Name: Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda métodos simples para detectar amiloides citotóxicos após infecção de células endoteliais pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo confiável gera dados reproduzíveis para estudos in vitro e in vivo.

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Esta pesquisa foi financiada em partes por subvenções de NIH HL66299 TS, RB e SL, HL60024 de TS e HL136869 para MF.

Todos os procedimentos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de cuidado Animal da Universidade do Sul do Alabama e institucional e foram realizados em conformidade com todas as regulamentações federais, estaduais e locais. Culturas primárias de rato pulmonar microvascular células endoteliais (PMVECs) foram obtidas da instalação de núcleo de cultura de célula Center da Universidade do Sul do Alabama para biologia do pulmão. As células foram preparadas usando os procedimentos descritos anteriormente16.
1. geração de sobrenadantes citotóxicos
Nota: Aqui, usamos dois diferentes cepas de p. aeruginosa: PA103, que tem um sistema de secreção do III tipo intacto capaz de transferir os exoenzymes ExoU e ExoT para células-alvo durante a infecção e ∆PcrV, que carece de um tipo sistema do secretion de III e é incapaz de transferir exoenzymes para células-alvo após a inoculação.
<ol><li>Raia de bactérias para a de placas de ágar Vogel-Bonner (VB)17 e crescer durante a noite a 37 ° C.<ol>
<li>Para preparar pratos, faça a seguinte solução estoque (sais de Vogel-Bonner; estoque de x 10): medir 2 g MgSO4, ácido cítrico de 20g (ácido livre), 100 g K2PO4e 35 g NaH2PO4. Adicione ddH2O de 1L e autoclave por 15 min com escape lento.</li>
		<li>Coloque 7,5 g ágar-ágar em 450ml ddH2O e autoclave como acima.</li>
		<li>Após a autoclavagem, Coloque ambas as soluções em um banho de água de 50 ° C para esfriar.</li>
		<li>Adicione 50 mL da solução de sal estoque de 10 x VB a agar.</li>
		<li>Adicionar carbenicilina a 400 µ g/mL (para as cepas de p. aeruginosa sendo usado) e misturar bem, agitando o frasco.</li>
		<li>Lugar 5 mL da solução de ágar de VB em pratos individuais cultura estéril, permitir que o agar para solidificar e em seguida armazenar a 4 ° C até o dia da semeadura bacterianas.</li>
		<li>No dia da semeadura bacterianas, pré-aquecer uma placa a 37 ° C e em seguida marcam as bactérias na placa utilizando uma ansa estéril. Lugar a placa em uma incubadora de 37 ° C durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verificar a pureza PMVEC pela coloração positiva com fluorescente Griffonia simplicifolia lectina e coloração negativa com fluorescentes Helix pomatia lectina (um marcador para células endoteliais arteriais). Alíquotas células e congelamento em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Para experiências, manter as células em modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e desenvolvem-se células em uma incubadora de 37 ° C, contendo 5% de CO2. Use células em passagens 5-15.<ol>
<li>Para geração de sobrenadantes citotóxicos, placa de 2 x 106 células em pratos individuais 150cm e crescer por 3-4 dias até alcançar a confluência. Use duas placas por experiência (veja abaixo).</li>
		<li>Para análise dos sobrenadantes citotóxicos, células de placa 1 x 105 em poços individuais de um poço-6 prato e crescerem durante quatro dias até alcançar a confluência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para produzir o sobrenadante, lavar um dos pratos de PMVECs dois 150cm da etapa 1.3.1 com tampão fosfato salino, trypsinize e depois contar as células (use um contador de célula automatizada e seguir o protocolo do fabricante; ver Tabela de materiais). Lavar o outro prato de PMVECs com Hank está equilibrado sal solução (HBSS) e então infectar com qualquer estirpe de p. aeruginosa em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20:1. Isto é conseguido da seguinte forma:<ol>
<li>Para p. aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 CFUs/mL. Para preparar esta diluição, adicione 1 mL HBSS para uma cubeta descartável de 1ml. Raspe bastante bactérias do prato que foi preparada no passo 1.1 até uma OD540 de 0,25 é alcançado quando medido utilizando um espectrofotômetro. O próximo passo irá fornecer um cálculo de quanto serão necessário bactérias.</li>
		<li>Uma vez que o número de PMVECs a placa de cultura é determinado (etapa 1.4 acima), determinar o número apropriado de bactérias a ser adicionado ao prato em segundo lugar, não-trypsinized de cultura contendo os PMVECs. Por exemplo, se for determinado que a placa de cultura de PMVECs contém 1,3 x 107 células e, em seguida, preparar a 1,3 x 107 células x 20 bactérias/celular x 1 mL/2 x 108 CFUs = bactérias 1,3 mL.</li>
		<li>Dilua a 1,3 mL de bactérias em HBSS até um volume final de 20 mL, para que toda a superfície de um prato de 150 cm pode ser coberto com fluido e, em seguida, adicionar as bactérias diluídas para a placa de PMVECs.</li>
		<li>Incube as PMVECs inoculadas com as bactérias a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 para 4-5 h, até que as lacunas podem ser vistas formando em monocamada a célula quando a placa é observada microscopicamente (ver Figura 1 para um nível adequado de formação de lacuna).</li>
		<li>Recolher o sobrenadante e, em seguida, centrifugar durante 10 min a 2.000 x g em uma centrífuga de mesa para remover restos celulares. Nota: Qualquer centrífuga de mesa capaz de gerar suficiente g force para células unlysed e células grandes fragmentos podem ser usados para esta etapa de Pelotas.</li>
		<li>Despeje o líquido sobrenadante em uma seringa que tem um filtro de 0,2 µm conectado à sua extremidade, então passar o sobrenadante através do filtro para remover as bactérias.</li>
		<li>Use uma alíquota do sobrenadante estéril para teste de citotoxicidade (ver 2.1) e congelar o resto do sobrenadante a-80 ° C para uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. análise de sobrenadantes citotóxicos
<ol><li>Ensaio de citotoxicidade<ol>
<li>Cresce PMVECs em pratos 6-poços até a confluência. Poços de lavar uma vez com HBSS, em seguida, adicionar 1,5 mL do sobrenadante filtro esterilizado (colhido ou células inoculadas por PA103 ou ∆PcrV) para poços individuais. Adicione HBSS estéril para outro bem como controlo negativo.</li>
		<li>Coloque a placa para a incubadora de CO2 para 21-24 h e, em seguida, observar para matar a célula/citotoxidade (ver próximo passo). Use sobrenadantes que exibem citotoxicidade para novas experiências e descartar aqueles que não mostram a matança de célula.</li>
		<li>Quantificação de morte celular<ol>
<li>Liberação de lactato desidrogenase (LDH) medida de células mortas, usando Kits de ensaio disponíveis comercialmente LDH e do fabricante recomendado procedimentos.</li>
			<li>Alternativamente, quantificar a matança de célula ao microscópio utilizando o software ImageJ. Por isso, gravar imagens microscópicas e áreas da placa de cultura contendo células intactas e, em seguida, quantificar regiões faltam células (indicativas de morte celular em um monolayer) usando uma macro personalizada do ImageJ (National Institutes of Health) (ver arquivo de codificação complementar ). Se desejado, realize as etapas macro manualmente da seguinte forma:<ol>
<li>Imagens (formato RGB ou Tiff) de entrada para a macro e ajustar o contraste para 15% saturada pixels. Duplique o contraste ajustado imagens e executar o comando "subtrair o plano de fundo" para obter uma imagem de alto contraste da área tanto a célula e a lacuna dentro do campo de visão.</li>
				<li>Subtrair a esta imagem da imagem original e combinar com a imagem original, usando a calculadora de imagem "E" função, a imagem resultante. Converta a imagem resultante em preto (lacunas) e máscara branca (células) com a função de limite (mínimo de 0, máximo de 5) e usar a função "corroer a binário" para remover o ruído da imagem.</li>
				<li>Medir a proporção de preto para brancos pixels dentro da imagem resultante usando a medição de "fração de área". Plotar e expressar áreas fracionárias para cada ponto de tempo de tratamento como por cento da área de abertura máxima.</li>
				<li>Meios de calcular e comparar usando ANOVA One-Way com teste post hoc de Tukey, com valores de p inferior a 0,05 considerado significativo.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use a análise de immunoblot para estabelecer a presença de amiloide e tau oligoméricas Aβ em sobrenadantes de cultura. Realizar análise de immunoblot usando11,os procedimentos padrão10,12, exceto concentrando sobrenadantes de cultura pelo menos 10 vezes antes da electroforese.<ol>
<li>Para concentrar-se o sobrenadante, coloque 1 a 2 mL do sobrenadante para uma unidade de filtro de centrifugação cuja membrana tem um peso molecular de corte de 10 kDa. Em seguida, coloque a unidade de filtro em uma centrífuga de mesa superior e centrifugar x 2.000 g até o necessário grau de concentração é alcançado (geralmente de 45-60 min).</li>
			<li>Determinar a quantidade de proteína na concentrada sobrenadante11 e carregar quantidades iguais de amostras em poços individuais do gel.</li>
			<li>Executar géis, transferir as proteínas para nitrocelulose e sondar os borrões com anticorpo antiamilóide de A11, anticorpo antioligoméricas tau de T22 ou anticorpo anti-Aβ de MOAB2 seguido por anticorpos secundários apropriados. Desenvolva os borrões usando procedimentos padrão de quimioluminescência.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para fazer um ensaio de T de thioflavin, use thioflavin T fluorescência (ThT) quantificar amiloides em sobrenadantes. Para as medições, use filtro esterilizado sobrenadantes.<ol>
<li>Prepare uma solução de stock (50x) de thioflavin T, suspendendo a 8 mg thioflavin T (ThT) em soro fisiológico 10ml tamponado fosfato (PBS). Após a mistura, filtre a solução através de um filtro de 0,22 µm para remover partículas.</li>
			<li>Para medições, adicione 20 µ l de estoque ThT a 1 mL de PBS em um fluorímetro de 1 mL. Coloca a amostra diluída em um spectrofluorimeter.</li>
			<li>Medir a emissão de fluorescência de base usando 425 excitação nm e a emissão de fluorescência de 450-575 nm em incrementos de 2 nm de digitalização.</li>
			<li>Executar uma verificação de lapso de tempo usando 425 excitação nm e emissão de 482 nm, com dados adquiridos a cada 0.2 s por 60 s.</li>
			<li>O inicial 20 s do scan Time-Lapse mede a fluorescência na célula em branco. A 20 s, pausar o scan e adicionar 10 µ l do sobrenadante filtro esterilizados para a cubeta. Misture a cubeta por inversão e coloque para o spectrofluorimeter.</li>
			<li>Retomar a verificação baseada em tempo, adquirindo o final 40 s de dados.</li>
			<li>Após a conclusão da digitalização lapso de tempo, execute uma varredura de espectro de emissão de fluorescência final usando configurações idênticas, conforme detalhado em 2.1.5.3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pneumonia+really+the+old+man%27s+friend%3F+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li>
<li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li>
<li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+respiratory+tract+infections+and+risk+of+first-time+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction.</a> Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).</li>
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<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343(2013).</li>
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<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible%2C+cytotoxic+prion+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li>
<li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Molec+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer+Dis+Assoc+Disord%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li>
<li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie%3A+Uncertainties%2C+biology%2C+and+molecular+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li>
<li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li>
<li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li>
</ol>

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Aqui, simples em vitro métodos estão descritos que permitem a demonstração da geração de amiloides citotóxicas durante a infecção com uma organismo causador de pneumonia. Estes métodos incluem um ensaio de citotoxicidade de cultura de células, immunoblotting, quantificação de célula usando um novo método microscópico e ThT vinculação a matar. Análises dos agentes citotóxicos têm demonstrado que eles são amiloide na natureza (Figura 2 e Figura ...

Pacientes que sobrevivem a pneumonia tem elevadas taxas de mortalidade nos meses seguintes hospital descarga1,2,3,4,5,6. Na maioria dos casos, a morte ocorre por algum tipo de falha final-órgão, incluindo renais, pulmonares, cardíacas, ou eventos de fígado, bem como derrame5,6. A razão para a elevada taxa de mortalidade nesta população de pacientes nunca foi estabelecida.
Pneumonia é classificada como também sendo adquirida na Comunidade ou hospitalar (nosocomial) e agentes que podem causar pneumonia incluem bactérias, vírus, fungos e substâncias químicas. Uma das principais causas de pneumonia nosocomial é a bactéria Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa é um organismo Gram-negativo que usa um sistema de secreção do tipo III para transferir várias moléculas efetoras, denominadas exoenzymes, diretamente para o citoplasma das células de destino7,8. Durante a infecção de células endoteliais pulmonares, os exoenzymes alvo várias proteínas intracelulares, incluindo um formulário endotelial do microtubule-associada da proteína tau9,10,11,12 , levando à desagregação de barreira endotelial, resultando em edema pulmonar grave, diminuição da função pulmonar e, muitas vezes, morte.
Como dito anteriormente, pacientes que sobrevivem a pneumonia inicial elevaram taxas de mortalidade nos primeiros 12 meses após a alta hospitalar. Um mecanismo potencial para explicar esse fenômeno é que algum tipo de toxina long-lived é gerado durante a infecção inicial que conduz ao pobre resultado a longo prazo. Duas observações suportam esta possibilidade. Em primeiro lugar, culturas pulmonares células endoteliais, que são tratadas inicialmente com p. aeruginosa falharem a proliferar por até uma semana depois que as bactérias são mortas por antibióticos13. Segundo, long-lived priões e agentes com características de príon foram demonstrados em várias doenças humanas e animais, particularmente doenças associadas com o sistema nervoso de14,15.
Nunca têm sido descritos métodos para analisar o potencial de produção de agentes citotóxicos long-lived durante a infecção pulmonar. Aqui uma série de ensaios simples em vitro são descritos que podem ser usados para investigar cytotoxin produção e actividade após infecção usando um comum agente causando uma pneumonia, p. aeruginosa. Estes ensaios devem ser facilmente adaptávelas para investigar indução cytotoxin possível após infecção usando outros agentes que causam a pneumonia, e os sobrenadantes são gerados também devem ser útil para investigar os efeitos dos citotoxinas no todo órgãos ou animais. Finalmente, os ensaios que são descritos aqui provavelmente será adaptávelas para testar os fluidos biológicos humanos e animais para a produção de citotoxinas durante uma pneumonia.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-oligômero amilóide</td><td>Thermo</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 anticorpo anti-oligômero tau</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina</td><td>T Sigma Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>filtros de seringa de 0,22 mícrons</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP Cabra anticoelho IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>Cepas PA103 e &Delta; PcrV</td><td></td><td></td><td>Essas cepas de P. aeruginosa foram obtidas do Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td></tr><tr><td>FITC Griffonia lectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9381</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Helix pomatia lectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1261</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>0,22 mícron nitrocelulose</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina Sal dissódico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Concentradores de microcetrifugação - corte de 10.000 MW</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de magnésio heptahidratado</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Countess Contador de células automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Pacientes que sobrevivem a pneumonia tem elevadas taxas de mortalidade nos meses após a alta hospitalar. Isso tem sido a hipótese de que a infecção do tecido pulmonar durante uma pneumonia resulta na produção de citotoxinas long-lived que podem levar ao fracasso subsequente fim órgão. Nós desenvolvemos em vitro ensaios para testar a hipótese que citotoxinas são produzidas durante a infecção pulmonar. As células endoteliais pulmonar isolado de rato e a bactéria Pseudomonas aeruginosa são usados como sistemas modelo, e a produção de cytoxins após a infecção das células endoteliais por bactérias é demonstrada usando cultura de células, seguida por quantificação directa utilizando ensaios de lactato desidrogenase e um novo método microscópico utilizando tecnologia ImageJ. A natureza amiloide destas citotoxinas foi demonstrada por ensaios de thioflavin T obrigatórios e immunoblotting e immunodepletion usando anticorpo antiamilóide de A11. Novas análises usando immunoblotting demonstraram que tau oligoméricas e Aβ foram produzidos e liberados por células endoteliais após infecção por p. aeruginosa. Esses métodos devem ser facilmente adaptávelas para análises de amostras clínicas humanas.

Um ensaio simples em vitro foi desenvolvido para ensaio para a presença de citotoxinas em sobrenadantes de células infectadas com a bactéria p. aeruginosa. Basicamente, meio de cultura de células infectadas é coletado 4 h após a adição de bactérias, as bactérias são removidas pela esterilização do filtro do sobrenadante da cultura, e em seguida o sobrenadante estéril é adicionado a uma nova população de células. As células são então observadas 21-24 h após a adição do so...

Métodos simples são descritos para demonstrar a produção de amiloides citotóxicos após infecção do endotélio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo dos cuidados pulmonares, como por que os pacientes que sobrevivem à pneumonia hospitalar têm resultados tão ruins a longo prazo? A vantagem desse método é que ele é simples e confiável, o que significa que qualquer pessoa que entrar no laboratório pode aprender e no dia seguinte está gerando dados úteis e repetíveis. Embora esses métodos analíticos possam ser aplicados para fornecer informações sobre a infecção de células cultivadas in vitro, eles também podem ser aplicados a modelos animais e pacientes humanos.Para produzir sobrenadante citotóxico, lave um prato de 150 centímetros de células endoteliais com HBSS e dilua uma colônia de P. aeruginosa para uma absorbância de 0,25 a 540 nanômetros. Dilua ainda mais as células bacterianas para permitir uma multiplicidade de infecção de 20 a um em 20 mililitros de HBSS e semeie as bactérias na placa de células endoteliais. Em seguida, coloque as células infectadas em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2 por quatro a cinco horas.É essencial que a incubação das bactérias e das células endoteliais ocorra por um período de tempo adequado. Se a incubação for muito curta, os amilóides não serão liberados no sobrenadante. Se a incubação for muito longa, as células realmente lisarão e liberarão todo o seu conteúdo no sobrenadante.O indicador que usamos para uma duração adequada de incubação é a formação de lacunas na monocamada endotelial. Quando forem observadas lacunas na monocamada celular por microscopia de luz, colha o sobrenadante para centrifugação para remover quaisquer detritos celulares. Transvase o sobrenadante para uma seringa equipada com um filtro de 0,2 mícron e passe o sobrenadante pelo filtro para remover qualquer bactéria contaminante.Em seguida, reserve 1,5 mililitros de sobrenadante estéril para testes de citotoxicidade e congele o restante da amostra a 80 graus Celsius negativos. Para avaliar a citotoxicidade do sobrenadante colhido, adicione a alíquota de 1,5 mililitro de sobrenadante esterilizado por filtro a um único poço de uma placa de seis poços contendo uma cultura de células endoteliais microvasculares pulmonares confluentes. Coloque a placa em uma incubadora de CO2 por 21 a 24 horas.Em seguida, obter imagens de regiões das culturas tratadas e controle. Importe as imagens para uma macro imagej personalizada e ajuste o contraste para 15% de pixels saturados. Duplique as imagens ajustadas ao contraste e use subtrair fundo para obter imagens de alto contraste das células intactas e da área de lacuna dentro do campo de visão.Subtraia esta imagem de alto contraste da imagem original e use a calculadora de imagens e a função para combinar a imagem resultante com a imagem original. Use a função de limite para converter a imagem combinada em uma máscara com as lacunas em preto e as células intactas em branco. E use a função de erosão binária para remover qualquer ruído da imagem.Em seguida, use a fração de área para medir a proporção de pixels pretos e brancos na imagem resultante. E plote e expresse as áreas fracionárias para cada ponto de tempo de tratamento, como a porcentagem da área máxima de lacuna. Para quantificar os amilóides dentro do sobrenadante, adicione 20 microlitros de solução estoque de tioflavina T 50X recém-preparada e filtrada a um mililitro de PBS em uma cubeta de espectrofotômetro de um mililitro e carregue a amostra diluída em um espectrofluorômetro.Meça a emissão de fluorescência de linha de base usando uma excitação de 425 nanômetros. Varredura da emissão de fluorescência de 450 a 575 nanômetros em incrementos de dois nanômetros. Em seguida, configure o instrumento para realizar uma varredura de lapso de tempo usando uma excitação de 425 nanômetros e emissão de 482 nanômetros com aquisição de dados a cada 0,2 segundos por 60 segundos.Pause a varredura após 20 segundos e 10 microlitros de sobrenadante esterilizado com filtro para a cubeta. Depois de misturar por inversão, recarregue a cubeta no espectrofluorômetro e retome a varredura baseada no tempo pelos 40 segundos finais. Após a conclusão do lapso de tempo, execute uma varredura final do espectro de emissões de fluorescência usando as configurações de varredura originais.A adição de P.aeruginosa a camadas confluentes de células endoteliais microvasculares pulmonares induz a formação de lacunas entre as células. Usando o imagej para avaliar a citotoxicidade do sobrenadante, conforme demonstrado durante as primeiras 12 horas de tratamento, as monocamadas de células confluentes ainda saudáveis podem ser visualizadas como todas as regiões brancas dentro do campo microscópico. No entanto, 18 horas após a adição do sobrenadante coletado de culturas infectadas com PA 103, lacunas na monocamada podem ser detectadas com a área da placa de cultura desprovida de células aumentando de maneira linear até 36 horas de tratamento, ponto em que quase nenhuma célula intacta pode ser observada.Resultados semelhantes podem ser obtidos usando a liberação de lactato desidrogenase como marcador de citotoxicidade. Com lactato desidrogenase detectada pela primeira vez 18 horas após a adição do sobrenadante citotóxico e aumentando de forma linear até que a morte celular máxima seja medida em 36 horas. Os sobrenadantes também podem ser avaliados por análise de immunoblot ou medindo a mudança na intensidade de fluorescência da tioflavina T devido a alterações de confirmação induzidas pela ligação amilóide para determinar a presença de amilóides citotóxicos nos sobrenadantes.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar sobrenadantes citotóxicos após a infecção de células endoteliais com citomonsis aeruginosa. Além disso, você deve ser bem versado nos tipos de ensaios necessários para caracterizar e analisar as citotoxinas presentes nesses sobrenadantes.

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Balczon, R., et al. Métodos para detecção de amilóides citotóxicos após infecção de células endoteliais pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o protocolo para quantificar amiloides em sobrenadantes de cultura de células endoteliais pulmonares infectadas com bactérias virulentas, usando tioflavina T, um corante fluorescente que se liga a estruturas de folha beta amilóide. Um aumento na fluorescência em comparação com a linha de base indica a...

Quantificando amilóides induzidos por infecção bacteriana usando fluorescência de tioflavina T

Fonte: Balczon, R., et al. Métodos para detecção de amilóides citotóxicos após infecção de células endoteliais pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o procedimento para gerar sobrenadante citotóxico a partir de células endoteliais pulmonares após infecção por Pseudomonas aeruginosa. Ele descreve como as proteínas efetoras bacterianas interrompem a estrutura da célula hospedeira e induzem a liberação de oligômeros amilóides citotóxicos no sobrenadante.

Obtenção de amilóides citotóxicos após infecção bacteriana de células endoteliais pulmonares de ratos

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

Descreve-se um método para controlar a ruptura endomembranar provocada pelas bactérias...

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Desenvolvemos um modelo de lesão pulmonar em camundongos por injeção intratraqueal da bactéria Pseudomonas aeruginosa. Este modelo mimetiza a lesão pulmonar durante a pneumonia e é clinicamente relevante.

Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

Aqui, nós descrevemos a preparação e utilização de uma sonda com base na actividade (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo), que permite a detecção e quantificação da forma activa da enzima pró-inflamatória N-amidase ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.

preparação e<em&gt; In Vivo</em&gt; O uso de uma sonda baseado em atividades para<em&gt; N</em&gt; Amidase Ácido -acylethanolamine

Aqui, descrevemos uma condição de crescimento para cultivar a pequena variante colônia de Pseudomonas aeruginosa. Descrevemos também dois métodos separados para a detecção e quantitação do alginato exopolissacarídeo produzido por P. aeruginosa usando um ensaio tradicional de carbazol ácido urônico e um anticorpo monoclonal específico de alginato (mAb) baseado em ELISA.

Cultura de Variante de Pequena Colônia de Pseudomonas aeruginosa e Quantitação de seu Alginate

Descrevemos um protocolo para um modelo tridimensional de co-cultura de vias aéreas infectadas, usando CFBE41o- células, macrófagos THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, estabelecido na interface ar-líquido. Este modelo fornece uma nova plataforma para testar simultaneamente a eficácia dos antibióticos, a função da barreira epitelial e marcadores inflamatórios.

P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

A resistência a antibióticos entre cepas invasivas de Escherichia coli em aderentes apresenta desafios para avaliar a invasão bacteriana usando o tradicional ensaio de proteção com gentamicina. Um método aprimorado para avaliar a invasão bacteriana quantitativamente, enumerando unidades formadoras de colônias e qualitativamente por meio da visualização das células infectadas por microscopia confocal de imunofluorescência, é descrito.

Ensaio de Proteção Amikacina para Quantificação e Visualização da Invasão de Células de Escherichia coli

Este artigo descreve métodos diferentes de...

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Aprenda métodos simples para detectar amiloides citotóxicos após infecção de células endoteliais pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo confiável gera dados reproduzíveis para estudos in vitro e in vivo.

Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa

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