Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no protocolo de classificação no campo das células-tronco, fornecendo um procedimento para purificar células-tronco mesenquimais diretamente do líquido sinovial. A principal vantagem desta técnica é que estabelecemos um protocolo simples e econômico para o isolamento e a purificação da MACS do líquido sinovial de coelhos. Geralmente na pesquisa, devido a este método, fazemos grandes esforços, pois a plurated da população celular depende da produção de uma única suspensão celular.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando notamos que apenas o método de classificação de células ativadas por magnetismo é atualmente aprovado pelo FDA para aplicações clínicas. Comece este procedimento com anestesia animal, conforme descrito no protocolo de texto. Para realizar a coleta de líquido sinovial articular do joelho do coelho, selecione uma área de cerca de cinco por cinco centímetros de tamanho ao redor do joelho.

Raspe o pêlo de coelho ao redor desta área usando um barbeador elétrico de segurança. Como alternativa, desinfete o local do procedimento com solução de iodopovidona e etanol 75% três vezes. Em seguida, aplique cortinas estéreis depois que a área estiver completamente seca.

Use uma seringa hipodérmica estéril para injetar um a dois mililitros de solução salina isotônica na cavidade articular do joelho a partir do espaço articular lateral. Mova o joelho três a quatro vezes e, em seguida, aspire todo o líquido sinovial à temperatura ambiente. Filtre o líquido sinovial através de um filtro de células de náilon de 40 mícrons para remover quaisquer detritos, dentro de quatro horas.

Para cultivar as SF-MSCs de coelho, colete o fluido filtrado em tubos de centrífuga de 50 mililitros e centrifugue a 1.500 rpm por dez minutos em temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante após a centrifugação e lavar o pellet com PBS. Depois de ressuspender o pellet com o meio de cultura completo, coloque o meio em placas de 100 mililitros.

Incube os pratos a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada contendo 5% de dióxido de carbono. Após 48 horas, reabasteça os pratos com meio fresco para remover quaisquer células não aderentes. Substitua o meio duas vezes por semana durante duas semanas como passagem zero.

Após 14 dias após o revestimento inicial, muitas colônias deveriam ter se formado nas placas de cultura. Selecione as colônias maiores que dois milímetros de diâmetro. Marque onde as colônias selecionadas estão localizadas, traçando sua circunferência no fundo do prato.

Descarte as colônias com menos de dois milímetros de largura usando raspadores de células. Digerir as colônias selecionadas com cerca de cinco microlitros de 0,25% de tripsina usando um cilindro de clonagem e transferir as colônias para um novo prato para passagem. Quando as células atingirem cerca de 80% de confluência, aspirar o meio.

Em seguida, adicione um a dois mililitros de 0,25% de tripsina EDTA a cada prato. Incube os pratos por dois a três minutos para permitir o desprendimento das células. Uma vez que as células estejam separadas, adicione uma quantidade igual do meio de cultura para inativar a tripsina.

Passe a suspensão celular por um filtro de células de 40 mícrons e colete o filtrado em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, gire as células a 600 vezes G por dez minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet de célula no MACS Running Buffer.

Para realizar a marcação magnética, determine o número de células usando um hemocitômetro. Centrifugue a suspensão celular a 300 vezes G por dez minutos a quatro graus Celsius. Depois de aspirar completamente o sobrenadante, adicione 80 microlitros de tampão de ressuspensão por dez milhões de células totais.

Para dez milhões de células totais, adicione 20 microlitros de microesferas conjugadas com um anticorpo monoclonal anti-coelho CD90. Misture as esferas magnéticas e as células uniformemente nos tubos. Em seguida, incube-os a quatro graus Celsius por 15 minutos no escuro.

Adicione um mililitro de tampão por dez milhões de células ao tubo e, em seguida, centrifugue a 300 vezes G por dez minutos a quatro graus Celsius, para lavar as células. Rejeitar o sobrenadante após centrifugação. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão por dez milhões de células.

Coloque a coluna, com as asas da coluna para a frente, no campo magnético do separador magnético. Enxágue a coluna separadora magnética com 500 microlitros do tampão por dez milhões de células. Transfira a suspensão de célula única para a coluna.

Deixe as células negativas passarem pelo campo magnético para descartar essas células não marcadas. Lave a coluna uma a duas vezes com 500 microlitros do tampão por dez milhões de células e descarte o fluxo. Transferir a coluna para um tubo de centrifugação de 15 mililitros.

Adicione um mililitro do buffer por dez milhões de células à coluna. Em seguida, empurre imediatamente o êmbolo para dentro da coluna, para liberar as células marcadas magneticamente. Repita o procedimento acima mencionado com uma segunda coluna separadora magnética, para aumentar a pureza das células CD90-positivas, que podem enriquecer a fração eluída.

Depois de centrifugar a suspensão celular a 300 vezes G durante dez minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com o meio de cultura. Inocular as células em placas de 100 mililitros após a classificação das células ativadas por magnetismo. Incube os pratos a 37 graus Celsius em uma incubadora de células umidificadas com 5% de dióxido de carbono.

Quando 80 a 90% de confluência da cultura primária for alcançada, em cerca de sete a dez dias, digerir as células aderentes com 0,25% de tripsina EDTA e passá-las em uma diluição de um a dois para fazer a passagem dois. Use o mesmo método para passar as células para a passagem três, que pode ser usada para os ensaios in vitro. Aqui é mostrada a morfologia das SF-MSCs de coelho cultivadas em monocamada antes e depois do MACS, sob um microscópio invertido.

Antes da classificação, as populações de células do líquido sinovial de coelho aderentes exibem heterogeneidade. Eles contêm diversos tipos e tamanhos de células, como morfologia oval, fuso longo, fuso curto e estrelado. A morfologia principal da passagem dois e da passagem seis é uma morfologia do fuso.

Após MACS com CD90, as populações de células exibem uma morfologia homogênea. Com a subcultura, o número de células aumenta. A análise por citometria de fluxo demonstrou que as células SF-MSC de coelho foram positivas para os marcadores MSC CD44 e CD105.

Embora negativo para o marcador de células endoteliais CD34 e para o marcador de células hematopoiéticas CD45. Os resultados mostraram que antes do MACS, a população de SF-MSC de coelho era composta por aproximadamente 40% de células MSC. Após a MACS, a população enriquecida continha mais de 99% de células MSC.

Aqui é mostrada a análise de citometria de fluxo do marcador CD90-positivo antes e depois da classificação MAC. A coloração com vermelho de alizarina demonstrou que nódulos mineralizados se formaram sob indução osteogênica por três semanas. Após três semanas de indução adipogênica, o acúmulo de vacúolos ricos em lipídios foi detectado pela coloração intracelular com óleo vermelho O.

Após três semanas de indução condrogênica, o pellet celular foi histologicamente analisado com coloração com Azul de Toluidina. O proteoglicano ácido positivo caracterizou as células semelhantes a condrócitos. Após três semanas de indução, foi detectada a expressão relativa de mRNA do marcador osteoblástico, do marcador adipogênico e do marcador condrogênico.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a quatro horas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão do isolamento direto e da purificação de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial do coelho branco da Nova Zelândia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de selecionar as colônias maiores que dois mililitros de diâmetro.

Produza também uma única suspensão celular antes da classificação imunomagnética, pois as células indesejadas ligadas a uma célula marcada permanecerão no grânulo magnético. Após este procedimento, outros métodos, como a classificação de células ativadas por fluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a segurança e eficácia da purificação de células-tronco mesenquimais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da regeneração da cartilagem articular explorarem as células DC ideais no reparo da cartilagem articular.

Não se esqueça que as operações foram realizadas em bancada de resfriamento de arco, e os cuidados como luvas, devem ser sempre tomados durante a realização deste procedimento. As implicações dessa técnica se estendem à terapia da lesão da cartilagem articular, porque as MASC derivadas do líquido sinovial são candidatas promissoras para a regeneração da cartilagem articular.