Name: Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a desenvolver um ensaio digital ELISA de molécula única para detecção ultra-sensível de interferon-α humano. Este método permite quantificar citocinas com sensibilidade sem precedentes para descoberta de biomarcadores.

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DD e YJC reconhece apoio da ANR (projeto IFNX, não. CE17001002) e ImmunoQure AG para fornecimento de anticorpos monoclonais. Agradecemos a Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki e Pierre Quartier para fornecer amostras clínicas. YJC reconhece o Conselho Europeu de investigação (GA 309449: Fellowship para YJC) e um subsídio de estado gerenciado pela Agência Nacional de pesquisa (França), no âmbito do programa "Os investimentos para o futuro", tendo a referência ANR-10-IAHU-01.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos o desenvolvimento e validação de uma molécula altamente reprodutível, ultra-sensível matriz digital ELISA para quantificação directa da proteína IFN-α em amostras humanas (passos resumidos na tabela 1). Um dos passos mais importantes no desenvolvimento do ensaio é a escolha do par anticorpo16, com as características em termos de cinética e vinculação epítopo, sendo a chave para um ensaio bem sucedido. É importante evitar o uso de emparelhados anticorpos monoclonais que destino o mesmo epítopo ou que causam impedimento estérico. Anticorpos policlonais poderiam ser usados como anticorpos de deteção para superar tais limitações. Se em qualquer etapa dada a sensibilidade desejada não for atingida, mais possibilidades de otimização devem ser consideradas. Isto pode incluir o uso de pares de anticorpo alternativos, alterações em parâmetros como tipo de proteína (por exemplo, BSA < caseína), pH (6.0-8.5), força iônica, capacidade tampão (por exemplo, concentrações de NaCl e fosfato), grânulos de transportadora e/ou presença de surfactantes. Uma vasta gama de parâmetros con ser otimizado ao desenvolver um ensaio de matriz única molécula. No entanto, em geral, condições que dão sinal: fundo elevado rácios e mínimos LODs são os preferidos (veja a Figura 3, Figura 1e Figura 2).
Em relação a especificidade, o ensaio de IFN-α mostrou nenhuma reactividade cruzada para qualquer outros IFNs testado (β, γ, λ1, λ2, ω) (figura 4a) e foi capaz de detectar todos os 13 subtipos de IFN-α (figura 4b). No entanto, o ensaio mostrou uma menor afinidade para o subtipo de IFN-α2, (figura 4b e complementar a tabela 4). Curiosamente, sensibilidades diferentes para as diferentes classes de IFN-α2 (a, b, c) foram também observadas, que pode ser devido a processos de fabrico distintas ou sequências de aminoácidos diferentes, como os subtipos de IFN-α2 foram obtidos de diferente comercial fornecedores. Com esta única exceção, todas as espécies de IFN-α deram respostas muito semelhantes. A especificidade do ensaio demonstrou-se ainda mais pelo pré-tratamento das amostras com o anti-IFN-α um clone, que revogada o sinal (Figura 6 e complementar o quadro 6).
Uma das principais vantagens desta tecnologia é que qualquer analito de interesse pode ser potencialmente alvo16. Além disso, diferentes espécimes biológicos podem ser testados, tais como soro, plasma, líquido cefalorraquidiano, lisados celulares, cultura sobrenadantes31 e sequer respirar32. Normalmente, uma diluição de 1:3 do plasma é realizada para evitar entupimento potencial do analisador matriz única molécula. No entanto, o analito de interesse poderia estar presente em concentrações muito baixas na amostra biológica relevante e concentrações mais altas de amostra podem ser necessário (dependendo da sensibilidade do ensaio)33. Apesar de existir a possibilidade de multiplexação, mantendo boa sensibilidade34, é um processo desafiador e ensaios para medição superior a 6 proteínas dentro das mesmas experiências têm ainda de ser desenvolvido35.
A capacidade de detectar e quantificar a citocinas e outras proteínas biológicas relevantes em tão baixas concentrações abre uma nova gama de aplicações33,36. É sabido que inúmeras proteínas exercem seus efeitos mesmo em concentrações muito baixas, o que até agora estavam abaixo do limite de detecção da melhor ELISAs37. Enquanto outras tecnologias de imunoensaio oferecem vantagens sobre convencional ELISA19, demonstramos aqui que única molécula matriz digital ELISA é uma plataforma robusta e reprodutível para a detecção ultra-sensível de baixa concentração de citocinas em amostras humanas. Como tal, esta tecnologia oferece um enorme potencial para a descoberta de biomarker e melhor gestão paciente de uma vasta gama de doenças.

Tipo I IFNs são uma família de citocinas que desempenham um papel central em orquestrar antivirais respostas imunes. Eles foram descobertos por Isaacs e Lindenmann 60 anos há1,2 e agora é conhecido que esta família heterogênea de polipeptídeos compreende 14 diferentes subclasses (13 subtipos de IFN-α e IFN-1 β). Tipo eu IFNs são essenciais para o apuramento das infecções virais, mas também têm sido implicados na patologia de uma variedade de Estados de doenças humanas, incluindo as doenças auto-imunes Lúpus eritematoso sistémico (SLE), Dermatomiosite juvenil (DMJ), e o tipo Eu interferonopathies em qual tipo de constitutivo eu induzida pelo IFN sinalização resulta em patologia3,4,5,6,7.
Estudar tipo de proteína IFN níveis em amostras biológicas tem sido um desafio desde sua identificação inicial como um, "interferindo substância"1,2. Atualmente, o sanduíche do ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA) é o método mais utilizado para detecção de proteínas IFN-α. Apesar de ser específicos, simples e rápida, tipo eu IFN ELISAs apresentam limitações importantes, tais como limitada sensibilidade. Além disso, a medição de todos os subtipos de IFN-α requer o uso de múltiplos ensaios cada com sua própria capacidade de detecção e sensibilidade. Enquanto houver ELISAs comerciais que detectam diferentes subtipos de IFN-α, sua sensibilidade é limitada (1,95 pg/mL, pg/mL 12,5 e 12.5 pg/mL, respectivamente) que é muitas vezes insuficiente para detectar proteínas IFN-α em amostras biológicas. Para contornar essa limitação, vários proxy biológico foram desenvolvidos ensaios para quantificar do tipo I IFN medindo expressão gênica induzida ou atividade funcional8,9,10,11, 12 , 13 , 14. no entanto, estes ensaios não fornecem uma medida direta da proteína IFN-α.
Neste estudo, a única molécula matriz digital ELISA tecnologia foi usada para desenvolver um ensaio para a detecção de moléculas de proteína IFN-α única. ELISA digital utiliza a mesma química básica como ELISA convencional, no entanto, a reação ocorre em matrizes compreendendo 50.000 individual 46 femtoliter tamanho poços15,16. Moléculas de proteína única são capturadas pelo anticorpo-revestida de grânulos paramagnéticos e rotuladas com um anticorpo de detecção biotinilado, seguido por ligação de um conjugado de enzima, streptavidin-β-galactosidase (SBG). Posteriormente, os grânulos são suspensos com um substrato fluorogenic, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), em matrizes de único-molécula. Diminuindo o volume reação 2 bilhões de vezes17, uma alta concentração local do sinal fluorescente é alcançada e contagens de molécula se tornar viáveis, como cada molécula gera um sinal de que agora pode ser fiavelmente mensurados18. Em essência única molécula matrizes são capazes de contar único imunocomplexos e determinar um número médio de enzimas por grânulo (AEB). Contando aos micropoços em que é detectado um sinal permite a quantificação/digitalização de moléculas de proteína, como não há uma correlação direta entre a concentração de proteína e a relação entre contas de immunocomplexed e um número total de grânulos presentes no as câmaras de tamanho femtoliter.
Yeung et al. realizaram um estudo de avaliação abrangente de plataformas usando diferentes tecnologias de nove e quatro citocinas imunoensaios com o objectivo de comparar a precisão do ensaio, sensibilidade e correlação de dados através de diferentes plataformas19. Dentre as principais conclusões do estudo foi que única molécula matrizes e única molécula contando imunoensaio apresentaram a maior sensibilidade para a deteção de citocinas no soro humano dentro do intervalo de concentração de sub-pg/mL. Ensaios de citocina única molécula matriz Digitas ELISA foram usados para estudar o papel do TNF-α e IL-6 no Crohn doença20, IFN-α em interferonopathy e autoimunes pacientes 7, e as diferentes post-translationally modificado em formas de C-X-C motivo chemokine 10 (CXCL10) em hepatite crônica e doadores saudáveis recebendo sitagliptina21,22. Outras aplicações incluem a medição de rodopsina em pacientes com retinopatia diabética,23; o estudo das patologias do cérebro através de medições de soro/plasma do Neurofilamento luz24 e β-amiloide 1-42 peptídeo25, no contexto da esclerose múltipla e a doença de Alzheimer, respectivamente. Ensaios de matriz única molécula também podem ser usados para detecção de patógeno melhorada como caracterização de reservatório viral HIV26e também para detecção de DNA27 e micro RNAs28. Uma grande vantagem da tecnologia de matriz única molécula é este grande versatilidade, como um ensaio contra qualquer analito de interesse pode ser desenvolvido se um par de anticorpo específico está disponível. Além disso, kits de ensaio do homebrew são comercialmente disponíveis, permitindo o desenvolvimento de novos ensaios, o protocolo que é detalhado em uma forma modificada abaixo.
Aqui, uma descrição detalhada das etapas de desenvolvimento e validação para um ensaio de matriz única molécula é apresentada que resulte em maior sensibilidade para a deteção de proteínas de IFN-α. Anticorpos para ensaios de matriz única molécula devem ser altamente específicos, evitando a reactividade cruzada com proteínas relacionadas (com especificidade de espécie considerada-se relevante). Idealmente, devem ser escolhidos de anticorpos com um KD menor que 10-9 M; alta afinidade assegura ligação forte, com a produção de um sinal mais elevado. A cinética da ligação antígeno-anticorpo são também importantes e rápido Kna e K lentofora favorecerá a montagem de complexos antígeno-anticorpo. Começando com um par de anticorpo que tem um bom desempenho em ELISA clássica, com um limite de detecção (LOD) de 1-100 pg/mL, aumenta as chances de obtenção de um ensaio de matriz de molécula altamente sensível. Chang e colegas realizaram estudos cinéticos detalhados das interações biomoleculares ocorrendo em cada passo, propondo um conjunto de equações para predizer a sensibilidade analítica18. Eles mostraram essa matriz única molécula ELISA digital parece ser eficaz dentro de uma ampla gama de afinidades de anticorpo (KD ~ 10−11 - 10−9 M), bem como a geração de sinal é mais dependente a taxa de tais anticorpos.
Para utilizar alta afinidade anticorpos que tiramos vantagem de anticorpos isolados de pacientes com a Síndrome Poliglandular autoimune tipo 1/autoimune Poliglandular-candidíase-ectodérmica distrofia (APS1/APECED)29. Por razões que ainda não estão totalmente esclarecidos, a grande maioria dos indivíduos de AIRE-deficiente desenvolver um conjunto de alta avidez anticorpos contra todos os subtipos de IFN-α29, e nós selecionamos dois clones de anticorpo anti-IFN-α de afinidades de ligação complementares para os diferentes subtipos de IFN-α, como estimado por valores de IC50 . A combinação destes anticorpos exclusivo de alta afinidade com a tecnologia de matriz única molécula permitiu a quantificação direta de IFN-α em concentrações attomolar (fg/mL). Tal deteção de proteínas de IFN-α ultra-sensível irá contribuir para uma melhor compreensão da natureza, regulamento e impacto biológico da resposta induzida pelo IFN em configurações diferentes da doença.

<table><tbody><tr><td>Anti-IFN-&alfa; anticorpo A (clone 8H1)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Não disponível comercialmente</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; anticorpo B (clone 12H5)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Não disponível comercialmente</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; anticorpo EBI-1 clone</td><td>eBioscience</td><td>BMS216C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; anticorpo BMS216BK clone</td><td>eBioscience</td><td>BMS216BK</td><td>Não é um kit ELISA, mas abs a granel</td></tr><tr><td>IFN &alpha; 2c</td><td>eBioscience</td><td>BMS305</td><td>OK</td></tr><tr><td>IFN &alfa; I (17)</td><td>PBL</td><td>11150-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; 2a</td><td>PBL</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; 2a</td><td>PeproTech</td><td>Não está mais disponível</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 2b</td><td>PBL</td><td>11105-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; 1</td><td>PBL</td><td>11175-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; 4a (M1)</td><td>PBL</td><td>11177-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; 4b (a4)</td><td>PBL</td><td>11180-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; B2 (a8)</td><td>PBL</td><td>11115-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; C (a10)</td><td>PBL</td><td>11120-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; D (a1)</td><td>PBL</td><td>11125-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; G (a5)</td><td>PBL</td><td>11135-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; F (a21)</td><td>PBL</td><td>11130-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; H2 (a14)</td><td>PBL</td><td>11145-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; J1 (a7)</td><td>PBL</td><td>11160-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; K (a6)</td><td>PBL</td><td>11165-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alfa; WA (a16)</td><td>PBL</td><td>11190-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &lambda; 1</td><td>PeproTech</td><td>300-02L</td><td></td></tr><tr><td>IFN &lambda; 2</td><td>PeproTech</td><td>300-02K</td><td></td></tr><tr><td>IFN &ômega;</td><td>PeproTech</td><td>300-02J</td><td></td></tr><tr><td>IFN &beta;</td><td>PeproTech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>IFN &gama;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; ELISA</td><td>PBL</td><td>41115.1</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>ISRE-Reporter</td><td>Qiagen</td><td>CCS-008L</td><td></td></tr><tr><td>Fu-GENE HD Transfecção Reagente</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Soro Reduzido Mediuem</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Ensaio Reporter</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substituto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Não está mais disponível</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de micocentrífuga Amicon - Filtros de 0,5mL</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC505096</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de Conjugação de Esferas</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Não pode ser encomendado separadamente</td></tr><tr><td>Não Codificado Contas Paramagnéticas</td><td>Quanterix</td><td>101360</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Lavagem de Esferas</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Não pode ser encomendado separadamente</td></tr><tr><td>EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11844071</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de Bloqueio de Esferas</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Não pode ser encomendado separadamente</td></tr><tr><td>Tampão Diluente de Esferas</td><td>Quanterix</td><td>101362</td><td></td></tr><tr><td>Detector e Amostra Diluente</td><td>Quanterix</td><td>101359</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Reação de Biotinilação</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Não pode ser encomendado separadamente</td></tr><tr><td>NHS-PEG4-Biotina</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891195</td><td></td></tr><tr><td>diH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga para tubos de microcentrífuga de 1,7mL (Centrífuga Heraens Fresco 21)</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002478</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice de laboratório padrão (MS2 Minishaker)</td><td>Pipetas IKA</td><td>MS2</td><td></td></tr><tr><td>(10, 20, 200 e 1000 &mu; l)</td> <td>Dicas Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10, 20, 200 e 1000 &mu; l)</td> Tubos de microcentrífuga <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7mL</td><td>Separador magnético Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>que acomoda tubos de microcentrífuga de 1.7mL (Life Technologies DynaMag-2)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga de bancada (Galaxy MinisStar)</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td><td>Reagentes Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Molecule Array (Simoa)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBG, Etiquetas de código de barras de esferas e detectores</td><td>Quanterix</td><td>101652</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de reagentes de 15 mL</td><td>Quanterix</td><td>102411</td><td></td></tr><tr><td>Amostras Simoa Placas de 96 poços</td><td>Quanterix</td><td>101457</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Discs</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td>100001</tr><tr><td>Pontas condutoras Simoa 2.0</td><td>Quanterix</td><td>101726</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Cuvettes</td><td>Quanterix</td><td>100803</td><td></td></tr><tr><td>Simoa SBG Reagent</td><td>Quanterix</td><td>102295</td><td></td></tr><tr><td>Simoa RGP Reagent</td><td>Quanterix</td><td>101736</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 1</td><td>Quanterix</td><td>100486</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 2</td><td>Quanterix</td><td>100487</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de Vedação</td><td>Quanterix</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analisador Simoa HD-1</td><td>Quanterix</td><td>100032</td><td></td></tr><tr><td>Technologies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Array de moléculas únicas (Simoa)</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contagem de moléculas únicas Sistemas de imunoensaio Erenna</td><td>Singluex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana interferon-α

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

O principal objectivo do presente protocolo é descrever o desenvolvimento e validação de um interferon (IFN)-ensaio digital do ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA) de α única molécula matriz. Este sistema permite a quantificação da proteína IFN-α humana com sensibilidade sem precedentes e com nenhuma reactividade cruzada para outras espécies de IFN.
A primeira etapa chave do protocolo é a escolha do par de anticorpos, seguido pela conjugação do anticorpo captura de grânulos paramagnéticos e biotinylation do anticorpo de detecção. Após esta etapa, diferentes parâmetros, tais como configuração de ensaio, concentração de anticorpo do detector e composição do tampão podem ser modificados até que seja alcançada a sensibilidade a melhor. Finalmente, especificidade e reprodutibilidade do método são avaliados para garantir confiança nos resultados. Aqui, nós desenvolvemos um ensaio de matriz única molécula IFN-α com um limite de detecção de 0,69 fg/mL usando alta afinidade auto-anticorpos isolados de pacientes com biallelic mutações na proteína regulador auto-imune (AIRE) causando Poliglandular Auto-imune síndrome tipo 1/autoimune Poliglandular-candidíase-ectodérmica distrofia (APS1/APECED). Importante, estes anticorpos permitiram a deteção de 13 todos os subtipos de IFN-α.
Esta nova metodologia permite a detecção e quantificação de proteína IFN-α em amostras biológicas humanas em concentrações attomolar pela primeira vez. Essa ferramenta será muito útil na monitorização dos níveis desta citocina na saúde humana e Estados de doença, mais particularmente infecção, auto-imunidade e autoinflammation.

Em resumo, um ensaio de matriz única molécula pan-IFN-α com um limite de detecção de 0,69 fg/mL, usando uma configuração de 2-passo com captura de grânulos revestidos com 0,3 mg/mL de anti-IFN-α um anticorpo e anti-IFN-α B deteção anticorpo biotinilado na proporção de biotina: anticorpo 30 foi desenvolvido. As concentrações usadas para biotinilado deteção e SBG foram 0,3 µ g/mL e 150 pM, respectivamente. Este ensaio altamente específico é capaz de detectar todos os 13 subtipos de IFN-α e o cross não reage com outro tipo de IFNs. Assim, enquanto não é possível identificar e quantificar cada espécie individual de IFN-α, todos eles podem ser detectados e medidos juntos, dando um valor de concentração total para IFN-α, que compreende as 13 diferentes subclasses.
Para explorar o potencial valor diagnóstico deste teste recentemente desenvolvido, proteína IFN-α no plasma e no soro de indivíduos saudáveis foram medidos e comparados com amostras de pacientes que sofrem de SLE e JDM. Conforme ilustrado na Figura 7, altos níveis de proteína IFN-α foram detectados em ambas as coortes de doença em comparação com controles saudáveis. A linha pontilhada indica o LOD de um convencional ELISA comercialmente disponível, ilustrando como esta abordagem não detectaria proteína IFN-α nestes grupos de pacientes apesar das associações desta citocina conhecidas com estes fenótipos. Além disso, IFN-α pode ser quantificada sobre 5 registros de magnitude, ilustrando a ampla faixa dinâmica do ensaio, com níveis detectáveis entre 1-10 fg/mL, confirmando a natureza altamente sensível do ensaio.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figura 7: quantificação da proteína IFN-α no plasma e soro do pacientes coortes. Esta figura foi modificada em Rodero et al. 2017. plasma de controles saudáveis (n = 20) e pacientes que sofrem de SLE (n = 72) e JDM (n = 43) foram testados com o ensaio de matriz única molécula pan-IFNα. Análise foi realizada usando o teste de ANOVA One-Way (Kruskal-Wallis) e do Dunn teste entre grupos de comparação múltipla. Mediana é retratada. Linha pontilhada indica LOD de um referência humana anti-IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Considerações sobre</td>
			<td>Referência</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. escolha do par de anticorpo</td>
			<td>Diferentes epitopos alvo</td>
			<td rowspan="3">Tabela 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alta afinidade</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rápido Kna / K lentofora
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. orientação do par anticorpo</td>
			<td rowspan="3">Escolha uma condição com o menor limite de detecção</td>
			<td rowspan="3">Figura 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. capturar a concentração de anticorpos</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. relação de anticorpo biotina: Detector</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs 3-passo de configuração</td>
			<td>Escolher a condição com a maior relação de sinal: fundo</td>
			<td>Figura 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. concentração de anticorpo detector</td>
			<td rowspan="2">Escolha uma condição com o menor limite de detecção</td>
			<td rowspan="2">Figura 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. concentração de SBG</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. especificidade</td>
			<td>Determinar a reactividade cruzada</td>
			<td rowspan="2">Figura 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. sensibilidade</td>
			<td>Avaliar o reconhecimento dos subtipos (se aplicável)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. reprodutibilidade</td>
			<td>Avaliar a variabilidade do ensaio</td>
			<td>Figura 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Resumo das etapas de desenvolvimento e otimização de um ensaio de matriz única molécula. Esta tabela resume os diferentes passos necessários para o desenvolvimento e otimização de um ensaio de matriz única molécula, desde a escolha inicial do par de anticorpo até a avaliação da reprodutibilidade.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigénio</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28,3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22,63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9,02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19,6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2,49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64,7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0,71</td>
			<td>43,2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59,18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0,77</td>
			<td>890,9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: seleção do anticorpo Pan-alfa. IC50 (ng/mL) determinada usando o elemento de resposta interferon-estimulada (ISRE)-ensaio de neutralização de Luciferase. Tabela mostra valores de IC50 de mAbs utilizados no ensaio de matriz única molécula para todos os subtipos de IFN-α. 10.000 células HEK 293 MSR foram semeadas em placas de 96 poços de metade-área brancas e reverso-transfectadas com 50 ng pré-misturado ISRE-Firefly luciferase repórter e construtos de Renilla luciferase usando reagentes de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. A construção do luciferase-expressando serviu como um controle interno de normalização. As células foram incubadas durante a noite em reduzida soro suplementado com aminoácidos não essenciais de 0,1 mM, piruvato de sódio 1 mM, 0,5% de soro bovino fetal a 37º C, 5% de CO2 em um ambiente umidificado. Após a incubação durante a noite, as células foram estimuladas por 24 h com meio contendo misturas de recombinante humano IFN-α com ou sem anti-IFN-α mAbs ou controle IgG que tinha sido pré-incubada durante 1 h a 37 ° C. Após 24h de estimulação, dual luciferase repórter ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. «-» Não determinado. Sifalimumab é um plenamente humano, imunoglobulina G1 κ anticorpo monoclonal que vincula e neutraliza a maioria dos subtipos de IFN-α; Rontalizumab é um anticorpo monoclonal humanizado contra IFN-α. Adaptado de Meyer et al . 2016 e Rodero et al 2017.
Suplementares tabela 1: seleção da orientação do anticorpo, capturar a concentração de anticorpo em grânulos e relação biotinylation. Foram testadas duas possíveis configurações diferentes, usando o A anti-IFN-α como captura anticorpo e anti-IFN-α B como anticorpo de deteção (A) e vice versa (B). IFNα - 2C foi utilizado como antígeno. Captura de diferentes concentrações de anticorpos, bem como relações de biotina: anticorpo (B:A) também foram testadas para ambas as configurações. Saturação (Sat). Laranja: Valores AEB que foram usados para cálculo de LOD; essas concentrações foram consideradas em branco como os valores AEB manteve-se estável. LOD foi calculado como dizer em branco + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementares tabela 2: teste da configuração do passo 3-2 vs. As configurações de etapa 2 e 3 - foram avaliadas usando IFNα - 2C como antígeno. Valores AEB também como sinal/fundo rações (S/B) são mostradas para ambas as condições. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementares tabela 3: otimização de concentração Detector e SBG. Três diferentes concentrações de biotinilado detector (0,1, 0,3 e 0,6 µ g/mL) em conjunto com três diferentes concentrações da SBG (50, 150 e 250 pM) foram avaliados. AEB valores são mostrados para as nove condições testadas. Laranja: Valores AEB que foram usados para cálculo de LOD; essas concentrações foram consideradas em branco como os valores AEB manteve-se estável. LOD foi calculado como dizer em branco + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementares tabela 4: especificidade e sensibilidade do ensaio de matriz de molécula do IFNα otimizado. Enzima média por valores de grânulos são mostrados quando IFN-β, IFN-λ1, λ2-IFN, IFN-ω e IFN-γ proteínas recombinantes foram testaram (A), juntamente com os 16 subtipos de IFN-α (B). «-» Não determinado. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementares tabela 5: reprodutibilidade do otimizado IFNα única molécula matriz ensaio. Os valores médios da AEB para todas as três corridas independentes são mostrados para uma concentração de 10.000 fg/mL. «-» Não determinado. Saturação (Sat). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementares tabela 6: ensaio de competição de proteína. Enzima média por grânulos, os valores são mostrados para todas as condições testadas. As medições foram feitas em duplicado. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Aqui nós apresentamos um protocolo para descrever o desenvolvimento e validação de uma única molécula matriz digital ensaio de ELISA, que permite a detecção de ultra sensível de todos os subtipos de IFN-α em amostras humanas.

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a natureza, regulação e impacto biológico das respostas induzidas pelo interferon em diferentes contextos de doenças, incluindo autoimunidade e infecção. A principal vantagem desta técnica é sua própria sensibilidade presidencial. Esta técnica tem grande potencial para a descoberta de biomarcadores para melhorar o manejo do paciente em muitas doenças, pois pode quantificar citocinas com sensibilidade sem precedentes.Um passo importante com essa abordagem foi neutralizar as atividades relacionadas a pacientes com sistema poliindócrino autoimune tipo um. Para começar, carregue 280 milhões de contas paramagnéticas em um tubo de microcentrífuga, anotando o volume. Em seguida, gire as contas e coloque o tubo em um separador magnético por um minuto.Remova e descarte a solução diluente, isolando assim as contas. Em seguida, lave as contas com BWB duas vezes e BCB duas vezes. Para cada lavagem, adicione 200 microlitros e agite o tubo por cinco segundos.Em seguida, separe as esferas da solução usando o separador magnético. Após um minuto de separação, descarte o diluente. Em seguida, adicione 190 microlitros de BCB por volume de cordão.Em seguida, bata o tubo brevemente, gire o tubo por pulso e coloque as contas lavadas no gelo. Para ativar as contas, combine um mililitro de BCB frio com 10 miligramas de EDC e vortex até que a solução fique homogênea. Trabalhe com rapidez e segurança ao usar o EDC, devido à sua instabilidade inerente e solução equina.Em seguida, adicione 10 microlitros de EDC diluído a frio por volume de cordão à suspensão do cordão e vortex os grânulos brevemente. Em seguida, coloque as contas em uma coqueteleira em temperatura ambiente por 30 minutos. Para conjugar anticorpos com as contas, primeiro o vórtice e o pulso giram as esferas ativadas.Em seguida, coloque as contas em um separador magnético por um minuto e descarte o sobrenadante BCB. Em seguida, remova o tubo do ímã e lave as contas duas vezes com 200 microlitros de BCB. Em seguida, vórtice, giro por pulso e separa magneticamente as esferas para remover o buffer.Em seguida, adicione rapidamente 200 microlitros de anticorpo frio trocado por tampão às esferas ativadas. Depois de transformar os grânulos em solução, coloque a suspensão no agitador de temperatura ambiente por duas horas a 1.000 RPM. Comece dando à suspensão do grânulo revestida de anticorpos um giro de pulso e, em seguida, use a coluna magnética para remover o tampão.Em seguida, verifique a concentração da proteína no tampão. Use um espectrofotômetro de baixo volume. Neste ponto, os anticorpos são acoplados aos grânulos e qualquer valor acima de zero significa que os grânulos estão saturados com anticorpos.Agora, lave as esferas com 200 microlitros de BWB, como realizado em todas as lavagens anteriores. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo e verifique a concentração de proteína. A quantificação das proteínas liberadas dos grânulos permite a medição do acoplamento de anticorpos.Em seguida, lave novamente as esferas com 200 microlitros de BWB. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio de esferas, vortex o tubo por cinco segundos e transfira-o para o agitador de temperatura ambiente por 30 minutos. Após 30 minutos, as contas serão bloqueadas.Em seguida, lave-os uma vez com 200 microlitros de BWB, seguido de lavá-los duas vezes com 200 microlitros de tampão diluente de esferas para cada lavagem. Em seguida, armazene os grânulos revestidos e bloqueados em 200 microlitros de tampão diluente de grânulos a quatro graus Celsius. Esta seção do vídeo sugere estratégias de como ajustar as condições do ensaio usando o software analisador de matriz de molécula única na configuração de cerveja caseira.Comece testando diferentes combinações de grânulos conjugados de anticorpos de captura e anticorpos de detecção de biotinilação em ambas as combinações de anticorpos. Em seguida, testar combinações das três diferentes concentrações de anticorpos de captura com duas taxas de biotinilação diferentes para detecção e captura de anticorpos e vice-versa. Em seguida, escolha a combinação que oferece o nível mais baixo de detecção e use-a para outras etapas.Nesse caso, uma proporção de 30 para um de biotina para anticorpo fornece o melhor limite de detecção. Em seguida, compare uma configuração de duas etapas com uma configuração de três etapas. As configurações de três etapas têm três etapas de incubação diferentes.Um com o anticorpo de captura, um com o anticorpo de detecção e um terceiro final para a marcação da enzima SBG. As configurações de duas etapas combinam as incubações de captura e detecção. Execute o analisador de matriz de molécula única usando as concentrações e rações de anticorpos de captura e detector selecionadas nas configurações de duas e três etapas, pré-configuradas no analisador, seguindo as instruções do fabricante.Em seguida, escolha a configuração que permite a maior sensibilidade e mantenha-a para etapas futuras. Nesse caso, a configuração de duas etapas oferece uma sensibilidade ligeiramente maior em cada ponto de teste. Em seguida, otimize as concentrações do anticorpo detector e do SBG.Teste três concentrações diferentes de anticorpo detector com três concentrações diferentes de SBG. Escolha as concentrações que dão a maior sensibilidade e guarde-as para as etapas futuras. Nesse caso, 0,3 microgramas por mililitro de anticorpo e 150 PBG molar pica têm o nível ideal de detecção com baixos níveis de fundo com amplitude média fortuita.Para etapas adicionais de otimização, consulte o protocolo de texto. Nele existem procedimentos para otimizar a especificidade e reprodutibilidade do ensaio e um ensaio para competição de proteínas. Usando um ensaio otimizado para detectar 13 subclasses de interferon-alfa, plasma e soro foram analisados em pacientes com LES, pacientes com DMJ e controles saudáveis.Altos níveis de proteína interferon-alfa foram detectados em ambas as coortes da doença. A linha pontilhada indica o nível de detecção de um Eliza convencional, disponível comercialmente, que não detectaria a proteína interferon-alfa nesses grupos de pacientes, apesar do papel conhecido dessa citocina nessas doenças. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como desenvolver e validar um ensaio de matriz de moléculas únicas para a análise de sua escolha.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que durante a escolha celular de anticorpos é. Desde o seu desenvolvimento, este ensaio permitiu uma melhor caracterização do papel do interferon-alfa em uma diversidade de doenças e infecções autoimunes. Este ensaio também serviu para monitorar as respostas a novas terapias e identificar os atores celulares responsáveis por certos distúrbios autoimunes.

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Research

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

A caracterização de epítopos de células T de patógenos que causam infecções localizadas, como o papilomavírus humano, é um desafio devido ao número limitado de células T em circulação. É descrito um método no qual células T raras foram isoladas e caracterizadas a partir de um número muito pequeno de células.

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Usando a tecnologia Luminex Corporation microesfera xMAP, desenvolvemos o imunoensaio multiplexado fluorométrico (MFIA) para serovigilância de várias espécies de animais de laboratório. O MFIA é um microarray de suspensão onde o antigénio controlo de tecido, ou imunoglobulinas são ligados covalentemente a um código de cores de poliestireno microesferas. O método de ensaio MFIA, bem como vários tópicos de resolução de problemas é abordada.

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Usando uma estratégia de microarray de glicano impresso, um ensaio convencional de placa de 96 poços foi miniaturizado para análise da avidez e especificidade da hemaglutinina do vírus influenza A para receptores contendo ácido siálico.

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