Uso de anticorpos Antifosfo-girdin Visualizar células intestinais topete no Mouse flutuante Jejunum Cryosections

O objetivo geral deste procedimento de coloração é visualizar células de tufo em criosseções de jejuno de camundongo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da gastroenterologia, como a proliferação de células de tufo ocorre no intestino de mamíferos durante a infecção do parasita. A principal vantagem dessa técnica é que pesquisadores com experiência histrológica limitada podem obter imagens de células de tufo de alta qualidade.

Comece expondo os órgãos pélvicos de um cadáver de camundongo recém-fixado em formalina. Corte a extremidade do reto do ânus e separe os intestinos do corpo cortando o mesentério. Para isolar o jejuno, corte os intestinos a quatro centímetros do lado anal do antro gástrico e descarte a metade anal do intestino delgado restante.

Corte o jejuno ao meio para facilitar o procedimento de lavagem. Carregue 20 mililitros de solução de formalina neutra tamponada a 10% em uma seringa de 20 mililitros e conecte uma agulha reta de calibre 18 com o chanfro removido. Em seguida, injete uma solução de formalina neutra tamponada a 10% de uma extremidade do jejuno cortado para limpar o conteúdo intestinal e fixar a superfície do lúmen intestinal.

Lave o lúmen intestinal injetando PBS. Em seguida, lave com solução de gelatina líquida para substituir o PBS. Feche uma extremidade do jejuno cortado por ligadura de sutura, usando uma sutura de corte de náilon 6-0.

Encha o jejuno com gelatina líquida e feche a extremidade oposta por ligadura de sutura. Em seguida, amarre quatro nós de sutura ao longo do comprimento do jejuno. Mergulhe os tecidos em 50 mililitros de sacarose a 15% em solução de formalina neutra tamponada a 10% durante a noite, a 4 graus Celsius.

No dia seguinte, corte o jejuno nos nós de sutura para obter três pedaços de jejunem semelhantes a salsichas com ambas as extremidades ligadas. Alinhe as peças em um criomolde e cubra com composto de incorporação. Congele o criomoldor em isopentano resfriado com nitrogênio líquido.

Para preparar seções de jejuno, comece ajustando a temperatura da câmara do criostato e a temperatura do objeto para menos 22 graus Celsius. Coloque o bloco de tecido congelado em um criomold na câmara do criostato por pelo menos 15 minutos. Após 15 minutos, corte o bloco ao meio com uma lâmina de barbear para expor a seção transversal do jejuno.

Monte metade do bloco em um adaptador de criostato. Divida o jejuno cheio de gelatina em seções de 30 mícrons de espessura. Use uma pinça congelada para transferir suavemente as seções para uma placa de cultura de 35 milímetros contendo 3 mililitros de PBS.

Depois de lavar as seções três vezes por cinco minutos cada uma com 3 mililitros de PBS-T, adicione 3 mililitros de solução de recuperação de antígeno recém-preparada ao prato que contém as seções flutuantes. Em seguida, feche a tampa, sele o espaço entre o prato e a tampa com uma tira de fita adesiva e incube a 50 graus Celsius em uma incubadora de hibridização por três horas, sem agitar. Após a imunocoloração, transferir a placa de cortes corados em PBS para um microscópio estereoscópico.

Coloque 200 microlitros de PBS em uma gota no centro de uma lâmina de vidro branco codificada em MAS. Em seguida, use uma ponta de pipeta P200 para transferir uma seção do jejuno do prato para a gota. Depois de ajustar o alinhamento da seção, aspire todo o PBS restante ao redor da seção.

Adicione 20 microlitros de mídia de montagem aquosa e coloque uma lamínula sobre a mídia. Sele imediatamente as bordas da lamínula com mídia de montagem à base de xileno e deixe secar por duas a três horas antes de iniciar a microscopia confocal. O enchimento de gelatina do jejuno preserva a forma do disco redondo e mantém o posicionamento vertical das vilosidades.

Na ausência de enchimento de gelatina, as seções jejunais tendem a se dobrar, permitindo que as vilosidades oscilem para trás. O pY1798 delineia de forma reprodutível células inteiras do tufo, incluindo a membrana, o citoplasma do soma em forma de carretel e a ponta luminal fortemente corada, onde a condensação robusta do sinal corresponde ao tufo saliente de uma célula do tufo. A faloidina tem alta afinidade pela actina filamentosa, que está presente nas microvilosidades que formam a borda da escova intestinal.

A faloidina marca de forma reprodutível e proeminente a borda em escova espessa que corresponde a uma massa de radículas que se estende do tufo. A co-localização consistente dos sinais pY1798 com a borda em escova proeminentemente espessada e positiva para faloidina demonstra que este protocolo identifica com sucesso as células do tufo, independentemente de estarem localizadas em uma vilosidade ou em uma cripta. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias se for executada corretamente.

A combinação de gelatina de baixo ponto de emissão, criosecções flutuantes e recuperação de antígeno de baixa temperatura pode ser aplicada para imunocoloração de outros tecidos do projeto.