Fita de estomas-casca: Um método melhorado para preparação de amostras de células de guarda

O objetivo geral deste experimento é preparar células-guarda de estômatos enriquecidas de alta qualidade para análises fisiológicas, bioquímicas e moleculares, como transcriptômica, proteômica e metabolômica. Olá, meu nome é Sheldon Lawrence. Sou estudante de pós-graduação no laboratório do Dr. Chen no Departamento de Biologia da Universidade da Flórida.

Hoje, vou mostrar como isolar células-guarda do tecido foliar da planta que são materiais úteis para estudar a fisiologia e a biologia dos estômatos. Este método é considerado um novo método para isolar células-guarda. Ele permite especificamente o enriquecimento de células-guarda intactas e fornece amostras confiáveis para o estudo dos processos de sinalização das células estômatas.

A aplicação deste método pode se estender a plantas Brassicaceae e outras espécies de plantas com apenas pequenas modificações no protocolo. A demonstração é importante, pois o principal passo para enriquecer as células de guarda pode ser um desafio. Para começar, selecione plantas maduras de Arabidopsis com cinco semanas de idade.

Remova cuidadosamente uma folha com um bisturi, cortando a folha na base. Pegue dois pedaços de fita adesiva e coloque a folha excisada entre eles. Aplique pressão suavemente em ambos os lados, garantindo que a extremidade dos pedaços de fita não adira.

Isso pode ser feito inserindo um dedo entre eles. Remova suavemente os dois pedaços de fita um do outro e flutue imediatamente a casca retirada do lado abaxial da folha para o tampão de abertura dos estômatos. Depois que todas as cascas forem coletadas, coloque-as sob a luz.

Deixe-os lá por duas horas. Pegue várias cascas e coloque-as em lâminas de microscópio. Usando um microscópio de luz, ajuste as lentes para visualizar as células-guarda e certifique-se de que estejam abertas.

Coloque as cascas em 50 ml da solução enzimática de digestão da parede celular. Flutue e incube-os a 26 graus Celsius. Após 20 minutos, remova as cascas da solução enzimática e enxágue duas vezes brevemente com água deionizada e coloque em tampão de abertura de estômatos frescos.

Moa as cascas em um pilão com nitrogênio líquido, com um pilão. Em seguida, execute a extração de fenol conforme descrito no texto. Depois de moer as cascas em um pilão, transfira o extrato, junto com as cascas, para um tubo de centrífuga Oak Ridge e agite em uma coqueteleira por uma hora a quatro graus Celsius.

Precipite as proteínas extraídas de fenol adicionando cinco volumes de acetato de amônio 0,1 mol gelado em 100% de metanol. Depois de precipitar a proteína durante a noite a 20 graus Celsius, colha a proteína por centrifugação e faça lavagens de pellets conforme descrito no texto. Ressuspenda o pellet em um mililitro de acetona fria e transfira para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.

Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante de acetona e secar o sedimento durante dez minutos. Dissolva a amostra de proteína em um tampão de dissolução. Após vórtice e centrifugação, recolher o sobrenadante e medir a concentração de proteínas.

Execute um gel SDS-PAGE. Visualize as bandas de proteína separadas e observe a qualidade relativa da proteína. Esta é uma imagem representativa das células-guarda de Arabidopsis antes e depois da digestão enzimática do mesofilo e das células epidérmicas.

A viabilidade das células-guarda antes e após a remoção do mesofilo e das células epidérmicas pode ser observada usando diacetato de fluoresceína, que mede a atividade enzimática e a integridade da membrana celular. Como você pode ver, as células-guarda ainda são viáveis após o peeling e a digestão enzimática. Este exemplo ilustra o movimento dos estômatos de Arabidopsis em resposta ao tratamento com ABA.

As células-guarda respondem ao tratamento e a abertura dos estômatos diminui mais de 50% após 30 minutos de tratamento com ABA. Aqui está um curso temporal do movimento dos estômatos. Além disso, uma imagem representativa da abertura dos estômatos em cada ponto de tempo é mostrada.

A detecção, separação e abundância relativa de proteínas são observadas por SDS-PAGE. As bandas são claras e distintas. Quatro réplicas biológicas são incluídas para enfatizar a reprodutibilidade da extração de proteínas a partir deste método.

Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando tentamos correlacionar as mudanças moleculares das células-guarda em tempo real com o movimento dos estômatos. Uma vez dominada, uma amostra de proteína de células-guarda dos estômatos pode ser preparada em poucas horas e pode ser usada em vários experimentos. É importante lembrar de não infligir uma grande quantidade de danos às células-guarda durante o descascamento e manuseio.

Seguindo este método, outras técnicas podem ser aplicadas para investigar a sinalização de células-guarda, como a marcação isobárica para estudar a resposta redux de proteínas em plantas em condições normais e de estresse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e enriquecer células-guarda intactas e viáveis, bem como extrair proteínas de alta qualidade apropriadas para estudos posteriores.