Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α
14 de junho de 2018
Aqui nós apresentamos um protocolo para descrever o desenvolvimento e validação de uma única molécula matriz digital ensaio de ELISA, que permite a detecção de ultra sensível de todos os subtipos de IFN-α em amostras humanas.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a natureza, regulação e impacto biológico das respostas induzidas pelo interferon em diferentes contextos de doenças, incluindo autoimunidade e infecção. A principal vantagem desta técnica é sua própria sensibilidade presidencial. Esta técnica tem grande potencial para a descoberta de biomarcadores para melhorar o manejo do paciente em muitas doenças, pois pode quantificar citocinas com sensibilidade sem precedentes.
Um passo importante com essa abordagem foi neutralizar as atividades relacionadas a pacientes com sistema poliindócrino autoimune tipo um. Para começar, carregue 280 milhões de contas paramagnéticas em um tubo de microcentrífuga, anotando o volume. Em seguida, gire as contas e coloque o tubo em um separador magnético por um minuto.
Remova e descarte a solução diluente, isolando assim as contas. Em seguida, lave as contas com BWB duas vezes e BCB duas vezes. Para cada lavagem, adicione 200 microlitros e agite o tubo por cinco segundos.
Em seguida, separe as esferas da solução usando o separador magnético. Após um minuto de separação, descarte o diluente. Em seguida, adicione 190 microlitros de BCB por volume de cordão.
Em seguida, bata o tubo brevemente, gire o tubo por pulso e coloque as contas lavadas no gelo. Para ativar as contas, combine um mililitro de BCB frio com 10 miligramas de EDC e vortex até que a solução fique homogênea. Trabalhe com rapidez e segurança ao usar o EDC, devido à sua instabilidade inerente e solução equina.
Em seguida, adicione 10 microlitros de EDC diluído a frio por volume de cordão à suspensão do cordão e vortex os grânulos brevemente. Em seguida, coloque as contas em uma coqueteleira em temperatura ambiente por 30 minutos. Para conjugar anticorpos com as contas, primeiro o vórtice e o pulso giram as esferas ativadas.
Em seguida, coloque as contas em um separador magnético por um minuto e descarte o sobrenadante BCB. Em seguida, remova o tubo do ímã e lave as contas duas vezes com 200 microlitros de BCB. Em seguida, vórtice, giro por pulso e separa magneticamente as esferas para remover o buffer.
Em seguida, adicione rapidamente 200 microlitros de anticorpo frio trocado por tampão às esferas ativadas. Depois de transformar os grânulos em solução, coloque a suspensão no agitador de temperatura ambiente por duas horas a 1.000 RPM. Comece dando à suspensão do grânulo revestida de anticorpos um giro de pulso e, em seguida, use a coluna magnética para remover o tampão.
Em seguida, verifique a concentração da proteína no tampão. Use um espectrofotômetro de baixo volume. Neste ponto, os anticorpos são acoplados aos grânulos e qualquer valor acima de zero significa que os grânulos estão saturados com anticorpos.
Agora, lave as esferas com 200 microlitros de BWB, como realizado em todas as lavagens anteriores. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo e verifique a concentração de proteína. A quantificação das proteínas liberadas dos grânulos permite a medição do acoplamento de anticorpos.
Em seguida, lave novamente as esferas com 200 microlitros de BWB. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio de esferas, vortex o tubo por cinco segundos e transfira-o para o agitador de temperatura ambiente por 30 minutos. Após 30 minutos, as contas serão bloqueadas.
Em seguida, lave-os uma vez com 200 microlitros de BWB, seguido de lavá-los duas vezes com 200 microlitros de tampão diluente de esferas para cada lavagem. Em seguida, armazene os grânulos revestidos e bloqueados em 200 microlitros de tampão diluente de grânulos a quatro graus Celsius. Esta seção do vídeo sugere estratégias de como ajustar as condições do ensaio usando o software analisador de matriz de molécula única na configuração de cerveja caseira.
Comece testando diferentes combinações de grânulos conjugados de anticorpos de captura e anticorpos de detecção de biotinilação em ambas as combinações de anticorpos. Em seguida, testar combinações das três diferentes concentrações de anticorpos de captura com duas taxas de biotinilação diferentes para detecção e captura de anticorpos e vice-versa. Em seguida, escolha a combinação que oferece o nível mais baixo de detecção e use-a para outras etapas.
Nesse caso, uma proporção de 30 para um de biotina para anticorpo fornece o melhor limite de detecção. Em seguida, compare uma configuração de duas etapas com uma configuração de três etapas. As configurações de três etapas têm três etapas de incubação diferentes.
Um com o anticorpo de captura, um com o anticorpo de detecção e um terceiro final para a marcação da enzima SBG. As configurações de duas etapas combinam as incubações de captura e detecção. Execute o analisador de matriz de molécula única usando as concentrações e rações de anticorpos de captura e detector selecionadas nas configurações de duas e três etapas, pré-configuradas no analisador, seguindo as instruções do fabricante.
Em seguida, escolha a configuração que permite a maior sensibilidade e mantenha-a para etapas futuras. Nesse caso, a configuração de duas etapas oferece uma sensibilidade ligeiramente maior em cada ponto de teste. Em seguida, otimize as concentrações do anticorpo detector e do SBG.
Teste três concentrações diferentes de anticorpo detector com três concentrações diferentes de SBG. Escolha as concentrações que dão a maior sensibilidade e guarde-as para as etapas futuras. Nesse caso, 0,3 microgramas por mililitro de anticorpo e 150 PBG molar pica têm o nível ideal de detecção com baixos níveis de fundo com amplitude média fortuita.
Para etapas adicionais de otimização, consulte o protocolo de texto. Nele existem procedimentos para otimizar a especificidade e reprodutibilidade do ensaio e um ensaio para competição de proteínas. Usando um ensaio otimizado para detectar 13 subclasses de interferon-alfa, plasma e soro foram analisados em pacientes com LES, pacientes com DMJ e controles saudáveis.
Altos níveis de proteína interferon-alfa foram detectados em ambas as coortes da doença. A linha pontilhada indica o nível de detecção de um Eliza convencional, disponível comercialmente, que não detectaria a proteína interferon-alfa nesses grupos de pacientes, apesar do papel conhecido dessa citocina nessas doenças. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como desenvolver e validar um ensaio de matriz de moléculas únicas para a análise de sua escolha.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que durante a escolha celular de anticorpos é. Desde o seu desenvolvimento, este ensaio permitiu uma melhor caracterização do papel do interferon-alfa em uma diversidade de doenças e infecções autoimunes. Este ensaio também serviu para monitorar as respostas a novas terapias e identificar os atores celulares responsáveis por certos distúrbios autoimunes.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para desenvolver e validar um ensaio ELISA digital de matriz de molécula única, que permite a detecção ultrassensível de todos os subtipos de IFN-伪 em amostras humanas. Este método é particularmente útil para compreender as respostas induzidas por interferon em vários contextos de doenças.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Descoberta de Biomarcadores
Contexto
- O interferon-alfa desempenha um papel crucial nas respostas imunes.
- Os métodos existentes não têm a sensibilidade necessária para detectar baixos níveis de citocinas.
- Este estudo visa melhorar as capacidades de detecção para uma melhor gestão dos pacientes.
- Autoimunidade e infecções são áreas principais de foco.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio altamente sensível para detectar subtipos de IFN-伪.
- Explorar o impacto biológico das respostas ao interferon em doenças.
- Facilitar a descoberta de biomarcadores para melhores resultados clínicos.
Métodos Utilizados
- Preparação de contas paramagnéticas para conjugação de anticorpos.
- Otimização das condições do ensaio usando software de análise de matriz de molécula única.
- Teste de várias combinações de anticorpos para sensibilidade.
- Análise de amostras de plasma e soro de pacientes e controles.
Principais Resultados
- Níveis elevados de interferon-alfa foram detectados em pacientes com LES e DMJ.
- O ensaio demonstrou sensibilidade superior em comparação com o ELISA convencional.
- Condições ideais para acoplamento e detecção de anticorpos foram estabelecidas.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido fornece uma ferramenta poderosa para estudar respostas ao interferon.
- Tem potenciais aplicações no diagnóstico e gestão de doenças autoimunes.
- Mais otimização pode melhorar a especificidade e reprodutibilidade.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Ultra-sensitive quantification of human interferon-α (IFN-α) at attomolar concentrations addresses a critical gap in cytokine biomarker detection for autoimmune and infectious disease research. This digital ELISA platform enables detection of all 13 IFN-α subtypes, supporting translational biomarker discovery and mechanistic de-risking in early-stage biopharma pipelines. The validated assay enhances predictive confidence for target engagement and disease monitoring, directly impacting portfolio triage and advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of IFN-α to interrogate cytokine-driven disease mechanisms.
- Supports functional target validation by distinguishing IFN-α subtypes in human samples.
- Facilitates mechanistic de-risking for immune-modulating therapeutic hypotheses.
- Improves predictive confidence in pathway modulation and target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, reproducible digital ELISA platform for high-sensitivity cytokine detection.
- Standardizes assay configuration and antibody selection for robust downstream workflows.
- Enables quantitative, cross-cohort comparison of IFN-α levels in diverse biological matrices.
- Prepares biological systems for reliable compound screening and biomarker evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling detection in patient-derived samples.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in autoimmune and infectious disease models.
- Provides risk-adjusted data for advancing candidate therapies targeting IFN-α pathways.
- Enhances disease-relevant system modeling by capturing low-abundance cytokine dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This digital ELISA method integrates from early discovery through translational research, enabling hypothesis testing, target validation, and biomarker-driven decision-making across the R&D continuum.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification for IFN-α–mediated responses.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for quantitative cytokine measurement.
- Analytics: Delivers attomolar sensitivity and multiplexed subtype detection for robust data outputs.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling biomarker alignment in patient samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, high-sensitivity platform for diverse cytokine and biomarker programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Standardizes ultra-sensitive cytokine quantification with reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of immune-modulating assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody selection, conjugation, and digital ELISA instrumentation.
- Demands access to single molecule array analyzers and robust analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay parameters and data interpretation.
- Adaptable to various biological matrices but dependent on antibody specificity and sample quality.
- Practical limitations include optimization of assay configuration and validation for each new target.
