Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de ovários inteiros cultivados que sejam compatíveis com a quantificação folicular automatizada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia reprodutiva, como como diferentes condições interferem na aptidão ovariana. A principal vantagem dessa técnica é que ela é menos trabalhosa e mantém a arquitetura tridimensional do órgão.

Embora este método tenha sido otimizado para ovários de camundongos cultivados no quinto dia pós-natal, ele também pode ser aplicado a outras idades e tecidos, como gônadas embrionárias ou testículos de camundongos jovens. Comece com uma superfície de trabalho limpa. Limpe com alvejante a dez por cento e deixe o alvejante permanecer na superfície da área de trabalho por pelo menos cinco minutos.

Após cinco minutos, remova o excesso de alvejante com toalhas de papel limpas e etanol a 70%. Limpe bem o microscópio de dissecação com etanol a 70% e coloque uma toalha de papel seca no palco. Enrole pinças e tesouras limpas com uma toalha de papel umedecida com etanol a 70%.

Em seguida, faça 50 mililitros de meios de cultura de ovário em um tubo cônico e aqueça em banho-maria a 37 graus Celsius. Depois que o meio aquecer, prepare placas e inserções adicionando primeiro um mililitro de meio de cultura de ovário a placas de cultura de tecidos de 35 milímetros. Em seguida, adicione aproximadamente 0,55 mililitros de meio aos poços de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços e coloque uma inserção em cada poço contendo meio.

Certifique-se de que as membranas toquem a mídia. Coloque as placas de 35 milímetros e a placa de suporte de 24 poços em uma incubadora de 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono e oxigênio atmosférico. Em seguida, coloque uma placa quente ao lado do escopo de dissecção e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius.

Se a incubadora de cultura de tecidos não estiver perto da área de dissecção, coloque uma das placas de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo meios de cultura de ovário na placa quente. Em seguida, comece a dissecação borrifando a fêmea recém-sacrificada com 70% de etanol e coloque em cima da toalha de papel seca sob o microscópio de dissecação. Depois de fazer uma incisão na cavidade abdominal, expulse os intestinos e localize os ovários.

Extrair os ovários e colocá-los no meio de cultura na cápsula de 35 milímetros. Uma vez que os ovários tenham sido dissecados, aumente a ampliação do microscópio de dissecção para visualizar melhor os ovários e qualquer tecido aderido. Com uma pinça de ponta fina limpa, remova todo o tecido não ovariano, como bursa e tecido adiposo, sem danificar os ovários.

Em seguida, coloque cada par de ovários em uma inserção de cultura de células pré-embebida e ajuste o volume do meio para garantir que seja suficiente para manter o órgão úmido sem submergi-lo completamente. Coloque os órgãos explantados em uma incubadora de 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono e oxigênio atmosférico. No momento experimental desejado, remova o meio de cultura de ovário da placa e fixe os ovários cultivados na inserção, cobrindo o tecido com solução de PFA a quatro por cento recém-preparada.

Sele as bordas da placa com filme de parafina para evitar a evaporação e coloque as amostras a quatro graus Celsius durante a noite. Enxágue o tecido três vezes com etanol a 70%. Em seguida, armazene em frascos de cintilação cheios de etanol a 70% a quatro graus Celsius até o processamento posterior.

Comece a coloração removendo o etanol a 70% dos frascos e lavando o tecido fixo com PBS em temperatura ambiente com agitação por no mínimo quatro horas. Depois de remover o PBS, adicione solução de permeabilização suficiente para submergir completamente os ovários. Coloque em um agitador orbital e incube em temperatura ambiente por quatro horas.

Substitua a solução de permeabilização por solução de bloqueio suficiente para submergir completamente os ovários. Em seguida, incube os frascos selados à temperatura ambiente por um mínimo de 12 horas em um agitador orbital. Após o bloqueio, coloque as inserções em uma placa de 24 poços e adicione cerca de 750 microlitros de solução de anticorpo primário, garantindo que os ovários estejam completamente submersos.

Em seguida, coloque a placa selada no agitador orbital e incube por quatro dias em temperatura ambiente. Após quatro dias, remova o anticorpo primário e adicione uma quantidade generosa de solução de lavagem. Lave os ovários durante a noite.

No dia seguinte, substitua por uma solução de lavagem nova e incube no agitador orbital por duas horas ou mais. Após as lavagens, adicione solução de anticorpos secundários. Proteger as amostras da luz e incubar num agitador orbital à temperatura ambiente durante dois dias.

Após dois dias, remova a solução de anticorpo secundário das amostras e adicione a solução de lavagem. Comece preparando a solução de limpeza ScaleS0. Misturar a solução por inversão e incubar a 50 graus Celsius durante 30 minutos.

Desgaseifique a solução de limpeza ScaleS0. Em seguida, remova a solução de lavagem dos ovários imunomarcados. Adicione a solução de limpeza.

Cubra a placa com papel alumínio e devolva-a ao agitador orbital. É extremamente importante ser paciente durante as etapas de coloração e limpeza. Assim que o tecido se tornar transparente, use um bisturi de ponta fina para remover cuidadosamente as membranas de inserção que contêm os ovários cultivados.

Coloque a amostra em uma lâmina de vidro e cubra suavemente a amostra com uma lamínula. Em seguida, prossiga para obter imagens das amostras em um microscópio capaz de seccionamento óptico. Esta imagem mostra um ovário pós-natal do quinto dia que não foi limpo.

Aqui, o ovário é mostrado uma hora após a adição da solução de limpeza. O ovário começará a se tornar translúcido minutos após ser submerso na solução de limpeza. A secção óptica de ovários cultivados sem limpeza é possível, mas as células profundas do tecido têm um sinal difícil de diferenciar do fundo, o que impede a quantificação adequada do oócito.

Em contraste, esta imagem representativa mostra uma amostra limpa na qual a quantificação do oócito em todo o órgão é possível. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os anticorpos precisam se difundir pelo tecido; assim, tecidos mais espessos exigirão maior tempo de incubação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar, manchar e criar imagens de ovários inteiros.

O texto descreve o uso de um software livre, o Fiji ImageJ, que pode ser usado para quantificação folicular simples. Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído e azida sódica pode ser perigoso e precauções como o uso de capelas e equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.