Name: Fita de estomas-casca: Um método melhorado para preparação de amostras de células de guarda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a isolar células-guarda intactas de tecido foliar para análises fisiológicas e bioquímicas. Este método melhorado enriquece amostras de estômatos para estudos de sinalização celular em plantas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Daniel Chen na Digital vídeo produção equipe de Buchholz High School para assistência na edição do vídeo. Esta pesquisa sobre estomáticas células de guarda, proteómica e metabolómica no laboratório de Chen foi apoiada por concessões nos National Science Foundation (0818051, 1158000 e 1412547). Wenwen Kong é suportado pelo Conselho da bolsa de China. Dr. Qiuying Pang é suportado pela China Scholarship Council e Fundação Nacional de ciências naturais da China (31570396).

1. cultivo de plantas
<ol><li>Germinar as sementes na mistura de potting. Cultivar plantas em uma câmara de crescimento com uma intensidade luminosa de 140 µmol fótons m− 2 s − 1 e um fotoperíodo de luz h 8 a 22 ° C e 16 h escuro a 18 ° C durante 2 semanas.</li>
	<li>Transplante de mudas de tamanhos similares individualmente em 4" potenciômetros de diâmetro contendo o solo e crescer para um adicional 3 semanas nas mesmas condições descritas no passo 1.1. Nota: Regar plantas com água da torneira duas vezes por semana para manter o solo úmido.</li>
</ol>2. preparação dos estomas enriquecidas
<ol><li>Retire as folhas de plantas da . thaliana 5 - semana de idade individuais com um bisturi.</li>
	<li>Anexe cada folha a dois pedaços de fita adesiva clara, com uma peça aderindo ao lado abaxial (inferior) e o outro pedaço, aderindo ao lado (superior) adaxial da folha. Deixe a fita da folha para 5 s.</li>
	<li>Suave peel separado os dois pedaços de fitas usando o dedo indicador e o polegar em cada mão para separar o lado abaxial com pavimento e guarda as células e o lado adaxial com células do mesofilo.</li>
	<li>Lugar as cascas do lado abaxial das folhas em 60 mL de estomas abertura de buffer (50 mM KCl, 10mm MES-KOH, ajustado ao pH 6.2 com 1m KOH) no tamanho de 40 mm × 12 mm Petri pratos como eles são coletados.<ol>
<li>Repita os passos acima até que todas as cascas de amostra são coletadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque os pratos de Petri contendo as cascas para a câmara de crescimento sob condições de luz indicado no passo 1.1. Deixe as cascas sob a luz para 2h abrir completamente os estomas.</li>
	<li>Lugar de cascas em uma 150 x 20 mm placa de Petri contendo 50 mL de parede celular, digerindo a mistura de enzimas (celulase 0,7% R-10, macerozyme de 0.025% R-10, 0,1% (p/v) polivinilpirrolidona-40 e albumina de soro bovino 0.25% (p/v) em solução básica de 55% (0,55 M sorbitol, 0.5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, ácido ascórbico de 0,5 mM, 10 µM KH2PO4, 5mm 4-morpholineethanesulfonic ácido (MES) em pH 5,7 ajustado com 1m KOH).</li>
	<li>Agite as cascas num agitador recíproco em uma placa de Petri a 50 rpm por 20 min.</li>
	<li>Retire as cascas solução enzimática com pinça depois de 20 min. Transfira as cascas para um prato de Petri 150 x 20 mm tamanho contendo 50 mL de água.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta de transferência, lave as cascas por 15 s duas vezes com 10 mL de água para remover qualquer solução de enzima residual.</li>
	<li>Use uma pinça para colocar as cascas em um prato de Petri tamanho 150 x 20 mm com 50 mL de estomas frescas abrindo reserva como usado na etapa 2.4. Incube durante 1 h em condições de luz indicado no passo 1.1 para permitir que os estomas recuperar.</li>
</ol>3. ácido abscísico (ABA) tratamento e ensaio de movimento de estomas
<ol><li>Em um prato de Petri tamanho 150 x 20 mm. Incube as cascas de estomas enriquecido a 30° C por 15 min em 50 mL de tampão de abertura estomática ou em 50 mL de tampão de abertura estomática, com uma concentração final de 10 µM ABA para o tempo de tratamento adequado.</li>
	<li>Coloque as cascas num agitador a 50 rpm para 5, 15 e 30 min. Depois de cada intervalo de tempo remover a casca com uma pinça e siga os passos da imagem latente na etapa 3.3.</li>
	<li>Com imagens dos estomas antes do tratamento ABA e nos vários pontos de tempo após o tratamento ABA com um microscópio de luz.<ol>
<li>Pegue uma casca e coloque-a sobre uma lâmina de vidro de microscópio.</li>
		<li>Coloque o slide no palco microscópio e ajustar o estágio para que a imagem da casca pode ser visualizada.</li>
		<li>Ajustar a multa e curso foco no microscópio para obter uma imagem clara das células guarda.</li>
		<li>Com várias imagens dos estomas múltiplos ampliação de 40 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir 60 aberturas estomáticas usando o ImageJ8.</li>
	<li>Calcule o erro padrão e o significado em um p-valor < 0,05 das 60 medições abertura estomática.</li>
</ol>4. proteína extração e separação de SDS-Page
<ol><li>Triture as cascas por 15 s em suficiente nitrogênio líquido para cobrir as cascas usando um pilão refrigerados.</li>
	<li>Por 50 cascas, adicionar 3 mL de fenol saturado de Tris (pH 8,8) e 3 mL de tampão de extração da proteína (0,9 M de sacarose, 0.1 M Tris-HCl, EDTA 0,01 M, 0,4% 2-Mercaptoetanol, 10 µ l de inibidor de protease e fosfatase de 1mm) com uma pipeta para o almofariz e depois triturar as cascas para 5 addi cional de minutos em uma coifa.</li>
	<li>O extrato usando uma pipeta de transferência e as cascas usando uma pinça de metal para um Oakridge centrifugar o tubo e agitar um agitador a 50 rpm durante 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Retire as cascas do tubo de centrífuga Oakridge e centrifugar o extrato em 5.000 x g durante 10 minutos. Em seguida, a fase superior fenólica de transferência para um novo tubo limpo microcentrífuga usando uma pipeta.</li>
	<li>Precipitado o fenol extraído de proteínas adicionando 5 volumes de acetato de amônio 0,1 M gelado em metanol 100%. Vórtice brevemente e incubar durante uma noite a-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 20.000 x g a 4 ° C por 20 min, decante o sobrenadante derramando lentamente fora do tubo e reter a pelota de proteína no tubo.</li>
	<li>Lavar o sedimento de proteína, duas vezes com acetato de amônio 0,1 M em metanol e então duas vezes com acetona 80% e uma vez com 100% de acetona gelada. Nota: Lavagens são feitas pela adição de 10 mL do reagente especificado para o tubo de proteína. Agite em uma coqueteleira a 50 rpm por 5 min, seguido por centrifugação a 15.000 x g a 4 ° C por 10 min. Em seguida, despeje o reagente fora do tubo, mantendo apenas a pelota de proteína.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de acetona gelada de 100% para a pelota e ressuspender pipetando lentamente subindo e descendo.</li>
	<li>Transferência de suspensão de proteínas via pipeta para um tubo de microcentrífuga de 2 mL, em seguida, centrifugar a 20.000 x g a 4 ° C por 5 min.</li>
	<li>Remover a acetona por decantação é de tubo e secar a pelota em coifa por 10 min.</li>
	<li>Dissolver a proteína em um tubo de centrífuga de micro com 200 µ l de tampão de dissolução (8 M de ureia, 0,5% SDS, 30 mM Tris-HCl pH 8,5) e vórtice de 30 min. centrifugar a 20.000 x g a 15 ° C por 20 min e recolher o sobrenadante em um novo tubo.</li>
	<li>Quantificar a concentração de proteína, seguindo o protocolo de quantificação de proteína9.</li>
	<li>Use amostras da proteína para separação de proteínas por eletroforese em gel seguindo o protocolo de10.</li>
</ol>

<ol><li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+interactions+in+stomatal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li>
<li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.52.1.627">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li>
<li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li>
<li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.0028-646X.2001.00329.x">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li>
<li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Dependence+Of+K%2B+Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li>
<li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10(2009).</li>
<li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll%2C+epidermal+and+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li>
<li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents%2C+chaotropes%2C+dyes%2C+and+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac0262560">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Guarda as células são um sistema de modelo para estudar os mecanismos de transdução de sinal nas plantas e é importante garantir que a preparação de amostras utilizadas no estudo é o mais adequado para responder às perguntas biológicas. Apesar do crescente interesse em células de guarda dentro da comunidade de pesquisa de planta, não existe nenhum método universal sobre como preparar estomáticas células guarda que permita o movimento estomático e fisiologia bem como as alterações moleculares para ser estudado em um siste...

Estomas desempenham um papel importante na fisiologia geral e adequação das plantas. Estas estruturas específicas de pequena planta são formadas por duas células epidérmicas especializadas conhecidas como células de guarda e são encontradas mais abundantemente na superfície abaxial das folhas. Estomas são necessárias para a troca de gases entre a planta e a atmosfera, bem como o controle da perda de água através da transpiração. Guarda as células regulam a abertura de estômatos, através da integração de diferente externa (por exemplo, luz, umidade, contato do patógeno, os níveis de dióxido de carbono) e interna (ex., hormônios endógenos) estímulos1,2. Nos últimos 20 anos, este tipo de célula tornou-se um modelo de sistema para sinalização de processos em plantas de celular estudando. Essas células compõem uma pequena fração das células totais em uma folha; assim, para investigar seu celular exclusivo, propriedades bioquímicas e moleculares de uma célula única forma, é necessário isolá-los de outros tipos de células da folha. No passado, estudos de célula guarda muitas vezes envolveram a preparação da célula guarda protoplastas (GCP)3,4,5. Isto normalmente requer o uso de grandes quantidades de enzimas degradantes de parede celular e/ou ruptura mecânica através de mistura e tem provado ser dispendioso e demorado, que geralmente leva muitas horas para preparar uma amostra GCP, muitas vezes vezes com pouco rendimento. Mais importante, porque as células guarda atuar como pares completas para regular a abertura de estômatos, o uso do GCP pode ser visto como um sistema artificial para estudar a sinalização da pilha de guarda.
Aqui, nós desenvolvemos um método para preparar estomas na qual células intactas de guarda são enriquecidas e manter respostas fisiológicas aos estímulos. Este método foi inspirado por um método que foi usado para isolar o mesofilo célula protoplastas6,7. Em nosso método, estomas são preparadas com clara de fita adesiva para separar primeiro a maioria das células do mesofilo anexado à camada adaxial da folha da camada abaxial contendo o pavimento e as células de guarda. Isso é feito pela aposição de um pedaço de fita para cada lado da folha e descascá-las separadas. As células da camada abaxial podem recuperar sob a luz em um buffer de estomas-abertura. Mais tarde, as células restantes do pavimento são removidas usando uma pequena quantidade de parede celular degradante enzimas, deixando para trás células guarda que são enriquecidos na fita.
Neste método simples, estomáticas células guarda que sejam viáveis e responsivo pode rapidamente e eficientemente ser preparado, tendo menos de uma hora para obter células de guarda estomáticas enriquecidas de 50 cascas com um custo mínimo. O método aqui impõe menos danos às células da planta do que métodos anteriores, onde os protoplastas são preparados. Além disso, materiais colhidos este quantidades de proteína desejável de rendimento de método. O mais importante, porque a folha não está sujeita a mistura ou tempos de digestão demorada e guarda as células permanecem intactas, os resultados dos estudos mais estreita será relevantes para que um guarda do natural da biologia das células. Com este método, estomáticas movimentos possam ser correlacionados em tempo real com as mudanças a nível molecular. Assim, o conhecimento adquirido com estudos usando esse método de preparação seria importante para uma compreensão mais abrangente da sinalização celular de guarda.
Usamos a planta Arabidopsis thaliana como modelo; no entanto, este protocolo pode ser aplicado para o enriquecimento das células de guarda estomáticas em outras espécies de plantas tais como Brassica napus com pequenas modificações no tempo de digestão. Como uma prova de conceito, temos demonstrado que células de guarda estomáticas enriquecidas através deste método são viáveis e responsivo a estímulos como mostrado pelo ensaio de fluoresceína diacetato (FDA) e estudos utilizando hormônio vegetal ácido abscísico (ABA), respectivamente. Além disso, Nós demonstramos que proteínas de alta qualidade podem ser isoladas destas células guarda. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado desse processo.

<table><tbody><tr><td>Bisturi Cirúrgico de Aço Inoxidável</td><td>Feather&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>NC9999403</tr><tr><td>Fita Adesiva (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>Celulase (Onozuka R-10)&nbsp;</td><td>Yakult Indústria Farmacêutica Co., Ltd.</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Indústria Farmacêutica Co., Ltd.</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>DM6000B Microscópio&nbsp;</td>Coquetéis Inibidores de Protease e Fosfatase <td>da Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>PI78443</tr><tr><td>Tubos de centrífuga PPCO de alta velocidade Oak Ridge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>Kit de quantificação de proteína EZQ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>Diacetato de fluoresceína (FDA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Ácido abscísico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>BWI Companies&nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Microcentrífuga (2mL)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td> Pinças <td>do Instituto Nacional de Saúde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldado</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

fita de estomas-casca: um método melhorado para preparação de amostras de células de guarda

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

O estudo das células guarda é essencial para o conhecimento das contribuições específicas deste tipo de célula para a função global de plantas. No entanto, muitas vezes é difícil isolar e, portanto, estudá-los muitas vezes fornece um desafio.
Este estudo estabelece um método de enriquecimento de célula estomática de guarda. O protocolo utiliza fita adesiva para isolar as células guarda e extrair as proteínas das células. Esse método melhora a integridade e o rendimento da célula guarda durante o isolamento e fornece uma amostra confiável para o estudo dos processos de sinalização celular e como eles se correlacionam com fenótipos movimento estomático. Neste método, as folhas da planta foram particionadas entre duas partes da fita e pedaços descascadas para remover o lado abaxial. Este protocolo foi aplicado ao tecido de folha de Arabidopsis para isolar as células guarda. As células foram tratadas com diacetato de fluoresceína (FDA) para determinar a viabilidade e com ácido abscísico (ABA) para avaliar o movimento de estômatos em resposta a ABA. Em conclusão, este protocolo prova útil para preparar células de guarda estomáticas enriquecidas e isolar proteínas. A qualidade das células e proteínas obtidas aqui enable fisiológico e outros estudos biológicos.

Uma imagem representativa de Arabidopsis guarda células antes e após a digestão do mesofilo e as células epidérmicas é mostrado na Figura 1. Viabilidade celular de guarda antes e após a remoção do mesofilo e as células epidérmicas pode ser observada usando o FDA para medir a atividade enzimática e a integridade da membrana celular (figura 1B e 1D). A Figura 2 ilustra o movimento esto...

Este protocolo descreve um método de preparação estomáticas enriquecidas guarda células que é útil para estudos biológicos fisiológicos e outros.

Fita de estomas-casca: Um método melhorado para preparação de amostras de células de guarda

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

O objetivo geral deste experimento é preparar células-guarda de estômatos enriquecidas de alta qualidade para análises fisiológicas, bioquímicas e moleculares, como transcriptômica, proteômica e metabolômica. Olá, meu nome é Sheldon Lawrence. Sou estudante de pós-graduação no laboratório do Dr. Chen no Departamento de Biologia da Universidade da Flórida.Hoje, vou mostrar como isolar células-guarda do tecido foliar da planta que são materiais úteis para estudar a fisiologia e a biologia dos estômatos. Este método é considerado um novo método para isolar células-guarda. Ele permite especificamente o enriquecimento de células-guarda intactas e fornece amostras confiáveis para o estudo dos processos de sinalização das células estômatas.A aplicação deste método pode se estender a plantas Brassicaceae e outras espécies de plantas com apenas pequenas modificações no protocolo. A demonstração é importante, pois o principal passo para enriquecer as células de guarda pode ser um desafio. Para começar, selecione plantas maduras de Arabidopsis com cinco semanas de idade.Remova cuidadosamente uma folha com um bisturi, cortando a folha na base. Pegue dois pedaços de fita adesiva e coloque a folha excisada entre eles. Aplique pressão suavemente em ambos os lados, garantindo que a extremidade dos pedaços de fita não adira.Isso pode ser feito inserindo um dedo entre eles. Remova suavemente os dois pedaços de fita um do outro e flutue imediatamente a casca retirada do lado abaxial da folha para o tampão de abertura dos estômatos. Depois que todas as cascas forem coletadas, coloque-as sob a luz.Deixe-os lá por duas horas. Pegue várias cascas e coloque-as em lâminas de microscópio. Usando um microscópio de luz, ajuste as lentes para visualizar as células-guarda e certifique-se de que estejam abertas.Coloque as cascas em 50 ml da solução enzimática de digestão da parede celular. Flutue e incube-os a 26 graus Celsius. Após 20 minutos, remova as cascas da solução enzimática e enxágue duas vezes brevemente com água deionizada e coloque em tampão de abertura de estômatos frescos.Moa as cascas em um pilão com nitrogênio líquido, com um pilão. Em seguida, execute a extração de fenol conforme descrito no texto. Depois de moer as cascas em um pilão, transfira o extrato, junto com as cascas, para um tubo de centrífuga Oak Ridge e agite em uma coqueteleira por uma hora a quatro graus Celsius.Precipite as proteínas extraídas de fenol adicionando cinco volumes de acetato de amônio 0,1 mol gelado em 100% de metanol. Depois de precipitar a proteína durante a noite a 20 graus Celsius, colha a proteína por centrifugação e faça lavagens de pellets conforme descrito no texto. Ressuspenda o pellet em um mililitro de acetona fria e transfira para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante de acetona e secar o sedimento durante dez minutos. Dissolva a amostra de proteína em um tampão de dissolução. Após vórtice e centrifugação, recolher o sobrenadante e medir a concentração de proteínas.Execute um gel SDS-PAGE. Visualize as bandas de proteína separadas e observe a qualidade relativa da proteína. Esta é uma imagem representativa das células-guarda de Arabidopsis antes e depois da digestão enzimática do mesofilo e das células epidérmicas.A viabilidade das células-guarda antes e após a remoção do mesofilo e das células epidérmicas pode ser observada usando diacetato de fluoresceína, que mede a atividade enzimática e a integridade da membrana celular. Como você pode ver, as células-guarda ainda são viáveis após o peeling e a digestão enzimática. Este exemplo ilustra o movimento dos estômatos de Arabidopsis em resposta ao tratamento com ABA.As células-guarda respondem ao tratamento e a abertura dos estômatos diminui mais de 50% após 30 minutos de tratamento com ABA. Aqui está um curso temporal do movimento dos estômatos. Além disso, uma imagem representativa da abertura dos estômatos em cada ponto de tempo é mostrada.A detecção, separação e abundância relativa de proteínas são observadas por SDS-PAGE. As bandas são claras e distintas. Quatro réplicas biológicas são incluídas para enfatizar a reprodutibilidade da extração de proteínas a partir deste método.Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando tentamos correlacionar as mudanças moleculares das células-guarda em tempo real com o movimento dos estômatos. Uma vez dominada, uma amostra de proteína de células-guarda dos estômatos pode ser preparada em poucas horas e pode ser usada em vários experimentos. É importante lembrar de não infligir uma grande quantidade de danos às células-guarda durante o descascamento e manuseio.Seguindo este método, outras técnicas podem ser aplicadas para investigar a sinalização de células-guarda, como a marcação isobárica para estudar a resposta redux de proteínas em plantas em condições normais e de estresse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e enriquecer células-guarda intactas e viáveis, bem como extrair proteínas de alta qualidade apropriadas para estudos posteriores.

stomata-tape-peel-an-improved-method-for-guard-cell-sample-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A base molecular do espaço-respostas específicas fitocromo está sendo investigado o uso de plantas transgênicas que apresentam tecidos e órgãos específicos deficiências fitocromo. O isolamento de células específicas exibindo esgotamento cromóforo fitocromo induzida por fluorescência-Activated Celular classificação seguido por análises de microarray está sendo utilizada para identificar genes envolvidos em respostas espaciais específicos fitocromo.

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em

Nós desenvolvemos um protocolo simples e reprodutível para acessar a resposta estomática ao bactérias vivas. Este método minimiza ferimento e manipulação da folha, em comparação com o uso de peelings epidérmicos relatado anteriormente.

Avaliar a resposta estomática ao vivo células bacterianas usando imagens Folha Inteira

Este artigo descreve os métodos para o rastreio dos genes que controlam a permeabilidade plasmodesmal e inclinação, portanto, auxina durante a resposta trópico. Isto inclui a medição do grau de resposta trópico no hipocótilo   da Arabidopsis thaliana e verificar a permeabilidade plasmodesmal pelo ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trissulfónico carregamento (HPTS) e avaliação do nível de finalmente calejado.

Uma estratégia para validar o papel da mediada por calejado Plasmodesmal Gating na Tropic Response

O relógio circadiano regula a cerca de um terço do transcriptoma de Arabidopsis, mas a percentagem de genes que se alimentam de volta para cronometragem permanece desconhecida. Aqui nós visualizamos um método para avaliar rapidamente os fenótipos circadianos em qualquer linha mutante de Arabidopsis utilizando imagens luminescentes de um repórter circadiano transitoriamente expressa em protoplastos.

Rápida análise de fenótipos circadianos em Arabidopsis Protoplastos transfectadas com um relógio Reporter luminescentes

Os métodos existentes para a modificação de plantas têm aplicabilidade limitada. A nova tecnologia derivada de peptídeos proposta aqui promete simplicidade e eficiência na introdução de proteínas ou genes exógenos nos compartimentos intracelulares desejados de plantas intactas.

Peptídeo derivado Método para Transporte genes e proteínas Através Celular e Barreiras organelares em plantas

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

O objetivo do presente protocolo é demonstrar como induzir estomas clusterizadas em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo açúcar e como observar estruturas intracelulares como cloroplastos e microtúbulos nas células guarda clusterizados usando confocal laser microscopia.

Um sistema de indução de estomas agrupado por tratamento de imersão de solução de açúcar em plântulas de Arabidopsis thaliana

Este trabalho descreve dois métodos de fenotipagem sem o uso de cascas epidérmicas para caracterizar os genes que controlam o desenvolvimento estomatizante. O primeiro método demonstra como analisar um fenótipo estomatal usando uma epiderme vegetal corada com O azul de toluidina . O segundo método descreve como identificar ligantes estomatáticos e monitorar suas atividades biológicas.

Identificação dos genes envolvidos no desenvolvimento estomático via Epidermal Phenotype Scoring

Aqui, apresentamos um método simples para observação direta e medida automatizada das respostas estomáticas à invasão bacteriana em Arabidopsis thaliana. Esse método utiliza um dispositivo portátil de imagem estomática, juntamente com um pipeline de análise de imagem projetado para imagens foliares capturadas pelo dispositivo.

Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Este protocolo apresenta um método comparativo para avaliar características estomáticas e epidérmicas em duas espécies distintas, utilizando peelings epidérmicos, técnicas de limpeza e análise de imagem assistida por IA. O objetivo é possibilitar a quantificação reprodutível e de alta capacidade das estruturas celulares subjacentes à função estomática para aplicações agrícolas e pesquisas amplas sobre plantas.

Caracterização de Características Estomáticas e Epidérmicas Usando Peelings, Clearing e Análise de Imagens Baseadas em IA

Aprenda a isolar células-guarda intactas de tecido foliar para análises fisiológicas e bioquímicas. Este método melhorado enriquece amostras de estômatos para estudos de sinalização celular em plantas.

Fita de estomas-casca: Um método melhorado para preparação de amostras de células de guarda

Explorar mais vídeos