Avaliação de agentes de indução Hyperpermeability vasculares na pele com o ensaio de milhas

O objetivo geral deste procedimento é medir o vazamento vascular na derme do camundongo que é induzido pela injeção intradérmica de agentes promotores de permeabilidade. Este procedimento pode ajudar a responder a questões-chave sobre a regulação da permeabilidade vascular in vivo, como quais moléculas podem estimular ou inibir o vazamento vascular e quais são as vias de sinalização envolvidas. A principal vantagem desse procedimento é que ele é rápido e relativamente simples e usa principalmente reagentes e materiais comuns de laboratório.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças com edema patológico. Em particular, os pesquisadores podem usar este ensaio para identificar novos alvos moleculares e testar drogas relevantes quanto à sua capacidade de inibir a permeabilidade vascular de maneira relativamente rápida e simples. Prepare soluções separadas do inibidor de histamina Maleato de Pirilamina e do Corante Azul de Evans, ambos em solução salina a 0,9%.

Em seguida, trabalhando em um gabinete de fluxo laminar, esterilize as soluções passando por um filtro de 0,22 micrômetro. Carregar as duas soluções em seringas separadas de um mililitro equipadas com agulhas de calibre 30. Em seguida, raspe o mouse.

Em seguida, incline o mouse de forma que a cabeça fique direcionada para o chão e o abdômen para cima. Depois que o camundongo estiver posicionado, administre 10 microlitros por grama de peso corporal de solução de maleato de pirilamina por injeção intraperitoneal. Em seguida, para promover a vasodilatação, coloque o camundongo em uma câmara de calor a 37 graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, mova o mouse para um limitador de mouse. Em seguida, esfregue a cauda com etanol 70% para maior vasodilatação. Administre 100 microlitros de solução de Evans Blue Dye por via intravenosa através da veia da cauda.

Para evitar sangramento, segure rapidamente a cauda entre um dedo e o polegar e aplique pressão no local da injeção. A injeção intravenosa de Evans Blue Dye na veia da cauda do camundongo é uma etapa difícil e crítica dentro deste procedimento. Assim, é essencial que os pesquisadores sejam competentes para realizar essa injeção antes de prosseguir com o restante do procedimento.

Estabelecer competência exigirá prática prévia. Use soluções estéreis de solução salina tamponada com fosfato para diluir o reagente VEGF de modo que o volume final da dose seja de 20 microlitros. Em seguida, carregue o reagente indutor de permeabilidade VEGF e o controle do veículo em duas seringas separadas de 300 microlitros equipadas com agulhas de calibre 31.

Mantenha a agulha em um ângulo de 15 graus com a pele e injete 20 microlitros de VEGF por via intradérmica no flanco do camundongo. Localize uma bolha elevada dentro da pele para validar a injeção bem-sucedida. Realize injeções intradérmicas em dois locais adicionais com pelo menos um centímetro de distância.

Em seguida, gire o mouse para expor o segundo flanco e repita as injeções triplicadas com a solução do veículo. Manter um registo em papel de cada um dos locais de injeção e a hora em que o procedimento de injeção é terminado. Em seguida, transfira o mouse para a gaiola inicial.

Continue monitorando o mouse até que ele recupere a consciência e comece a se mover pela gaiola. Deixe a solução VEGF agir por 20 minutos antes de chamar o mouse. Nesta fase, injete sequencialmente VEGFA e veículo em todos os camundongos seguindo o mesmo procedimento.

Após 20 minutos, posicione cada camundongo sacrificado de costas e prenda os pés em um quadro de cortiça envolto em um lenço de papel limpo. Em seguida, com a ajuda de uma tesoura romba, faça uma incisão vertical de três a quatro centímetros de comprimento da parte inferior do abdômen até o peito do rato morto. Em seguida, use uma pinça e bisturi para provocar a pele de ambos os lados do flanco.

Use o bisturi para remover qualquer gordura presente nas regiões ao redor do local do vazamento. Em seguida, use a pinça e o bisturi para extirpar as regiões da pele com corante azul Evans vazado. As regiões excisadas da pele devem ser de tamanho semelhante.

Transfira as amostras de pele para tubos de 1,5 mililitro e rotule de acordo. Seque a amostra colocando o tubo aberto em um bloco de calor durante a noite. Após a secagem estar completa, adicione 250 microlitros de formamida deionizada à amostra em uma capela de exaustão.

Feche a tampa do tubo e coloque-o em um bloco de calor durante a noite para extrair o corante Evans. Centrifugar as amostras a 10 000 g ou mais durante 40 minutos numa centrífuga de bancada. Após a centrifugação, transfira 100 microlitros de cada sobrenadante contendo corante da amostra centrifugada para os poços de uma placa de 96 poços operando em uma capela de exaustão.

Ler a absorbância do azul de Evans utilizando um espectrofotómetro. Para estudar o vazamento vascular induzido pelo VEGF, o camundongo é injetado com 50 nanogramas de VEGFA em solução salina tamponada com fosfato ou apenas solução salina tamponada com fosfato como veículo. A imagem mostra um aumento no acúmulo de corante azul de Evans vazado nas amostras de pele injetadas com VEGFA em comparação com o controle do veículo in situ.

Esta imagem de placa de 96 poços mostra o corante azul de Evans carregado extraído em formamida da amostra de pele. Este gráfico gráfico exibe os valores de absorbância normalizados de VEGFA emparelhado e amostras de controle somente de veículo. O gráfico mostra que a injeção de 50 nanogramas de VEGFA aumenta significativamente o vazamento de Evans Dye em comparação apenas com o veículo.

Este gráfico é obtido após quantificar as mudanças de dobra na densidade óptica para o VEGFA versus as amostras de veículos. O gráfico mostra um aumento médio de três vezes no vazamento vascular após a administração de VEGFA em comparação com o veículo apenas. Uma vez dominado, o segmento principal dessa técnica pode ser feito em duas horas, se executado corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante normalizar o vazamento vascular induzido por agente para o vazamento vascular induzido por veículo, de modo a levar em conta o vazamento vascular inespecífico e a variação entre camundongos. Este procedimento pode ser combinado com outros métodos, como a administração de medicamentos, a fim de responder a perguntas como se uma proteína pode ser direcionada para inibir a permeabilidade vascular. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia vascular explorarem os mecanismos moleculares da hiperpermeabilidade vascular em camundongos geneticamente modificados, identificando os principais componentes de sinalização necessários para o vazamento vascular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir e medir o vazamento vascular na derme do camundongo.