensionais. O sistema vascular, fornecendo oxigênio e nutrientes para as células e garantindo a remoção de lixo, constitui um importante bloco de construção quando gerando engenharia de tecidos. Na verdade, a maioria das construções falharem após ser implantado devido a falta de suporte vascular. Neste estudo, apresentamos um protocolo para a expansão de células endoteliais na recombinante microcarriers baseados em colágeno sob condições dinâmicas no balão do girador e biorreatores, e explicamos como determinar nesta viabilidade celular de configuração e funcionalidade. Além disso, propomos um método de entrega de celular para fins de vascularização sem etapas de desprendimento adicionais necessárias. Além disso, nós fornecemos uma estratégia para avaliar a vascularização celular potencial em um bioreator de perfusão em uma matriz biológica decellularized. Acreditamos que o uso dos métodos apresentados pode levar ao desenvolvimento de novas terapias baseadas em células para uma grande variedade de aplicações na prática clínica de engenharia de tecidos.

Como mostrado na figura 1A, obtivemos o elevado número de células viáveis na microcarriers a RCP após 7 dias da cultura, determinado pela coloração ao vivo/morto. Esses resultados foram confirmados por análise de SEM, em que microcarriers completamente colonizados foram observados ao redor dos poros, parcialmente sobrecrescimento-los (figura 1B). Por outro lado, experiências em que as células não foram semeadas uniformemente resu...

Propomos um protocolo de expansão celular na se microcarriers e seu uso como sistema de entrega em um bioreator de perfusão para propagar uma matriz de tecido decellularized. Nós também incluímos diferentes técnicas para determinar a proliferação celular e a viabilidade das células cultivadas no microcarriers. Além disso, demonstramos a funcionalidade das células após culturas de biorreator.

Recombinante colágeno peptídeo Microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

O objetivo geral deste procedimento é expandir as células em uma alta área de superfície disponível e entregar ainda mais essas células a locais de defeito ou demanda por aplicações clínicas. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia de tecidos, como expansão celular, entrega celular e vascularização. A principal vantagem dessa técnica é que podemos expandir as células e entregá-las, sem nenhuma etapa de coleta, em locais de defeito, de forma biocompatível.A demonstração visual desse método é crítica, pois o trabalho de microtransportadores e biorreatores pode ser complicado, no início, devido às muitas etapas envolvidas. Ajudando no procedimento estará Jihyoung Choi, um estudante de doutorado do nosso laboratório. Um dia antes dos experimentos, monte os frascos giratórios e prepare-os para esterilização em autoclave.Enrole os frascos giratórios com papel alumínio ao redor das tampas laterais separadamente para evitar contaminação durante o desembrulho. Embrulhe os frascos com uma a duas camadas de papel alumínio para autoclavagem para minimizar os riscos de contaminação após a esterilização. Deixe as tampas dos frascos giratórios soltas e, quando possível, esterilize-as na posição vertical.Em seguida, pese a quantidade necessária de microtransportadores macroporosos RCP em 20 mililitros de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco. Deixe-os hidratar por pelo menos uma hora antes da esterilização por calor em autoclave. Use o sistema de biorreator referenciado no protocolo de texto para produzir equivalentes de tecido vascularizado.Este biorreator consiste em um vaso no qual a biomatriz é colocada, um reservatório médio e um frasco de pressão. Conecte o recipiente ao reservatório médio e ao frasco de pressão por meio de tubos de silicone. Deixe as tampas soltas e coloque o sistema em um saco plástico de autoclave.Feche bem o saco e coloque-o em um segundo saco plástico de autoclave antes de esterilizar em autoclave. Deixe os microtransportadores macroporosos RCP esterilizados assentarem no fundo e lave-os com 10 mililitros de meio de cultura. Repita esse processo três vezes.Lave também os frascos giratórios com 10 mililitros de meio de cultura. Em seguida, adicione 30 miligramas de microtransportadores macroporosos RCP por frasco giratório em oito mililitros de meio de cultura. Equilibre os frascos giratórios RCP microtransportadores macroporosos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos antes de semear as células.Em seguida, semeie meio milhão de células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea humana ou células endoteliais microvasculares dérmicas humanas por frasco giratório em dois mililitros de meio de cultura. Coloque os frascos giratórios em uma placa agitadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e comece a mexer a 90 rpm por cinco minutos. Em seguida, descanse por 55 minutos para um total de uma hora de incubação dinâmica estática.Repita este ciclo de incubação quatro vezes. Agora, adicione 10 mililitros de meio de cultura de células por frasco giratório. Em seguida, comece a mexer continuamente a 95 rpm enquanto incuba a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Um dia antes de iniciar as culturas do biorreator, abrir a biomatriz longitudinalmente no lado antimesentérico e fixá-la em uma estrutura de policarbonato previamente desinfetada. Após o desprendimento e a contagem das células, utilizar uma seringa de dois mililitros para injetar 10 milhões de HDMECs em mil microlitros de meio de cultura através da vasculatura preservada da biomatriz. Injete aproximadamente 700 microlitros pela entrada arterial e aproximadamente 300 microlitros pela saída da veia.Incube a biomatriz com células injetadas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas para permitir a fixação celular. Após a incubação, a conexão da biomatriz ao biorreator deve ser feita por dois indivíduos, cuidando para que os pedículos arterial e venoso estejam conectados corretamente ao fluxo do meio. Encha o sistema do biorreator com 350 mililitros do fator de crescimento endotelial vascular, 1% de penicilina estreptomicina e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Coloque a estrutura dentro do vaso do biorreator. Em seguida, conecte cuidadosamente os pedículos arteriais e venosos ao vaso. Inicie a perfusão conectando o sistema de biorreator a uma bomba peristáltica.Defina a pressão em 10 milímetros de amplitude de mercúrio mais menos um. Aumente a pressão passo a passo a cada hora até atingir uma pressão de 100 milímetros de amplitude de mercúrio mais menos 20. Misture 330 microlitros de solução de colágeno R a 0,4%, 170 microlitros de ácido acético a 0,1% e 50 microlitros de meio M199 em um tubo Falcon de 15 mililitros.Mantenha a mistura no gelo. Em seguida, retire os microtransportadores RCP dos frascos giratórios. Remova completamente o meio de cultura.Em seguida, adicione o volume de hidróxido de sódio necessário para neutralizar a mistura de colágeno. Uma vez neutralizado, misture imediatamente a mistura com os microtransportadores RCP. É importante permitir a gelificação do gel de colágeno antes de iniciar o fluxo médio.Caso contrário, o gel se desprenderá e os microtransportadores serão lavados do lúmen da biomatriz. Adicione a mistura de microcarreadores RCP de gel de colágeno no lúmen da biomatriz. Deixe gelificar por 30 minutos.Em seguida, conecte o biorreator à bomba peristáltica e configure a pressão em 100 milímetros de amplitude de mercúrio mais menos 20. Finalmente, realize análises e leituras de culturas de biorreatores conforme descrito no protocolo de texto. Resultados representativos da proliferação celular em microcarreadores são mostrados pela coloração de mortos-vivos em que muitas células vivas podem ser observadas nos microcarregadores após sete dias de culturas dinâmicas.Esses resultados foram confirmados por análise de microscopia eletrônica de varredura mostrando microcarreadores completamente colonizados após sete dias de culturas dinâmicas. Os HDMECs mantiveram sua funcionalidade após sete dias de culturas dinâmicas em microtransportadores RCP. Aqui, a microscopia de campo claro revela brotos crescendo a partir dos microtransportadores colonizados quando cultivados em um gel de colágeno.HDMECs marcadas com RFP foram observadas nas estruturas vasculares da biomatriz após 21 dias de culturas de biorreatores, indicando sua migração dos microcarreadores RCP para a biomatriz. Além disso, após 21 dias de culturas de biorreatores, a imagem de microscopia eletrônica de varredura mostra que os microcarreadores estavam próximos à biomatriz. Curiosamente, eles não são mais colonizados por células.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como expandir as células em microtransportadores para prepará-las em um sistema de entrega de células injetáveis para aplicação terapêutica. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas. Este procedimento representa uma estratégia promissora na medicina regenerativa para obter e maximizar a expansão celular e entregar células a locais de implantação onde possam melhorar a vascularização de enxertos de engenharia de tecidos.As implicações dessa técnica se estendem à vascularização, pois ela pode ser usada em qualquer tipo de célula para uma aplicação específica de tecido em um cenário clínico. Este método também pode fornecer compreensão sobre o potencial emprego de microtransportadores como um sistema de entrega de células injetáveis para fins terapêuticos. Não se esqueça de que trabalhar com células primárias pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar luvas e jaleco e trabalhar em um gabinete de biossegurança devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de engenharia de tecidos explorarem a migração celular in vitro, o que poderia ajudar a entender ou prever situações in vivo.

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Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

O colágeno é um componente central da ECM, e fornece pistas essenciais para diversos processos celulares que vão desde a migração para diferenciação e proliferação. Fornecidas aqui é um protocolo para a incorporação de células dentro de hidrogéis de colágeno 3D, e uma técnica mais avançada para a geração de matrizes de colágeno randomizados ou alinhadas utilizando microcanais PDMS.

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

A matriz extracelular específico do tecido (ECM) é um mediador chave da função das células. Este artigo descreve métodos para a síntese de espumas e microtransportadores que são estáveis em cultura sem a necessidade de reticulação química para aplicações em 3D avançada em modelos de cultura celular in vitro ou como bioscaffolds pró-regenerativos derivado de ECM puros.

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

Este protocolo descreve a fabricação de microcryogels elástica 3D se integrando microfabrication com tecnologia cryogelation. Durante o carregamento com células, microtissues 3D são gerados, que pode ser facilmente injetado em vivo para facilitar a terapia regenerativa ou montadas em matrizes para em vitro triagem de drogas de alto rendimento.

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

Este protocolo demonstra o uso de um canal microfluídico com geometria variável ao longo da direção do fluxo de fluido para gerar deformação extensional (alongamento) para alinhar as fibras em um hidrogel de colágeno 3D (&lt;250 μm de espessura). O alinhamento resultante se estende por vários milímetros e é influenciado pela taxa de deformação extensional.

Microengenharia 3D Colágeno Hidrogéis com Alinhamento de Fibras de Longo Alcance

Aqui, apresentamos um protocolo para alcançar a fabricação em larga escala de células aderentes através de um sistema totalmente fechado baseado em microcarreadores dissolvidos grau GMP. O cultivo de células-tronco mesenquimais humanas, células HEK293T e células Vero foi validado e atendeu tanto às exigências de quantidade quanto aos critérios de qualidade para a indústria de terapia celular e gênica.

Produção de células em larga escala com base em microtransportadores porosos solúveis de grau GMP

Este protocolo tem como objetivo avaliar peptídeos biofuncionais de automontagem quanto à adesão celular, morfologia organoide e expressão gênica por imunocoloração. Usaremos uma linha celular de câncer colorretal para fornecer uma maneira econômica de obter organoides para testes intensivos.

Fabricação e caracterização de organoides de câncer colorretal da linha celular SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta

Aprenda a expandir células em microcarregadores macroporosos para engenharia de tecidos usando um sistema de biorreator de perfusão. Este método permite entregar células de forma biocompatível sem etapas de colheita.

Recombinante colágeno peptídeo Microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo (Vídeo) | JoVE Journal

Recombinante colágeno peptídeo Microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo

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