Name: Geração de nativos, sem marcas de formatação da huntingtina Exon1 monômero e fibrilas usando uma estratégia de fusão de sumô (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a produzir monômeros e fibrilas nativas da huntingtina Exon1 sem marcas, usando uma estratégia de fusão de sumô. Este método simples e robusto facilita estudos estruturais e funcionais da proteína em doenças neurodegenerativas.

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Este trabalho foi financiado principalmente pelos subsídios da Fundação CHDI e o Swiss National Science Foundation. Agradecemos a Dr. Sophie Vieweg para discussões útil durante o desenvolvimento deste novo sistema de expressão e outros membros do grupo Lashuel por compartilhar sua experiência com este sistema de expressão e para os seus comentários valiosos e entrado. Agradecemos também o Prof Oliver Hantschel para fornecer o plasmídeo ULP1. Os autores agradecer Dr. John B. Warner e Dr. Senthil K. Thangaraj revisão crítica do manuscrito

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Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.

Neste protocolo, descrevemos um procedimento eficiente para obter quantidades de miligrama de nativo, untagged Httex1 que contenham resíduos de glutamina 23 ou 43. Isto foi conseguido por expressar Httex1 como uma fusão do C-terminal para seus6-marca de sumô, que é usado para isolar a proteína de fusão da célula lisada por IMAC e é clivado antes da purificação de HPLC de Httex1. Enquanto a estratégia de sumô tem sido usada na produção de várias outras proteínas, nosso método mostra que as propriedades únicas de que sumô também poderia ser usado para gerar intrinsecamente desordenado, sujeitos a agregação da proteína amiloidogénicos que anteriormente demonstraram ser extremamente difícil de manipular e produzir43,44. Apresentamos um protocolo que é simples, fácil de usar e comparável a um protocolo para a geração de uma proteína "bem comportada". A fusão de sumô solubiliza e estabiliza o Httex1 durante a expressão e a etapa de purificação do IMAC. Clivagem prematura da tag, como observado com a estratégia de intein10 e agregação já não eram um problema.
Proteínas intrinsecamente desordenadas são especialmente vulneráveis à degradação. Enquanto a degradação do N-terminal da região N17 não é um problema usando este protocolo, truncamentos no PRD de Httex1 podem ocorrer. Como as proteínas truncadas são muito semelhantes aos Httex1 em tamanho, carga e hidrofobicidade, removendo-os por meio de cromatografia em fase gasosa é um desafio, assim é melhor evitar a sua formação em primeiro lugar. Aderindo intimamente ao protocolo, sempre trabalhando no gelo e usando uma quantidade suficiente de inibidor de protease devem ajudar a manter o nível de truncamento observado muito baixa. Aplicar uma tag de fusão no C-terminal de Httex1 poderia remover truncamentos no PRD facilmente como a proteína truncada perderia a tag afinidade também. No entanto, não se a sequência nativa precisa ser mantida que esta opção não pode ser aplicada como Httex1 termina com prolina e o melhor de nosso conhecimento há nenhum C-terminal de fusao que é conhecidos por induzir a clivagem traceless e eficiente depois de prolina.
A parte mais crítica do protocolo é a manipulação do Httex1 libertado após a clivagem da marca de sumô por ULP1. A proteína deve ser purificada imediatamente por RP-HPLC. Felizmente, esta é uma reação eficiente e rápida que normalmente é concluída em 10-20 min a 4 ° C. Em contraste, a estratégia de intein necessárias várias horas para clivagem completa de intein, exigindo um trade-off entre a clivagem incompleta e agregação de início a fim de maximizar o rendimento. Um rápido exame é necessário para o mutante Httex1, como ele vai começar a agregar na comparativamente alta concentração presente na reação de clivagem, Considerando que a variante 23Q é estável por mais tempo. Durante a purificação RP-HPLC, outra vantagem do sumô torna-se evidente: enquanto o Ssp DnaB intein é hidrofóbico e adere fortemente à coluna, sumô é mais hidrofílico e elutes completamente da coluna de fase reversa de C4. Embora ULP1 comercial é muito caro, a proteína pode ser facilmente produzida em alto rendimento seguindo protocolos publicados anteriormente29.
A importância crítica da aplicação de um protocolo de desagregação antes usando o Httex1 não pode ser suficiente sublinhado. Liofilizado polyQ proteínas tais como Httex1 são estáveis e podem ser armazenados longos períodos, mas não são completamente solúveis em água e buffers. A presença de oligômeros pré-formadas ou fibrilas poderia ter um impacto significativo na cinética de agregação e propriedades biofísicas do proteína45. O protocolo de desagregação descrito aqui permite a desagregação da proteína, remoção dos agregados pré-formadas e geração de uma solução de Httex1 monomérica de uma amostra liofilizada. Observamos morfologia de cinética e fibrila agregação similar obtidos com o SUMO e a estratégia de intein de Httex1.
Em comparação com os métodos anteriores para a produção de Httex1, a estratégia de sumô descrita aqui oferece diversas vantagens e expande a gama de possíveis estudos para investigar a estrutura e propriedades funcionais desta proteína na saúde e na doença. A proteína de fusão de sumô-Httex1 é fácil de manusear, pode ser congelado e armazenado ou mantido em solução por 24 horas à temperatura ambiente, enquanto o mHttex1 livre iria agregar rapidamente. A estabilidade e alta solubilidade das proteínas de fusão de sumô-Httex1 fornecem maior flexibilidade para manipular a proteína e/ou introduzir modificações enzimáticas e químicas em mHttex1 que não seriam possíveis após a clivagem. Isso inclui a introdução de modificações borne-translational fluorophores, rotação de rótulos, etiquetas de biotina, etc os avanços apresentados aqui devem 1) facilitar futuros estudos para elucidar as relações estrutura-função de Httex1; 2) gerar novas ferramentas para investigar Htt agregação e patologia espalhando; 3) permitem o desenvolvimento de novos ensaios para identificar moléculas que estabilizar mutante Httex1 e impedem sua agregação; e 4) incentivar os cientistas de outras áreas para trazer para o trabalho sobre esta proteína e se juntar a nossa busca para encontrar a cura para a doença de Huntington.

HTT é uma proteína de 348 kDa e tem sido implicado em várias funções fisiológicas1. Quando Htt contém uma região expandida polyQ de mais de 36 resíduos em seu N-terminal, que provoca HD2,3. Patologia de HD é caracterizada por inclusões celulares no corpo estriado e córtex, que leva à morte neuronal e atrofia dos tecidos afetados4,5. Vários fragmentos de Htt N-terminal que contém o intervalo de repetição polyQ foram detectados no post-mortem de cérebros de doentes de Huntington e são pensados para ser gerado pelo processamento proteolítica da proteína huntingtina6. Estudos recentes sugerem que Httex1 também pode ser formada devido a emenda de mRNA aberrante. Httex1 contém a mutação polyQ patológica e sua superexpressão em animais pode recapitular muitas das principais características do HD7, destacando, assim, um possível papel central deste fragmento em HD patologia e doença progressão6, 8,9.
Devido a agregação alta propensão de mutantes Httex1 (mHttex1) com polyQ expandida do trato, a maioria dos sistemas de expressão existentes baseiam-se a fusão transiente de Httex1 às proteínas (como a glutationa S-transferase (GST), tioredoxina (TRX) ou maltose-proteína (MBP) e/ou peptídeos (poli-histidina) que diferencialmente melhorar sua expressão, estabilidade, purificação e/ou solubilidade10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,,27,28. O parceiro de fusão está ligado à Httex1 com uma sequência curta, contendo um local de clivagem por proteases como a tripsina, tabacco etch protease do vírus (TEV) ou PreScission para permitir a clivagem e a libertação de Httex1 antes do início da agregação ou purificação. Deficiências desses métodos incluem a possibilidade de deixar resíduos adicionais devido à não-traceless clivagem e a criação de fragmentos truncados devido miscleavage dentro da sequência de Httex1, além de heterogeneidade devido à clivagem incompleta ( Ver Vieweg et al . para uma discussão mais aprofundada, sobre as vantagens e limitações desta abordagem)10. Para lidar com essas limitações, recentemente desenvolvemos uma estratégia de expressão, possibilitando a geração de Httex1 livre de marca nativo pela primeira vez, utilizando uma fusão de N-terminal transiente do Synechocystis SP. (Ssp) DnaB intein a Httex110. Enquanto a clivagem intein é traceless e específico e produz quantidade mg de proteínas, que ainda sofre de dois inconvenientes que poderiam reduzir o rendimento: ou seja, prematura clivagem do intein que pode ocorrer durante a expressão e o facto de clivagem ocorre sobre várias horas, que podem levar à perda de proteína devido à agregação, especialmente para Httex1 com repetições polyQ expandido.
Para resolver essas limitações e refinar a nossa estratégia para a produção de nativo, livre de marca Httex1, desenvolvemos um novo sistema de expressão baseado em fusão transiente de sumô, mais exatamente o fermento do homólogo Smt3 para Httex1. A aplicação do sistema para a produção de proteínas recombinantes de sumô foi publicado pela primeira vez em 200429, onde demonstrou-se um aumento da taxa de expressão e solubilidade da proteína de fusão de sumô. A tag de sumô pode ser clivada pela ubiquitina como específicos da proteína protease 1 (ULP1), que não necessita de um site de reconhecimento, mas reconhece a estrutura terciária de sumô e praticamente elimina a possibilidade de miscleavage30. Além disso, a clivagem mediada por ULP1 é rápido e traceless e não deixa resíduos adicionais para trás. A clivagem prematura da marca de fusão, como observado com a autocatalytic intein10, completamente é evitada pela exigência de uma protease externo. Enquanto a estratégia de sumô é hoje amplamente utilizada para a produção de proteínas recombinantes a31,32,33, demonstramos neste artigo o que é especialmente útil para a geração de uma intrinsecamente desordenado, sujeitos a agregação amiloidogénicos proteína tais como Httex1. Acreditamos que a simplicidade, eficiência e robustez de nosso método baseada em SUMO-fusão vão fazer Httex1 nativo, livre de marca mais acessível aos pesquisadores de diferentes disciplinas e eliminar a necessidade de usar sequências não-nativas de Httex1 em vitro . Este é um avanço importante que facilitará futuros estudos para elucidar a relação estrutura-função de Httex1.
O protocolo descreve a purificação do Httex1 de 12 L de cultura bacteriana, mas o protocolo pode ser facilmente adaptado para as produções de menor ou maior escala. O protocolo descreve a produção de tipo selvagem Httex1 (wtHttex1) com um comprimento de repetição polyQ abaixo (23Q) e mutante Httex1 (mHttex1) com um polyQ repetir comprimento acima (43Q) o limiar patogénico (36Q).

<table><tbody><tr><td>Formato de uranilo (UO2(CHO2)2)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbono 200 mesh, 50 grades</td><td>EMS</td><td>FCF200--50</td><td></td></tr><tr><td>Célula de alta precisão feita de Quartzo SUPRASIL 1 mm caminho de luz da Hellma Analytics</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Substância tampão Dulbecco's (PBS sem Ca e Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria (Caldo LB Miller)</td><td>&nbsp; Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB# E4130</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&nbsp; Coquetel Inibidor de Protease</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Huntingtina, a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 coluna&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>coluna C4 HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168. P0</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 10 &micro; m C4 300 &Aring;, LC Coluna 250 x 21,2 mm, Phenomenex, 19x10 mm coluna de proteção, não revestida de temperatura</td></tr><tr><td>Acetonitrila HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre estéril</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro semi-micro cubeta</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop, conexões de 1/16" (&Auml; KTAdesign), 50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Trifluoroacético</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Tubos para FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 100 kD Microcon&nbsp; filtros de fluxo rápido</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 processador de líquido ultrassônico</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta 900 equipado com um coletor de frações&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 Dicroísmo Circular</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Sistema UPLC&nbsp;</td><td>Coluna Waters</td><td></td><td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron&nbsp; , coluna pré-aquecida (40 &deg; C), vazão de 0,6 mL/min, volume de injeção de 4 &mu; </td></tr><tr><td>L waters HPLC system</td><td>Detector</td><td>UV Waters 2489 e módulo de gradiente quaternário 2535, loop de 20 mL em um invólucro FlexInject</td>ESI-MS: Finnigan LTQ Thermo Fisher Scientific instrumento liofilizador FreeZone 2.5 Plus Tecnai Spirit BioTWIN&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscópio eletrônico FEI</td><td></td><td>equipado com uma pistola LaB6 e uma câmera 4K x 4K FEI Eagle CCD (FEI) e operado a 80 kV</td></tr><tr><td>37 &deg; C tremendo&nbsp; incubadora</td><td>Infors HT multitron Standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de nativos, sem marcas de formatação da huntingtina exon1 monômero e fibrilas usando uma estratégia de fusão de sumô

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

A doença de Huntington (HD) é uma doença hereditária neurodegenerativa fatal causada por uma expansão de CAG (≥36) no primeiro exon do gene HD, resultando na expressão da proteína do Huntingtin (Htt) ou N-terminal respectivos fragmentos com um (polyglutamine expandido trecho do polyQ).
O exon1 da proteína huntingtina (Httex1) é o menor fragmento de Htt que recapitula a muitos dos recursos de HD em celular e animal modelos e é um dos mais amplamente estudados fragmentos de Htt. O pequeno tamanho do Httex1 torna experimentalmente mais receptivos a caracterização biofísica, usando técnicas padrão e de alta resolução, em comparação com mais fragmentos ou Htt completo. No entanto, a agregação alta propensão de mutantes Httex1 (mHttex1) com conteúdo polyQ aumentada (≥42) tem dificultado a desenvolver expressão eficiente e sistemas de purificação para produzir essas proteínas em quantidades suficientes e torná-los acessíveis para cientistas de diferentes disciplinas, sem o uso de proteínas da fusão ou outras estratégias que alteram a sequência nativa da proteína. Apresentamos aqui um método robusto e otimizado para a produção de quantidades de miligrama de nativo, marca isento de Httex1 com base na fusão transitória do ubiquitin pequeno modificador relacionados (SUMO). A simplicidade e a eficiência da estratégia vão eliminar a necessidade de usar sequências não-nativas de Httex1, assim, tornando esta proteína mais acessível aos investigadores e melhorar a reprodutibilidade de experimentos em laboratórios diferentes. Acreditamos que estes avanços também facilitará estudos futuros vistos elucidar a relação estrutura-função de Htt, bem como desenvolver novas ferramentas de diagnósticos e terapias para tratar ou retardar a progressão da DH.

Httex1 é expresso em e. coli com um N-terminal dele6-marca SUMO. Os resultados representativos da expressão e purificação da proteína de fusão são resumidos na Figura 1. A sequência de Httex1 consiste dos resíduos 2-90 de Htt e começa com Ala2, porque Met1 é totalmente clivada em vivo42. A numeração dos aminoácidos refere-se a variante 23Q, a sequência completa da proteína expressa fusão é mostrada na Figura 1A. Os plasmideos serão depositados no Addgene em um futuro próximo para ser compartilhado com a Comunidade. Um esquema do plasmídeo e a proteína de fusão expressa é mostrado na Figura 1B. Httex1 His6-SUMO expressa a um nível médio (Figura 1C) e maior parte da proteína de fusão está presente na fração solúvel após Lise, tanto para o 23Q e a variante de 43Q. A proteína de fusão migra mais alto do que o esperado, com base no peso molecular. Isto é parcialmente devido a forte dobra de sumô, mas principalmente devido à composição de sequência incomum de Httex1, contendo principalmente resíduos de glutamina e prolina. Tanto a sua (23Q) e o mutante (43Q) proteína de fusão pode ser enriquecida a ~ 80% de pureza por IMAC (Figura 1D), a presença de co, purificação da proteína do hospedeiro pode ser explicada pelo nível comparativamente baixa expressão de Httex1 e o grande exemplo volume aplicado à coluna.
O decote de seus6-marca de sumô e a purificação de Httex1 é mostrado na Figura 2. UPLC é uma ferramenta eficiente para monitorar o decote de seus6-marca de sumô (Figura 2B). O pico original da proteína de fusão é consumido e dois picos de novos e bem separados do seu correspondente6-marca de sumô e Httex1 aparecem. A reação de clivagem é terminada em 10-20 min. O Western Blot (WB) é muito lento para acompanhar a reação de clivagem com eficiência, mas foi incluída na figura para referência e para demonstrar a completude da clivagem do sumô. Ambos Httex1 23Q e 43Q podem ser separados bem desde os seus6-sumô tag por RP-HPLC (Figura 2C) e foram obtidos em elevado grau de pureza, como demonstrado pela análise UPLC, MS e SDS-PAGE (Figura 2D).
Para ilustrar que as proteínas Httex1 preparadas por este método mantêm as propriedades de agregação esperado do Httex1, avaliamos a cinética de fibrillization da mutante Httex1 a 37 ° C por um ensaio de sedimentação, monitorado as mudanças na estrutura secundária por CD espectroscopia e caracteriza-se a morfologia dos agregados pela TEM. Um conjunto de dados representativo da cinética de agregação de mHttex1 formação de fibrila conforme determinado por um ensaio de sedimentação é mostrado naFigura 3. A perda de Httex1 solúvel 43Q ao longo do tempo, devido à formação de fibrila foi quantificada por UPLC. Observamos uma completa depleção de proteína solúvel após 48 horas de incubação. Além disso, nós determinamos a estrutura secundária da proteína por espectroscopia de CD (Figura 3B). Httex1 43Q turnos de não-estruturados (λmin 205 nm) para conformação rica principalmente β-folha (λmin 215 nm) após 48 horas de incubação. Esta mudança estrutural é acompanhada pela formação de agregados tempo fibrillar como observável pela TEM 48 horas (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Figura 1 . Expressão e purificação de seus6-proteína de fusão de sumô Httex1.  (A), a sequência de aminoácidos de seus6-sumô-Httex1-QN fusão construções (seu6-sumô em verde e Httex1-QN em laranja); (B) visão geral esquemática da expressão e purificação da proteína de fusão; (C) análise de SDS-PAGE de expressão e a solubilidade da proteína de fusão após lise; (D) cromatograma da purificação da proteína de fusão do IMAC e análise das frações por SDS-PAGE (barra vermelha: barra de fração desacoplado, azul: fração de lavagem, preto bar: frações contendo o pico de eluição); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Figura 2 . Clivagem de seus6 sumô tag e purificação de proteínas de Httex1-QN marca-livre. Visão esquemática do (A); (B) análise da clivagem da marca de sumô com ULP1 por UPLC (azul: antes da adição de ULP1; preto: 20 min (23Q), respectivamente de 10 min (43Q) após a adição de ULP1) e BM (MAB5492 1: 2000, secundário de cabra anti rato anticorpo 1:5000); (C) cromatograma da purificação RP-HPLC preparativa de Httex1; D: análise do Httex1 purificado por UPLC, SDS-PAGE e ESI-MS; o peso molecular esperado é Da 9943 (23Q) e Da 12506 (43Q) respectivamente. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Figura 3 . Agregação de Httex1-43Q: ensaio de sedimentação (A) com base em UPLC. (B) CD espectros da estrutura secundária às 0 h e micrografias de 48 h. (C) temperatura dos agregados a 48 h (barras de escala são 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, apresentamos um protocolo robusto e otimizado para a produção de quantidades de miligrama de monômeros nativos, livre de marca e fibrilas do exon1 da proteína huntingtina (Httex1) com base na fusão transitória do ubiquitin pequeno modificador relacionados (SUMO).

Geração de nativos, sem marcas de formatação da huntingtina Exon1 monômero e fibrilas usando uma estratégia de fusão de sumô

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Este método nos permite produzir um éxon sem marcação contendo a sequência nativa da proteína e oferece novas oportunidades para estudar a função estrutural dessa proteína, permitindo-nos entender sua função na saúde e na doença. As principais vantagens aqui são a simplicidade, eficiência e robustez do método. Ao eliminar a heterogeneidade da sequência, este método permitirá e facilitará a comparação e a reprodutibilidade entre diferentes laboratórios.Embora este método tenha sido desenvolvido para a produção do exão um da huntingtina, também pode ser aplicado a outros sistemas propensos à agregação, como o peptídeo beta-amilóide e a alfa-sinucleína. Primeiro, filtre um sobrenadante previamente isolado contendo a proteína de fusão do exon um da His-SUMO Huntingtina usando um filtro de seringa de 0,45 micrômetro. Remover uma amostra de 20 microlitros do sobrenadante filtrado para análise SDS-PAGE.Encha o lisado clarificado em um Superloop. Isolar a proteína de fusão do exão de huntingtina His-SUMO um do lisado bacteriano clarificado por cromatografia de afinidade de metal imobilizado num sistema de cromatografia líquida de desempenho rápido a quatro graus Celsius. Passe 10 volumes de coluna ou 200 mililitros de tampão A a 10 mililitros por minuto para lavar as proteínas não ligadas.Eluir a proteína de fusão com 2,5 volumes de coluna ou 50 mililitros de tampão B a 100% a dois mililitros por minuto. Pegue 20 microlitros de cada fração para análise SDS-PAGE. Adicione 20 microlitros de corante de carga a cada amostra.Carregue dois microlitros da proteína bruta, a fração não ligada, a fração de lavagem e cada fração do pico de eluição em um gel de 15%. Execute o gel por 90 minutos a 180 volts. Quando a corrida terminar, manche o gel com o corante Coomassie de acordo com as instruções do fabricante.Agrupar as fracções que contêm a proteína de fusão de acordo com o pico do cromatograma. Em seguida, adicione DTT 100 milimolar e L-cisteína 100 milimolar às frações agrupadas e dissolva invertendo suavemente o tubo. Para preparar o solvente A para purificação por HPLC, adicione dois mililitros de ácido trifluoroacético a uma garrafa de água de dois litros.Para preparar o solvente B, adicione 2,5 mililitros de ácido trifluoroacético a uma garrafa de 2,5 litros de acetonitrila. Preparar o sistema de HPLC de acordo com as sugestões do fabricante. Execute uma execução em branco para garantir uma coluna limpa.Em seguida, tome 100 microlitros da proteína de fusão antes da adição de ULP1 para monitorar a reação de clivagem por UPLC. Transfira 20 mililitros da proteína de fusão para um novo tubo de 50 mililitros e adicione 0,4 mililitros de solução estoque ULP1. Incube a amostra no gelo e mantenha a proteína de fusão restante no gelo.Não armazene a proteína durante as etapas intermediárias e prossiga com a purificação até a conclusão. A cada 10 minutos, remova 100 microlitros da reação de clivagem para monitorar o progresso do UPLC. Após centrifugar as amostras, analisar dois microlitros de cada sobrenadante por UPLC.Comparar os cromatogramas obtidos para a amostra antes da adição de ULP1 e as amostras colhidas posteriormente. Quando a clivagem do SUMO estiver completa, filtre a amostra com um filtro de seringa de 22 micrômetros. Em seguida, purificar a amostra filtrada por HPLC de fase reversa.Analise as frações de HPLC por UPLC e ESI-MS. Pool frações de pureza semelhante em tubos de plástico de 50 mililitros. Congele as amostras em nitrogênio líquido e liofilize.Em seguida, transfira a proteína liofilizada para tubos de plástico de dois mililitros e armazene a 20 graus Celsius negativos. Dissolva 100 microgramas de exão liofilizado de Huntingtina um em cada oito microlitros de ácido trifluoroacético puro num tubo de 1,5 mililitros. Após incubação por 20 minutos à temperatura ambiente, evaporar cuidadosamente o ácido trifluoroacético sob uma capela de exaustão com uma corrente de nitrogênio ou argônio.Quando a proteína estiver seca, dissolva-a em 100 microlitros de água. Em seguida, analise dois microlitros de amostra por UPLC. Agora misture 20 microlitros de solução de proteína com 20 microlitros de corante de carga 2X.Analise amostras de proteína de um a 10 microgramas por SDS-PAGE. Execute o gel por 90 minutos a 180 volts. Quando a corrida terminar, manche o gel com o corante Coomassie de acordo com as instruções do fabricante.Prepare 10 mililitros de DPBS em um tubo de 50 mililitros. Filtre a solução de DPBS através de um filtro de 2 micrômetros antes de cada uso. Em seguida, dissolver 150 microlitros de exão de Huntingtina liofilizado um em 12 microlitros de ácido trifluoroacético puro num tubo de 1,5 milímetros.Após incubação por 20 minutos à temperatura ambiente, evaporar cuidadosamente o ácido trifluoroacético em uma capela com uma corrente de nitrogênio ou argônio. Dissolva a proteína desagregada em um mililitro de DPBS pré-resfriado e ajuste o pH entre 7,2 e 7,4 com hidróxido de sódio molar. Em seguida, filtre a solução de proteína através de um filtro centrífugo de 100 kilodalton em tubos de plástico de 1,5 mililitro.Determinar a concentração do exão um da huntingtina utilizando uma curva de calibração UPLC baseada na deteção da análise de aminoácidos. Em seguida, calcule a quantidade de DPBS que precisa ser adicionada para obter uma concentração de três micromolares Dilua a proteína em três micromolares adicionando a quantidade calculada de DPBS ao tubo de ensaio.Mantenha o tubo em gelo até o início do protocolo de agregação. A validação por eletromicroscopia e outras técnicas deve ser realizada para validar se o protocolo de desagregação foi bem-sucedido na remoção de quaisquer agregados pré-formados. A sequência completa de aminoácidos da proteína de fusão expressa é mostrada aqui.Um esquema do plasmídeo e da proteína de fusão expressa é exibido aqui. O éxon de His-SUMO Huntingtina um é expresso em nível médio, e a maior parte da proteína de fusão está presente na fração solúvel após a lise, tanto para a variante 23 glutaminas quanto para a variante 43 glutamina. Tanto a proteína de fusão do tipo selvagem quanto a mutante podem ser enriquecidas a aproximadamente 80% de pureza por cromatografia de afinidade de metal imobilizado.A clivagem da etiqueta His-SUMO e a purificação do éxon um de Huntingtina são mostradas aqui. O pico original da proteína de fusão é consumido e aparecem dois picos novos e bem separados correspondentes à etiqueta His-SUMO e ao exão de Huntingtina um. Tanto o exon da huntingtina um 23 glutaminas quanto as 43 glutaminas podem ser separados da marca His-SUMO por HPLC de fase reversa e foram obtidos em alta pureza, conforme mostrado pela análise UPLC, MS e SDS-PAGE.A cinética de agregação da formação de uma fibrila do éxon de m-Huntingtina, determinada por um ensaio de sedimentação, mostra depleção completa da proteína solúvel após 48 horas de incubação. A espectroscopia de CD da estrutura secundária da proteína mostra um desvio das glutaminas do exão 43 da huntingtina de não estruturada para a conformação rica em folhas beta. Essa mudança estrutural é acompanhada pela formação de agregados fibrilares longos, conforme observado pelo MET.Uma vez dominado, este método para a expressão e purificação do exão um da Huntingtina pode ser realizado em três dias se for realizado correctamente. Ao tentar este procedimento, é muito importante lembrar que as proteínas do exão um da Huntingtina, especialmente as proteínas com estiramento expandido de poliglutamina, têm uma propensão muito elevada para se agregarem. Graças a este método, somos capazes de produzir proteínas suficientes do exão um da Huntingtina e realizar estudos anteriormente inacessíveis para investigar a estrutura, agregação e toxicidade da proteína e desenvolver novos ensaios para detectar e quantificar a forma associada à doença do exão um da Huntingtina.A estabilidade e alta solubilidade da proteína de fusão SUMO proporcionam maior flexibilidade na manipulação da proteína e permitem a introdução de modificações no contexto das proteínas de fusão que de outra forma não seriam possíveis após a clivagem. Esperamos que a simplicidade e eficiência deste método elimine a necessidade de usar sequências não nativas e sistemas modelo e encoraje pesquisadores de diferentes disciplinas a se juntarem à nossa busca para entender a biologia desta importante proteína e desenvolver terapêuticas eficazes para o tratamento da doença de Huntington.

generation-native-untagged-huntingtin-exon1-monomer-fibrils-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Geração de fibrilas pré-formadas Alpha-synuclein de monômeros e uso in vivo

Este protocolo descreve a conversão de fibroblastos de pele em míobios e sua diferenciação em miotubes. As linhas celulares são derivadas de pacientes com distúrbios neuromusculares e podem ser usadas para investigar mecanismos patológicos e testar estratégias terapêuticas.

Reprogramação Direta de Fibroblastos Humanos em Myoblasts para investigar terapias para distúrbios neuromusculares

Fornecemos protocolos escaláveis que abrangem a conceção de construções, transfecção transitória e expressão e purificação de variantes da proteína huntingtina humana de comprimento total em células HEK293.

Produção Eficiente e Escalável de Variantes de Huntingtina Humana de Comprimento Completo em Células de Mamíferos utilizando um Sistema de Expressão Transitória

Descrevemos aqui um método para identificação de proteínas de ligação a pequenas moléculas usando marcação de fotoafinidade. A vantagem dessa técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular vivo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação na lise celular.

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Aprenda a produzir monômeros e fibrilas nativas da huntingtina Exon1 sem marcas, usando uma estratégia de fusão de sumô. Este método simples e robusto facilita estudos estruturais e funcionais da proteína em doenças neurodegenerativas.

Geração de nativos, sem marcas de formatação da huntingtina Exon1 monômero e fibrilas usando uma estratégia de fusão de sumô

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