Name: Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprenda a isolar e purificar células-tronco mesenquimais de fluido sinovial de coelho usando classificação magnética ativada. Este protocolo simples e econômico oferece alta pureza celular para aplicações em medicina regenerativa.

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Este estudo foi suportado financeiramente pelos seguintes subsídios: Fundação de ciências naturais da China (n. º 81572198; N. º 81772394); o fundo para a construção de alto nível de disciplina médica da Universidade de Shenzhen (n º 2016031638); a Fundação de pesquisas médicas da província de Guangdong, China (n. º A2016314); e ciência de Shenzhen e tecnologia de projetos (n. º JCYJ20170306092215436; Não. JCYJ20170412150609690; Não. JCYJ20170413161800287; Não. SGLH20161209105517753; Não. JCYJ20160301111338144).

Todos os animais de experimentos foram conduzidos em conformidade com as diretrizes regionais do Comitê de ética, e todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e do uso Comissão de Shenzhen segundo pessoas Hospital, Universidade de Shenzhen.
1. isole e cultura as rbSF-MSCs
<ol><li>
Preparativos para o procedimento de animais
	<ol>
<li>Preparar com esqueleto maduro feminina Nova Zelândia coelhos brancos para a coleção de rbSF-MSCs. realizar um exame clínico dos coelhos um dia antes do procedimento de anestesia e artrocentese. Nota: o exame físico deve incluir peso (2.0-2.5 kg), gênero (feminino) e temperatura corporal, frequência respiratória e cardíaca. Intervalos de parâmetro para coelhos clinicamente saudáveis são 30-50 min para a taxa de respiração, 220-280 min para a frequência cardíaca e 38-39 ° C para a temperatura do corpo.</li>
		<li>Rapidamente os animais para 6 h antes da anestesia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparações e procedimento para a anestesia de animais
	<ol>
<li>Conter o coelho com uma gaiola (ver Tabela de materiais) e em seguida, injetar 3% pentobarbital de sódio na veia marginal da orelha, na dose de 1 mL/kg para anestesia geral.</li>
		<li>Coloque o coelho em uma posição confortável e dorsal-reclinada.</li>
		<li>Monitore a frequência respiratória, frequência cardíaca e temperatura do corpo do coelho durante a anestesia.</li>
		<li>Use pomada oftalmológica em seus olhos, para evitar o ressecamento durante a anestesia.</li>
		<li>Avalie a profundidade da anestesia classificação14 de Guedela seguir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação para MSCs isolamento e cultivo
	<ol>
<li>Para cultivar rbSF-MSCs, preparar 500 mL de meio de cultura comercial (ver Tabela de materiais) suplementado com 10% de comercial complementar (ver Tabela de materiais), 10% soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina.</li>
		<li>Incube o meio de cultura a 37 ° C em banho-maria.</li>
		<li>Prepare 500 mL de soro fisiológico de tampão fosfato (PBS) para isolamento de célula e a lavagem da célula.</li>
		<li>Prepare 100 mL de solução salina isotônica para o procedimento de artrocentese cavidade do joelho.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coleção de uid disquete sinovial articular do joelho do coelho
	<ol>
<li>Selecione uma área de cerca de 5 x 5 cm de tamanho em torno do joelho e raspar o pelo de coelho dessa área usando um barbeador elétrico de segurança.</li>
		<li>Alternadamente, desinfectar o local de procedimento 3 x com povidona iodo solução e 75% de etanol. Em seguida, aplica sterile drapeja depois que a área tem secado completamente.</li>
		<li>Injectar 1-2 mL de solução salina isotônica, usando uma seringa hipodérmica estéril (2 mL), para a cavidade articular do joelho do espaço articular lateral, mova o joelho x 3-4 e depois sugar todo o líquido sinovial em temperatura ambiente.</li>
		<li>Filtre o ﬂuid sinovial através de um filtro de célula de nylon µm 40 para remover quaisquer detritos dentro de 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura dos rbSF-MSCs
	<ol>
<li>Recolha o filtrado ﬂuid em tubos de centrífuga de 50 mL e centrifugar a 1.500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Descartar o sobrenadante após a centrifugação, lavar a pelota com PBS, resuspenda o pellet com meio de cultura completo e então o meio em pratos de 100 mm da placa.</li>
		<li>Incube os pratos a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.</li>
		<li>Após 48 h, reabastecer os pratos com meio fresco para remover todas as células não-aderentes. Substitua o médio duas vezes por semana durante 2 semanas como passagem 0 (P0). Nota: Deve haver cerca de 1 x 104 células aderentes. Células/ml viável em SF são cerca de 2 x 102/mL.</li>
		<li>Após 14 dias o chapeamento inicial, muitas colônias devem ter se formado nos pratos de cultura. Selecione as colônias maiores que 2 mm de diâmetro. Mark, onde localizam-se as colônias selecionadas traçando sua circunferência na parte inferior do prato.</li>
		<li>Descarte as colônias < 2 mm de largura, utilizando raspadores de célula. Digerir as colônias selecionadas com cerca de 5 µ l de tripsina 0,25%, usando um cilindro de clonagem e transferir as colônias para um novo prato como passagem 1 (P1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cuidados pós-operatórios de animais
	<ol>
<li>Siga os procedimentos de funcionamento institucionais padrão para acompanhamento pós-operatório e recuperação da anestesia.</li>
		<li>Monitore os sinais vitais o cada 10 min coelho até que ele recuperou a consciência. Finalmente, transfira o animal consciente para a gaiola. Não retornam um coelho que se submeteu a cirurgia para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente.</li>
		<li>Pós-operação, desinfecte o local com 0,1% de iodopovidona, 2x ao dia por 3 dias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CD90-positivo magnético ativado celular classificação (MACS) do rbSF-MSCs e cultura primária
<ol><li>
Preparação da amostra
	<ol>
<li>Quando as células chegam em torno de confluência de 80%, Aspire o meio e em seguida, adicione 1-2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA para cada prato.</li>
		<li>Incube os pratos para 2-3 min permitir o desprendimento de células.</li>
		<li>Uma vez que as células são desanexadas, adicione uma quantidade igual de meio de cultura para inactivar a tripsina.</li>
		<li>Passar a suspensão de células através de um filtro de célula de 40 µm, recolher o filtrado em um tubo de 15 mL e em seguida girar para baixo as células a 600 × g por 10 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Resuspenda o pellet de células em MACS executando o tampão (PBS, pH 7.2, albumina de soro bovino 0,5% e 2 mM EDTA) e em seguida, contar o número de celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rotulagem magnética Nota: Classificar os MSCs-rbSF com uma kit contendo separadores (ver Tabela de materiais), um carrinho e colunas de classificação magnética-ativado da pilha.<ol>
<li>Determine o número de células usando um hemocytometer.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 × g por 10 min a 4 ° C. Completamente, Aspire o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 80 µ l de tampão de ressuspensão por 107 células total.</li>
		<li>Para 107 células total, adicione 20 µ l de microbeads conjugado com anticorpo monoclonal anticoelho CD90.</li>
		<li>Misture as esferas magnéticas e células uniformemente nos tubos e, em seguida, incube-os a 4 ° C por 15 min no escuro.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de tampão por 107 células ao tubo e centrifugá-la a 300 × g por 10 min a 4 ° C, para lavar as células. Desprezar o sobrenadante após a centrifugação.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 500 µ l de buffer por 107 células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Separação magnética
	<ol>
<li>Coloque a coluna com as asas de coluna para a frente no campo magnético do separador magnético.</li>
		<li>Lave a coluna de separador magnético (MS) com 500 µ l de buffer por 107 células.</li>
		<li>Transferi a suspensão única célula na coluna. Deixe que as células negativas passar através do campo magnético para descartar essas células sem rótulo.</li>
		<li>Lavar a coluna 1-2x com 500 µ l de buffer por 107 células e descartar o escoamento.</li>
		<li>Transferi a coluna para um tubo de centrifugação (15 mL).</li>
		<li>Adicionar 1 mL de tampão de por 107 células para a coluna e então imediatamente empurrar o êmbolo para a coluna para retirar as pilhas etiquetadas magneticamente.</li>
		<li>Repita o procedimento acima com uma segunda Column MS para aumentar a pureza do CD90+ células, que podem enriquecer a fração eluted.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão celular de 300 × g durante 10 minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspendê-lo com meio de cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura da CD90+ rbSF-MSCs
	<ol>
<li>Inocule as células em pratos de 100 mm, após a separação magnética celular ativado.</li>
		<li>Incube a 37 ° C numa incubadora de célula umidificado com 5% CO2pratos.</li>
		<li>Quando a confluência de 80-90% da cultura primária é alcançada, em aproximadamente 7-10 dias, digerir as células aderentes com 0,25% Trypsin-EDTA e passagem-los em uma diluição de 1:2 para fazer a passagem 2 (P2).</li>
		<li>Use o mesmo método para passar as células de passagem 3 (P3), que podem ser usadas para os ensaios em vitro . Nota: Após a sub-cultura e purificação, são obtidos aproximadamente 1 x 107 rbSF-MSCs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. identificação do rbSF-MSCs
<ol><li>
Confirmação de marcador de superfície das rbSF-MSCs por citometria de fluxo
	<ol>
<li>Quando os MSCs confluente de 80-90%, em P3, lavam-se as células com PBS e tratá-los com 1 mL de 0,25% Trypsin-EDTA. Em seguida, incube os MSCs a 37 ° C durante 2-3 minutos até que as células são desanexadas.</li>
		<li>Colher as células usando 10 mL de PBS, transferi-los para um tubo cónico (15 mL) e centrifugá-los a 300 × g por 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Descarte os sobrenadantes. Ressuspender as células em 500 µ l de PBS e transferir para um tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Incubar uma diluição de 1: 100 de anticorpos conjugado FITC e PE-conjugados (isotipo, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) por 1h no escuro a 4 ° C.</li>
		<li>Esta mistura a 300 × g por 5 min à temperatura de centrifugação e lavar as células duas vezes com PBS por centrifugação a 300 × g por 5 min cada tempo. Descarte os sobrenadantes.</li>
		<li>Ressuspender as células em 500 µ l de PBS, transferir a suspensão de células para um tubo de fundo redondo (5 mL) e analisá-lo usando um citômetro de fluxo. Nota: Aquisição de dados em um citômetro equipado com dois canais de fluorescência: 533/30 e 585/40. Para cada fluorescência isotype, usar o isotipo controle para ajustar a tensão apropriada do laser e definir a intensidade mínima necessária para obter um histograma de fluorescência que exibe as bordas esquerdas e direita do pico. Recolha um mínimo de 10.000 eventos para as análises estatísticas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Multidifferentiation dos rbSF-MSCs Nota: Uso P3 rbSF-MSCs para os ensaios multidifferentiation em vitro .<ol>
<li>
Diferenciação osteogênica
		<ol>
<li>Prepare o suporte de indução osteogênica: DMEM basic (1x), contendo 50 milímetros de L-ascórbico ácido-2-fosfato 10 mM de α-glicerofosfato e 100 nM de dexametasona.</li>
			<li>As células a 103 células/cm2 em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços de sementes e cultura-los no meio de indução osteogênica.</li>
			<li>Altere o meio de indução em 3 dias por 3 semanas.</li>
			<li>Consertar as células com formol 4% durante 30 min à temperatura ambiente, depois de concluída a diferenciação, as células de mancha com vermelho de alizarina 1% por 5 min e depois lavar os 3 x com PBS15.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Diferenciação de Adipogenic
		<ol>
<li>Prepare o suporte de indução de adipogenic: DMEM basic (1x), consistindo de 100 mM de indometacina, 10 mg/mL de insulina humana recombinante, 1mm de dexametasona e 0,5 mM de 3-isobutil-1-methylxanthine.</li>
			<li>Trate os P3 rbSF-MSCs para 3 semanas no meio de indução de adipogenic.</li>
			<li>Após 3 semanas, mancha os vacúolos de lipídios neutros usando O vermelho de óleo para confirmar a diferenciação de adipogenic. Consertar as células em uma solução de formol 4% durante 30 min à temperatura ambiente e em seguida lavá-los 3x com PBS16.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Chondrogenic diferenciação
		<ol>
<li>Prepare o suporte de indução de chondrogenic: DMEM basic (1x), consistindo de 10 ng/mL de TGFβ1, 1% de seu suplemento, 0,35 mM de L-prolina, 100 nM de dexametasona, 50mm de L-ascórbico ácido-2-fosfato e 1 mM de piruvato de sódio.</li>
			<li>Use o pellet de cultivo para a indução de chondrogenic. Centrifugue a 5 × 105 P3 rbSF-MSCs a 1500 rpm durante 10 minutos em um tubo de polipropileno (15 mL) para formar um pellet.</li>
			<li>Cultura as pelotas por 3 semanas com o meio de indução de chondrogenic.</li>
			<li>Altere o meio de cada 3 dias por 3 semanas.</li>
			<li>Após a indução de 3 semanas, incorporar o centrifugado com parafina, seção-lo em fatias de 4 mm e manchá-las usando 0.1% azul de toluidina por 30 min à temperatura ambiente de17.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extração de RNA total e análise por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR)
	<ol>
<li>Isolar o RNA total das células após a indução da diferenciação de 3 semanas usando a extração de RNA comercial kit (veja a Tabela de materiais).<ol>
<li>Remover o meio de cultura a placa de cultura e, em seguida, adicione 1 mL do reagente de isolamento.</li>
			<li>Lise as células pipetando repetidamente até que a solução é homogênea. -Incube à temperatura ambiente por 3 min.</li>
			<li>Transferi o lisado celular em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
			<li>Adicione 100 µ l de clorofórmio, agitá-lo pela mão de 15x e incubar a mistura à temperatura ambiente por 3 min.</li>
			<li>Centrifugar o tubo a 12.000 × g por 15 min a 4 ° C. Transferi os sobrenadantes para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
			<li>Adicionar 500 µ l de isopropanol e precipitar o RNA durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
			<li>Centrifugar a 12.000 × g por 10 minat 4 ° C. A pelota do RNA deve ser visível na parte inferior do tubo.</li>
			<li>Remover o sobrenadante e em seguida, adicione 500 µ l de etanol a 75%. Brevemente, gire o tubo durante vários segundos para lavar a pelota do RNA. -Centrifugar a 7.500 × g por 5 min a 4 ° C.</li>
			<li>Remova o etanol residual.</li>
			<li>Dissolva a pelota do RNA em 10 µ l de água DEPC e coloque os tubos no gelo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reverso transcrever total do RNA em cDNA com uma síntese de DNA kit (veja a Tabela de materiais). Nota: Execute todos os procedimentos a seguir no gelo.<ol>
<li>Prepare a mistura de mestre de transcrição reversa.</li>
			<li>Adicione 25 µ l de RNA DNase-tratados a cada tubo com 1 µ g de RNA.</li>
			<li>Incubar a mistura a temperaturas a seguir usando um termociclador PCR: 26 ° C durante 10 minutos (para permitir os hexâmeros aleatórios recozer), 42 ° C por 45 min (transcrição reversa) e 75 ° C por 10 min (inactivar o transcriptase reversa).</li>
			<li>Imediatamente analisar o cDNA resultante por PCR quantitativo em tempo real, ou armazená-lo a-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realizar a análise de expressão do gene com um sistema PCR quantitativo em tempo real.<ol>
<li>Use o qRT-PCR Master Mix (consulte Tabela de materiais) para realizar o PCR. Os primers PCR para GAPDH, Runx2, Agg e PPARγ estão listados na tabela 1.</li>
			<li>Calcule a expressão gênica usando o métodoΔΔCT 2−.</li>
			<li>Realizar uma análise estatística usando o software padrão estatístico. Use um teste t de amostras independentes para comparar os meios do grupo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

A existência de MSCs no líquido sinovial fornece uma alternativa para a terapia baseada em células. Estudos anteriores mostraram que a lesão sites contêm quantidades mais elevadas de células-tronco mesenquimais em seu líquido sinovial, que pode ser positivamente correlacionada com o período pós-lesão5. Os MSCs no líquido sinovial podem ser benéficos para o tecido, para reforçar a cura espontânea após uma lesão18,19. A aplicação clínica de ...

MSCs têm sido sugeridos como uma fonte valiosa para a medicina regenerativa, especialmente, para lesões da cartilagem. MSCs, incluindo osteoblastos, condrócitos, adipócitos, miócitos esqueléticos e células estromais viscerais, amplamente expandem as áreas de transplante de células-tronco devido a sua alta expansão taxa e linhagem multi diferenciação potencial1. MSCs podem ser isolados do esqueleto muscular, membrana sinovial, medula óssea e tecido adiposo2,3,4. As conclusões têm também conﬁrmed a presença de MSCs no líquido sinovial, e anterior pesquisa identificou MSCs derivado de líquido sinoviais (SF-MSCs) como candidatos promissores para regeneração articular5,6.
No entanto, pesquisa e experimentação pré-clínica em amostras humanas estão sujeitas a muitas questões éticas. Em vez disso, os coelhos têm sido e continuam a ser os mais usados espécies animais para demonstrar que o transplante de MSCs pode reparar danos na cartilagem. Nos últimos anos, um número crescente de pesquisadores estudaram células-tronco mesenquimais coelho (rbMSCs), ambos em vitro e em vivo, como estas células são MSCs semelhantes ao ser humano em sua fisiologia celular biologia e tecido. Da mesma forma, os rbMSCs são capazes de aderir a superfícies plásticas, morfologia do eixo-fibroblasto como humanos MSCs. Além disso, amostras de mesenquimais coelho são simples e fáceis de obter7. Além disso, os pontos cruciais são que o rbMSCs expressar marcadores de superfície, tais como CD44, CD90 e CD105, e que o potencial de diferenciação de linhagem multi é preservada, que está de acordo com os critérios para a identificação de populações de MSC como definida pela sociedade internacional de terapia celular8,9. Em particular, chondroprogenitors de líquido sinoviais são capazes de não-hipertrófica condrogênese quando induzido por TGF-β1, tornando-os fontes de celular adequada para a cartilagem articular fenotipicamente regeneração10,11, 12.
No entanto, o isolamento de SF-MSCs é muito diferente de outros tecidos, incluindo o cordão umbilical, tecido adiposo, sangue periférico e medula óssea. Atualmente, as abordagens mais comuns para a purificação e a classificação de SF-MSCs são citometria de fluxo e Fima baseado no grânulo classificação, embora o método de citometria de fluxo requer um ambiente específico e altamente caro instrumentos13.
Este artigo apresenta um procedimento simples e minimamente invasivo coleção de amostras de líquido sinovial da Nova Zelândia coelhos brancos. Durante o procedimento, os MSCs-rbSF são estàvel expandido em vitro e então isolaram com CD90 positivo magnética do grânulo procedimentos baseados. Finalmente, o protocolo mostra como obter o MSCs com um elevado grau de pureza e viabilidade das fontes de células colhidos.
Neste protocolo, os rbSF-MSCs isoladas são caracterizadas com base na sua morfologia, expressão de marcadores específicos e pluripotência para células-tronco. Immunophenotyping baseados em citometria de fluxo revela uma expressão significativa e positiva de CD44 e CD105, Considerando que a expressão de CD45 e CD34 é negativa. Finalmente, um ensaio em vitro para rbSF-MSCs demonstra a diferenciação osteogênica, adipogenic e chondrogenic dessas células.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 1703</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Suplemento MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 M1512</td><td>Componente do meio de cultura MSCs</td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco Inc.</td><td>C11995500BT</td><td>MSCs meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Solução salina isotônica</td><td>Litai, China</td><td>5217080305</td><td>Reagente de procedimento de artrocentese cavitária</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>PBS, isento de Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS)</td><td>Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td>Componente do meio de cultura MSCs</td></tr><tr><td>Solução de iodopovidona</td><td>Guangdong, China</td><td>150605</td><td>Agente de esterilização</td></tr><tr><td>75%</td><td>etanol Lircon, China</td><td>170917</td><td>Agente de esterilização</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina / EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td>Reagente de dissociação celular</td></tr><tr><td>1% Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td>Componente do tampão de corrida médio MACS das MSCs</td></tr><tr><td></td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160112089</td><td>Contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS), albumina de soro bovino a 0,5% (BSA) e 2</td></tr><tr><td>microesferas conjugadas com anticorpos mMEDTA CD90</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160801456</td><td>para classificação de células ativadas magnéticas</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Componente das MSCs condrogênicas diferenciação</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>Componente das MSCs diferenciação osteogênica</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td>354352</td><td>1%, Componente das MSCs diferenciação condrogênica</td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607</td><td>0,35 mM, Componente das MSCs diferenciação condrogênica</td></tr><tr><td>L-ácido ascórbico-2-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 mM, Componente das MSCs diferenciação condrogênica</td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>0,5 mM, Componente da diferenciação adipogênica</td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 mM, Componente da diferenciação adipogênica</td></tr><tr><td>TGF&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL, Componente de diferenciação condrogênica de MSCs</td></tr><tr><td>&alfa;-glicerophsphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6751</td><td>Componente de diferenciação osteogênica de MSCs</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal CD34, FITC Conjugado</td><td>Bioss</td><td>bs-0646R-FITC Marcador de células-tronco</td><td>hematopoiéticas</td></tr><tr><td>Camundongo antirabbit CD44</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA806GA</td><td>Thy-1 membrana glicoproteína (marcador MSCs)</td></tr> <tr><td>CD45 (anticorpo monoclonal)</td> <td>Bio-Rad</td><td>MCA808GA</td><td>marcador de células-tronco hematopoiéticas</td></tr><tr><td>anticorpo CD105</td><td>Marcador</td><td>Genetex GTX11415</td><td>MSCs</td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030</td><td>Precipita as fases orgânicas de extração de RNA</td></tr><tr><td>Triclorometano</td><td>Wenge, China</td><td>61553</td><td>Extrato de RNA total</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>Isolado total RNA</td></tr><tr><td>SYBR green master mix</td><td>Takara Bio, Japão</td><td>RR420A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA</td> de teste de PCR <td>Takara Bio, Japão</td><td>RR047A</td><td>Transcrito reverso para DNA complementar</td></tr><tr><td>Alizarin Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td>Coloração de compostos de cálcio</td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>Coloração de tecido cartilaginoso</td></tr><tr><td>Solução de óleo Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391L</td><td>Coloração por vacúolo lipídico</td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separador</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-102</td><td>Para classificação de células ativadas magnéticas</td></tr><tr><td>MultiStand</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-303</td><td>Para classificação de células ativadas magnéticas</td></tr><tr><td>Colunas MS</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-201</td><td>Para classificação de células ativadas magnéticas</td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>FALCON Inc.</td><td>352340</td><td>40 &mu; m nylon</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td>Contagem de células</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm prato</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Prato de cultura de células</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Tubos de extração de RNA e PCR</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91050</td> Centrífuga de alta velocidade <td>esterilizada por gama</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Células de centrífuga</td></tr><tr><td>Célula de dióxido de carbono incubadora</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>PCR em tempo real Instrumento</td><td>Life Tech</td><td>QuantStudio</td><td>Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Analisador celular</td></tr><tr><td>Pipetador</td><td>Eppendorf</td><td>O25456F</td><td>Transferir o líquido</td></tr><tr><td>Cilindro de clonagem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3983-50EA</td><td>Isolar e colher colónias celulares individuais</td></tr><tr><td>Seringa hipodérmica estéril</td><td>Double-Dove, China</td><td>131010</td><td>Procedimento de artrocentese</td></tr><tr><td>Gaiola de coelho</td><td>Zhike, China</td><td>ZC-TGD</td><td>Conter o coelho</td></tr></tbody></table>

magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Células-tronco mesenquimais (MSCs) são a fonte principal da célula para a terapia baseada em células. MSCs de líquido sinovial cavidade articular potencialmente poderiam ser usados para engenharia de tecidos de cartilagem. MSCs de líquido sinovial (SF-MSCs) foram considerados candidatos promissores para a regeneração articular, e seu potencial benefício terapêutico fez-lhes um tópico de pesquisa importante de tarde. SF-MSCs da cavidade do joelho do coelho Nova Zelândia branco podem ser empregados como um modelo otimizado translacional para avaliar humana medicina regenerativa. Por meio de CD90 à base magnética registrados da célula classificação tecnologias (MACS), este protocolo com sucesso Obtém coelho SF-MSCs (rbSF-MSCs) deste modelo de coelho e mais totalmente demonstra o fenótipo MSC dessas células induzindo os para diferenciar a osteoblastos, adipócitos e condrócitos. Portanto, esta abordagem pode ser aplicada em pesquisa da biologia celular e engenharia de tecidos, utilizando procedimentos e equipamentos simples.

Isolamento, purificação e cultura dos MSCs-rbSF: Este protocolo usa MACS para isolar rbSF-MSCs, baseados na expressão do marcador de superfície MSC CD90. Um diagrama de fluxo de processo de rbSF-MSCs isolamento, purificação e caracterização e o protocolo de cultura em vitro é mostrado na Figura 1.
Morfologia celular após magnético celular ativado classificação (M...

Este artigo apresenta um protocolo simples e económico para o simples isolamento e purificação de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial do coelho branco Nova Zelândia.

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no protocolo de classificação no campo das células-tronco, fornecendo um procedimento para purificar células-tronco mesenquimais diretamente do líquido sinovial. A principal vantagem desta técnica é que estabelecemos um protocolo simples e econômico para o isolamento e a purificação da MACS do líquido sinovial de coelhos. Geralmente na pesquisa, devido a este método, fazemos grandes esforços, pois a plurated da população celular depende da produção de uma única suspensão celular.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando notamos que apenas o método de classificação de células ativadas por magnetismo é atualmente aprovado pelo FDA para aplicações clínicas. Comece este procedimento com anestesia animal, conforme descrito no protocolo de texto. Para realizar a coleta de líquido sinovial articular do joelho do coelho, selecione uma área de cerca de cinco por cinco centímetros de tamanho ao redor do joelho.Raspe o pêlo de coelho ao redor desta área usando um barbeador elétrico de segurança. Como alternativa, desinfete o local do procedimento com solução de iodopovidona e etanol 75% três vezes. Em seguida, aplique cortinas e

magnetic-activated-cell-sorting-strategies-to-isolate-purify-synovial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rat CTMs foram isoladas do fémur ea tíbia e então enriquecida por separação de células magnéticas. Células classificadas foram confirmados para a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. Estas células também foram cultivadas na densidade clonal para formar colônias individuais e, em seguida essas colônias foram separados por cilindros de clonagem.

Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs

Uma técnica experimental para o tratamento de defeitos osteocondrais na articulação do joelho do coelho é descrito. A implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para defeitos osteocondrais proporciona um desenvolvimento promissor no campo da engenharia de tecidos. A preparação de fibrina de...

Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

Este protocolo descreve uma técnica de isolamento para a obtenção de células do estroma mesenquimal residentes primários de pulmão de ratos, através do uso de digestão enzimática, separação por gradiente de densidade, e aderência ao plástico CD146 + selecção esférulas magnéticas.

Isolamento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Células Residente Lung estromais mesenquimais de rato Pulmões

Apresentamos as técnicas necessárias para isolar a fração vascular estromal (SVF) de depósitos de tecido adiposo inguinal (subcutâneo) e perigonadal (visceral) de camundongos para avaliar sua expressão gênica e atividade colagenolítica. Este método inclui o enriquecimento de células-tronco derivadas de alto teor adiposo (ASCs) Sca1 usando separação celular imunomagnética.

A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica<sup&gt; alta</sup&gt; células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC)

Um protocolo que estabelece células-tronco mesenquimais (MSCs) isoladas do líquido sinovial e da medula óssea de miniporcos e coletadas de forma não invasiva por aspiração com seringa é apresentado. A fenotipagem celular foi realizada por citometria de fluxo após isolamento celular e cultivo in vitro de medula óssea e fluidos sinoviais derivados de MSCs.

Isolation and Cellular fenotipagem de células-tronco mesenquimais derivadas do líquido sinovial e Medula Óssea de miniporcos

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um grande número de exossomos de grau GMP a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando um biorreator 3D.

Preparação em larga escala de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial por cultura de biorreator 3D

O presente estudo fornece um protocolo modificado para isolar macrófagos sinoviais e fibroblastos do tecido da artrite inflamatória murina.

Isolamento e Cultura de Macrófagos e Fibroblastos Sinoviais Primários de Tecido de Artrite Murina

Este estudo estabeleceu um método estável e eficiente para o isolamento, cultura e determinação funcional de células-tronco CD34+ residentes na parede vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de isolamento fácil de seguir e eficaz em termos de tempo pode ser utilizado por outros investigadores para estudar os mecanismos potenciais envolvidos nas doenças cardiovasculares.

Isolamento imunomagnético das células-tronco CD34+ residentes na parede vascular de camundongos

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula têm funções significativas em diversas diferenciações, auto-renovação e modulação imunológica. Eles surgiram como um reservatório crucial de células precursoras em terapia genética, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um método único para isolar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula em ratos.

Técnica para Isolamento e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea da Mandíbula de Rato

Este protocolo descreve um método de triagem baseado em esferas magnéticas, utilizando anticorpos de citometria de fluxo marcados com ficoeritrina (PE) e microesferas anti-PE para isolar subpopulações específicas de células-tronco mesenquimatosas com alta positividade de marcadores-alvo pós-sorte, preservando a proliferação/atividade metabólica baseada em CCK-8 sob as condições testadas, sem exigir classificadores celulares caros ou esferas personalizadas específicas para o alvo.

Isolamento e validação de subpopulações de células-tronco mesenquimais positivas para podoplanina usando uma estratégia indireta de esferas magnéticas

Aprenda a isolar e purificar células-tronco mesenquimais de fluido sinovial de coelho usando classificação magnética ativada. Este protocolo simples e econômico oferece alta pureza celular para aplicações em medicina regenerativa.

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Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

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