Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo dos cuidados pulmonares, como por que os pacientes que sobrevivem à pneumonia hospitalar têm resultados tão ruins a longo prazo? A vantagem desse método é que ele é simples e confiável, o que significa que qualquer pessoa que entrar no laboratório pode aprender e no dia seguinte está gerando dados úteis e repetíveis. Embora esses métodos analíticos possam ser aplicados para fornecer informações sobre a infecção de células cultivadas in vitro, eles também podem ser aplicados a modelos animais e pacientes humanos.

Para produzir sobrenadante citotóxico, lave um prato de 150 centímetros de células endoteliais com HBSS e dilua uma colônia de P. aeruginosa para uma absorbância de 0,25 a 540 nanômetros. Dilua ainda mais as células bacterianas para permitir uma multiplicidade de infecção de 20 a um em 20 mililitros de HBSS e semeie as bactérias na placa de células endoteliais. Em seguida, coloque as células infectadas em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2 por quatro a cinco horas.

É essencial que a incubação das bactérias e das células endoteliais ocorra por um período de tempo adequado. Se a incubação for muito curta, os amilóides não serão liberados no sobrenadante. Se a incubação for muito longa, as células realmente lisarão e liberarão todo o seu conteúdo no sobrenadante.

O indicador que usamos para uma duração adequada de incubação é a formação de lacunas na monocamada endotelial. Quando forem observadas lacunas na monocamada celular por microscopia de luz, colha o sobrenadante para centrifugação para remover quaisquer detritos celulares. Transvase o sobrenadante para uma seringa equipada com um filtro de 0,2 mícron e passe o sobrenadante pelo filtro para remover qualquer bactéria contaminante.

Em seguida, reserve 1,5 mililitros de sobrenadante estéril para testes de citotoxicidade e congele o restante da amostra a 80 graus Celsius negativos. Para avaliar a citotoxicidade do sobrenadante colhido, adicione a alíquota de 1,5 mililitro de sobrenadante esterilizado por filtro a um único poço de uma placa de seis poços contendo uma cultura de células endoteliais microvasculares pulmonares confluentes. Coloque a placa em uma incubadora de CO2 por 21 a 24 horas.

Em seguida, obter imagens de regiões das culturas tratadas e controle. Importe as imagens para uma macro imagej personalizada e ajuste o contraste para 15% de pixels saturados. Duplique as imagens ajustadas ao contraste e use subtrair fundo para obter imagens de alto contraste das células intactas e da área de lacuna dentro do campo de visão.

Subtraia esta imagem de alto contraste da imagem original e use a calculadora de imagens e a função para combinar a imagem resultante com a imagem original. Use a função de limite para converter a imagem combinada em uma máscara com as lacunas em preto e as células intactas em branco. E use a função de erosão binária para remover qualquer ruído da imagem.

Em seguida, use a fração de área para medir a proporção de pixels pretos e brancos na imagem resultante. E plote e expresse as áreas fracionárias para cada ponto de tempo de tratamento, como a porcentagem da área máxima de lacuna. Para quantificar os amilóides dentro do sobrenadante, adicione 20 microlitros de solução estoque de tioflavina T 50X recém-preparada e filtrada a um mililitro de PBS em uma cubeta de espectrofotômetro de um mililitro e carregue a amostra diluída em um espectrofluorômetro.

Meça a emissão de fluorescência de linha de base usando uma excitação de 425 nanômetros. Varredura da emissão de fluorescência de 450 a 575 nanômetros em incrementos de dois nanômetros. Em seguida, configure o instrumento para realizar uma varredura de lapso de tempo usando uma excitação de 425 nanômetros e emissão de 482 nanômetros com aquisição de dados a cada 0,2 segundos por 60 segundos.

Pause a varredura após 20 segundos e 10 microlitros de sobrenadante esterilizado com filtro para a cubeta. Depois de misturar por inversão, recarregue a cubeta no espectrofluorômetro e retome a varredura baseada no tempo pelos 40 segundos finais. Após a conclusão do lapso de tempo, execute uma varredura final do espectro de emissões de fluorescência usando as configurações de varredura originais.

A adição de P.aeruginosa a camadas confluentes de células endoteliais microvasculares pulmonares induz a formação de lacunas entre as células. Usando o imagej para avaliar a citotoxicidade do sobrenadante, conforme demonstrado durante as primeiras 12 horas de tratamento, as monocamadas de células confluentes ainda saudáveis podem ser visualizadas como todas as regiões brancas dentro do campo microscópico. No entanto, 18 horas após a adição do sobrenadante coletado de culturas infectadas com PA 103, lacunas na monocamada podem ser detectadas com a área da placa de cultura desprovida de células aumentando de maneira linear até 36 horas de tratamento, ponto em que quase nenhuma célula intacta pode ser observada.

Resultados semelhantes podem ser obtidos usando a liberação de lactato desidrogenase como marcador de citotoxicidade. Com lactato desidrogenase detectada pela primeira vez 18 horas após a adição do sobrenadante citotóxico e aumentando de forma linear até que a morte celular máxima seja medida em 36 horas. Os sobrenadantes também podem ser avaliados por análise de immunoblot ou medindo a mudança na intensidade de fluorescência da tioflavina T devido a alterações de confirmação induzidas pela ligação amilóide para determinar a presença de amilóides citotóxicos nos sobrenadantes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar sobrenadantes citotóxicos após a infecção de células endoteliais com citomonsis aeruginosa. Além disso, você deve ser bem versado nos tipos de ensaios necessários para caracterizar e analisar as citotoxinas presentes nesses sobrenadantes.