Name: Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda imunofluorescência de órgão inteiro e limpeza de tecido para quantificação automatizada de folículos em ovários de camundongos. Este método preserva a arquitetura tridimensional do órgão e reduz o trabalho manual em estudos de biologia reprodutiva.

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Agradecemos a Rebecca Williams e Johanna Dela Cruz do Cornell BRC Imaging e Andrew Recknagel para sugestões úteis e assistência técnica. Este trabalho foi financiado de institutos nacionais de subsídio de saúde S10-OD018516 (para Cornell Imaging Facility), T32HD057854 para J.C.B. e R01-GM45415 para J.C.S.

Institucional Cuidado Animal da Universidade de Cornell e Comissão de utilização (IACUC) aprovou todos os métodos descritos aqui, sob o protocolo n. o 2004-0038 JCS.
1. preparação dos instrumentos e meios de cultura
<ol><li>Limpe a área de trabalho limpa com 10% de lixívia e permitir que a lixívia ficar na superfície da área de trabalho pelo menos 5 min. Depois de 5 min, retire a excesso lixívia com toalhas de papel limpo e 70% de etanol (EtOH). Limpar o microscópio dissecar cuidadosamente com 70% EtOH. Nota: É importante que a área de trabalho seja pelo menos semi estéril para evitar contaminação de culturas de órgão.</li>
	<li>Enrole limpo fórceps e a tesoura com uma toalha de papel umedecida com 70% EtOH até o tempo de uso. Nota: As ferramentas de dissecação ideal podem variar de acordo com a idade/tamanho do ovário. Os melhores resultados são obtidos usando um afiado micro dissecação scissor, duas pinças de ponta fina (qualquer número 5 ou 55) e um micro dissecando tesoura de íris.</li>
	<li>Em um tubo cônico, certifique-se 50 mL de meio de cultura de ovário e quente em banho maria a 37 ° C.<ol>
<li>Para tornar o meio de cultura de ovário4, suplemento 1 x Media mínimos essenciais (MEM) com 10% de soro Fetal bovino (FBS), 25mm (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES), 100 unidades/mL penicilina, estreptomicina 100 de µ g/mL, 0,25 µ g/mL Anfotericina B (por exemplo, 45 mL de MEM, 5 mL de calor inativada FBS, 1,25 mL de HEPES e 0,5 mL de 100 ações de x de anfotericina B, penicilina e estreptomicina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare pratos e inserções antes da cultura do ovário.<ol>
<li>Em uma capa de cultura de tecidos, adicione 1 mL de meio de cultura de ovário para uma placa de cultura de tecido de 35 mm.</li>
		<li>Pré-embebição inserir membrana com meio de cultura. Adicione mídia suficiente, geralmente cerca de 0,55 mL por bem, para o placa de cultura de tecido portador de 24-bem e coloque uma cultura celular de inserir no poço. Certifique-se de que membrana a inserção toca a mídia.</li>
		<li>Prepare o número de placas de 35 mm e poços com inserções de cultura celular de acordo com o número esperado de ovários no experimento. Coloca as placas de 35 mm, contendo 1 mL de meios de cultura e placa carregadora 24-poço contendo meios de cultura e inserções em um 37 ° C e 5% CO2atmosférica incubadora de2 O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organizar uma chapa quente ao lado do escopo de dissecação e seleccionar a temperatura de 37 ° c. Manter a 37 ° C, 5% de CO2 e a incubadora de2 O atmosférica está perto da sala de dissecação.</li>
</ol>2. ovário dissecção e cultura de órgãos
Nota: Ovários podem ser dissecados em temperatura ambiente, enquanto a exposição à temperatura não-ideal é mínima.
<ol><li>Eutanásia de ratos fêmeas no pós-Natal dia 5, por decapitação, uma de cada vez. Nota: A eutanásia deve ser conduzida de acordo com diretrizes IACUC presentes na instalação onde a pesquisa está sendo executada.</li>
	<li>Pulverizar o animal com 70% EtOH. Coloque o animal na parte superior da toalha de papel seca sob o microscópio de dissecação. Coloque um prato de cultura de tecido de 35 milímetros contendo meios de cultura de ovário perto o microscópio de dissecação.</li>
	<li>Com pinça ou tesoura de íris uma dissecação micro, fazer uma incisão através da pele do animal e na cavidade abdominal, com cuidado para não cortar os intestinos. Empurrar os intestinos fora da cavidade abdominal e localizar os ovários. Extrair os ovários e colocá-los na cultura de tecidos de 35mm cápsula contendo meios de cultura.</li>
	<li>Uma vez que os ovários têm sido dissecados do animal, aumente a ampliação do microscópio dissecação para visualizar melhor os ovários e qualquer tecido anexado. Com limpar a pinça de ponta fina, retire todos os não-tecido, tais como bursa e tecido adiposo. Tenha cuidado para manter os ovários intactos ao remover o anexo não-tecido.</li>
	<li>Uma vez que os ovários estão isolados, colocar o par as inserções de cultura de células previamente embebido da placa carregadora 24-poço (consulte os passos 1.4.2 e 1.4.3) e ajustar o volume do meio para garantir que é suficiente manter o órgão húmida (sem completamente submergindo-lo). Cuidado: Tenha cuidado para não fazer um buraco na membrana da inserção da cultura de pilha ao transferir os ovários.</li>
	<li>Lugar explantados órgãos em 37 ° C, 5% de CO2e incubadora de2 O atmosférica.</li>
	<li>Repita os passos 2.1-2.6 até os ovários de cada animal são dissecados e colocados na cultura de pilha inserir da 24-placa contendo meio de cultura de ovário.</li>
	<li>Mudança do meio de cultura de ovário cada 2 dias, usando aquecido alíquotas de mídia do ovário de banho maria a 37 ° C e prossiga para a parte 3 do protocolo no ponto desejado tempo experimental.</li>
</ol>3. fixação de tecidos
<ol><li>Em um tubo cônico de 15 mL, preparar paraformaldeído 4% (PFA) em tampão fosfato salino (PBS) de 1x (por exemplo, adicionar 2 mL de classe de microscopia eletrônica PFA de 16% para 6 mL de 1X PBS). Cuidado: PFA é uma substância perigosa e deve ser tratada sob uma capa de química.</li>
	<li>Corrigi os ovários culturas, sem remover o tecido da inserção da cultura, cobrindo o tecido com a solução recentemente preparada de PFA 4%. Selar as bordas da placa com adesivo plástico (para evitar a evaporação) e coloque as amostras a 4 ° C durante a noite. Nota: Para facilitar a manipulação e a integridade do tecido, evite deslocando ovários de inserção da cultura de célula ao longo de todo o procedimento. Ovários de culturas ligados à superfície da pastilha são vantajosos para manipulação sem danificar ou perder o órgão.</li>
	<li>Lave o tecido 3 x com 70% EtOH e também prosseguir para a etapa 4.1 ou loja, em frascos de cintilação cheio de 70% EtOH a 4 ° C até mais processamento. Nota: Se utilizar tecido endogenamente expressando proteínas fluorescentes, armazenando as amostras com 70% EtOH pode reduzir muito o sinal. Alternativamente, tecido pode ser lavado e armazenado na PBS com 0,2% de azida de sódio (NaN3). NaN3 no entanto, é altamente tóxico e representa um risco de graves por inalação. Faça a solução estoque na coifa e manipular a usar equipamento de protecção adequado como um laboratório casaco e nitrilo luvas.</li>
</ol>4. toda montagem de imunofluorescência
<ol><li>Coloque o tecido fixo em 1X PBS em RT para um mínimo de 4 h antes da etapa de permeabilização 4.3.</li>
	<li>Prepare a solução de permeabilização e solução de bloqueio.<ol>
<li>Prepare a solução de permeabilização conforme descrito. A PBS 1x, adicione 0,2% álcool polivinílico (PVA), solução de 0,1% de sódio borohidreto (NaBH4) (a partir de 12 wt.% em solução de hidróxido de sódio (NaOH) de 14 M) e 1,5% polietileno glicol tert -octilfenil éter (detergente tensoativo não-iônico). Em um tubo cónico de 50 mL, adicionar 5 mL de PBS de 10x, 0,1 g de PVA, 50 µ l de NaBH4e 750 µ l de detergente tensoativo não-iônico e, em seguida, adicione ultrapura até 50 mL de água e agitar bem à temperatura ambiente até obter uma mistura totalmente em solução.</li>
		<li>Prepare a solução de bloqueio conforme descrito. Para 1X PBS, adicionar 0,1% de tensoativo não-iônico detergente, 0,15% de pH de 2,5 M glicina 7.4, soro de cabra normal de 10%, 3% albumina de soro bovino (BSA), 0,2% NaN3, 100 penicilina unidades/mL, 100 µ g/mL Estreptomicina e 0,25 µ g/mL anfotericina B. preparem uma solução stock de 2.5 glicina de M, dissolvendo 93,8 g de glicina em água ultrapura para um volume final de 500 mL (pH 7,4) e uma solução de 10% NaN3 dissolvendo-se 5 g em 50 mL de água ultrapura; Então, em um tubo cónico de 50 mL preparar a solução de bloqueio pela adição de 5 mL de 1X PBS 10, 50 µ l de detergente tensoativo não-iônico, 750 µ l de solução de glicina, 5 mL de soro de cabra, 1,5 g de BSA, 1 mL da solução NaN3 e 0,5 mL de 100 ações de x de anfotericina B, penicilina e estreptomicina. Adicione água ultrapura até um volume final de filtro 50 mL e a seringa a solução final.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova e descarte a PBS 1x do frasco e adicione suficiente solução de permeabilização para submergir completamente os ovários. Coloca a amostra em solução de permeabilização em um agitador orbital (por exemplo, nutator) à temperatura ambiente durante 4 h. Nota: O tempo de incubação pode variar de acordo com a espessura do órgão.</li>
	<li>Substitua a solução de permeabilização suficiente solução bloqueio para submergir completamente os ovários. Feche o frasco com o adesivo plástico e deixar o tecido incubando durante um período mínimo de 12 horas a temperatura ambiente em um agitador orbital.</li>
	<li>Prepare a diluição de anticorpo primário em solução de bloqueio conforme o datasheet do fabricante. Nota: Observe que nem todos os anticorpos são compatíveis com o despachante. O volume médio necessário por amostra é aproximadamente 750 µ l.<ol>
<li>Para a quantificação do oócito, use TAp63 (marcador nuclear oócito) e MVH (marcador citoplasmática de células germinativas). Nota: Os anticorpos utilizados nas imagens de imunofluorescência são de rato anti-p63 e coelho anti-MVH). A solução de anticorpo primário pode ser reutilizado 2 x ou mais, se armazenado a 4 ° C entre protocolos de coloração e tratada adequadamente para evitar o crescimento bacteriano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque a pastilha que contém o tecido em uma placa de 24 e adicionar cerca de 750 µ l de solução de anticorpo primário. Certifique-se de que os ovários estão completamente submersos. A placa com adesivo plástico para minimizar a evaporação e deixam o tecido incubando por 4 dias à temperatura ambiente em um agitador orbital do selo.</li>
	<li>Prepare a solução de lavagem.<ol>
<li>Prepare a solução de lavagem como descrito. Faça 1X PBS, adicione 0,2% PVA e 0,15% tensoativo não-iônico de detergente. Em um tubo cónico de 50 mL, adicione 5 mL de PBS de 10x, 0,1 g de PVA, 75 µ l de detergente tensoativo não-iônico e água ultrapura até um volume final de 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova a diluição do anticorpo primário e adicione uma generosa quantidade de solução de lavagem. Sempre certifique-se de submergir os ovários. Permitir que os ovários de molho na solução durante a noite à temperatura ambiente no agitador orbital.</li>
	<li>Substitua a solução de lavagem e incubar no agitador orbital por 2 h ou mais.</li>
	<li>Repita a etapa 4.9 uma vez adicional.</li>
	<li>Prepare a diluição do anticorpo secundário em solução de bloqueio. Nota: Os anticorpos secundários utilizados são anti-rato 488 tintura fluorescente cresceu na cabra e anticoelho 594 tintura fluorescente erguido em cabra. Consulte a etapa 4.5. para o volume médio necessário por amostra.</li>
	<li>Remover a solução de lavagem dos ovários e adicionar solução de anticorpo secundário. Proteger as amostras da luz (envoltório placa com folha de alumínio) e a placa com adesivo plástico para minimizar a evaporação do selo. Incube as amostras em um agitador orbital em temperatura ambiente por 2 dias. Nota: Continue protegendo as amostras de luz usando a folha de alumínio durante todas as etapas subsequentes de incubação.</li>
	<li>Remover a solução de anticorpo secundário das amostras e adicionar a solução de lavagem. Incube em um agitador orbital para 8 h. Nota: Se a coloração de 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) é desejada, adicione 50 ng/mL de DAPI para a primeira etapa de lavagem (incubação ~ 8 h).</li>
	<li>Substitua a solução de lavagem para uma lavagem durante a noite.</li>
	<li>Enquanto se prepara a solução de limpeza (ver seção 5), substituir o pernoite solução com solução fresca de lavagem e manter as amostras no agitador orbital à temperatura ambiente.</li>
</ol>5. ovário limpando e imagem
<ol><li>Prepare ScaleS(0) solução de compensação.<ol>
<li>Preparar ScaleS(0) solução10 de compensação pela adição de reagentes na proporção dada: sorbitol D-(-) de 40% (p/v), 10% de glicerol, ureia de 4,3 M e 20% dimetilsulfóxido (DMSO), pH 8.1 (por exemplo, em um tubo cónico de 50 mL, adicionar 2,5 mL de glicerol, 10 g de sorbitol , 5 mL de DMSO e 12 mL de 9 M de ureia para um volume total de 25 mL. Misture a solução por inversão a 50 ° C por 30 min e desgaseificar antes do uso).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remover a solução de lavagem e submergir as amostras em solução de compensação. Para melhores resultados, manter as amostras no agitador orbital.</li>
	<li>Substitua a solução de limpeza 2 x diariamente até que o tecido se torna transparentes (aproximadamente 2 dias).</li>
	<li>Uma vez que o tecido estiver desmarcado, preparar a amostra para a imagem latente, removendo cuidadosamente a inserir membrana contendo os ovários cultivados com uma multa dica bisturi e colocar a amostra sobre uma lâmina de vidro.</li>
	<li>Prossiga para as amostras em um microscópio capaz de seccionamento óptico de imagem.</li>
</ol>6. oócito quantificação
Nota: Existem muitos tipos diferentes de programas que são capazes de quantificar as células. Descrito abaixo, é um protocolo para quantificação do oócito usando o pacote de processamento de imagem não-comercial, FIJI-ImageJ14.
<ol><li>Usando uma projeção de intensidade máxima achatada da Z -pilha imagem série para os marcadores celulares específicos de interesse (sem canal da DAPI), converter a imagem em uma imagem de 8 bits preto e branca sob o tipo em suspenso a imagem no menu.</li>
	<li>Sob o menu drop-down de imagem , destacar a guia de ajuste e selecione limiar.</li>
	<li>Ajuste manualmente o limiar para um nível que melhor identifica cada oócito individual. Uma vez que o nível é determinado, clique em aplicar para gerar uma imagem preto e branca. Depois de concluído, quantificar a amostra usando delimitando o ícone Oval ou Freehand . Nota: FIJI-ImageJ tem diferentes opções para ajustar a imagem que será utilizada para a quantificação de partículas. Por exemplo, no processo de | Binária guia, existem opções diferentes que podem ser usadas para melhorar a detecção de que será contado. Na Figura 4, as opções usadas para melhor, individualizar os folículos foi Erode, seguido por preencher os buracose, finalmente, divisor de águas.</li>
	<li>Sob o menu drop-down de Analyze , seleccione Analyze partículas. Defina os parâmetros de acordo com a resolução desejada.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O estudo da reprodução dos mamíferos requer usando e quantificação de células especializadas que não são rotineiramente passíveis de cultura de células. No entanto, sistemas de cultura ex vivo são eficazes na manutenção do ovário e do folículo viabilidade1,15. Durante a cultura do ovário, o tecido requer uma maior área de superfície para a troca de nutrientes através da difusão. Portanto, 5 - dia velho rato ovários são ideais em tamanho e forma para a cu...

A fim de estudar a composição celular e características morfológicas dos ovários de mamíferos, os cientistas muitas vezes dependem de experiências na vivo seguidas de reagidos coloração dos ovários de parafina incorporado. Mais recentemente, porém, cultura de ovário todo órgão tem provado para ser uma alternativa eficaz para estudar a função ovárica1,2,3,4 , porque a técnica pode ser acoplada com melhor visualização e ferramentas de quantificação. Tradicionalmente, a análise da morfologia ovariana depende reconstrução tridimensional arquitetura de ovário de parafina incorporada seções serial, mas, além de ser trabalhosa e demorada, serialmente seccionamento tecido parafina incorporado é que não garantia a reconstrução adequada do órgão, e seções são muitas vezes perdidas ou mis ordenou no processo.
Além dos desafios técnicos associados com seccionamento serial, também há variações nos métodos usados rotineiramente para quantificar números do folículo por ovário5,6. A variabilidade metodológica utilizada atualmente prejudica a meta-análise da reserva ovariana através de estudos de5,7. Por exemplo, números de folículo de artigos de pesquisa diferentes podem variar por 10 vezes ou mais entre as idades de desenvolvimento semelhantes dentro de uma cepa específica de6. Estas grandes diferenças na quantificação do folículo relatado podem levar a confusão e tem impedido o estudo transversal comparações. Experimentalmente, as abordagens tradicionais para quantificação de folículo de seções seriais são executadas pela contagem de folículos de um número pré-definido de seções (por exemplo, cada quinto, décimo, ou outra seção). Variabilidade nas contagens de folículo usando esta abordagem surge não só de periodicidade em quais seções são contadas, mas também de variações na espessura de corte e a experiência técnica na geração de seções serial5,6. Além de sua variabilidade, outra desvantagem de seccionamento de tecido tradicional é que o seccionamento dos ovários pequenos de animais jovens é especialmente desafiador e altamente dependente de orientação de tecido8.
O protocolo abaixo descreve uma técnica de cultura de ovário rotineiramente utilizados1 mas grandemente melhora a quantificação de folículo tradicional substituindo seccionamento físico com tecido de compensação e seccionamento óptico utilizando microscopia confocal8 ,9. Limpar utilizando a imersão de tecido (sem a necessidade de perfusão transcraniana ou electroforese) em um e sorbitol-à base de ureia solução (por exemplo, ScaleS(0)10) provou ser compatível com a imunocoloração e permitiu a redução do tempo de compensação sem comprometer a profundidade da imagem. Outros métodos relatados (por exemplo, ScaleA28,10, SeeDB11, Clear12e ClearT212) estão mais tempo consumindo ou não permitem resolução óptica em profundidade da amostra. Seccionamento óptico é vantajoso porque é menos trabalhoso e mantém arquitetura tridimensional7,8 do órgão. Outra vantagem desta abordagem é que a preparação das amostras não requer reagentes caros para limpar o tecido e pode ser realizada com relativa facilidade.
Especificamente, o protocolo descrito foi otimizado para ovários rato cultivados em cinco dias pós-natal, mas tem sido conduzido nos ovários desde dia pós-natal 0 - 10. O método faz uso de um sistema de cultura de ovário em que o tecido naturalmente anexa à membrana no qual é culta, facilitando a manipulação de órgãos e manipulação. O sistema de cultura descrito pode ser usado para manter explantados ovários durante 10 dias e para avaliar como diferentes condições experimentais podem interferir com o oócito sobrevivência13. O procedimento de quantificação descrito é executado usando a pacote FIJI-ImageJ14 de processamento de imagem não-comercial e pode ser realizado na maioria dos computadores pessoais. Além disso, imagens usadas para quantificação podem ser feitas amplamente disponíveis para a comunidade científica, permitindo assim para meta-análise futura.

<table><tbody><tr><td>Tesoura de micro dissecação 4.5", reta, pontas afiadas</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Tesoura de micro dissecação</td></tr><tr><td>Pinça estilo joalheiro 4-3/8", estilo 5</td><td>Pinça de ponta fina</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305X</td></tr><tr><td>Tesoura de íris micro 4", pontas retas e afiadas</td> Tesoura de íris micro dissecante <td>Integra</td><td>Miltex 18-1618</td><td>ou tesoura de mola micro dissecante</td></tr><tr><td>1X Minimal Essential Media (MEM)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td> <td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td> <td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Usado na Etapa 1.3.1</td></tr><tr><td>Prato Tratado com Cultura de Tecidos de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Nunc & trade; Placa de suporte de 24 poços para inserções de cultura de células</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>Tamanho dos poros: 8&mu; m</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td>Solução de 16%</td></tr><tr><td>1X Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Nutator mixer GyroTwister&trade;</td><td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td><td>agitador tridimensional</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Solução de borohidreto de sódio (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452904-25ML</td><td>Use a solução, em vez do forma de comprimido ou pó&nbsp;</td></tr><tr><td>Álcool Polivinílico (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td>Solúvel em água fria</td></tr><tr><td>Triton&trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>polietilenoglicol éter terc-octilfenílico</td></tr><tr><td>Filtros de seringa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>725-2520</td><td>25mm</td></tr><tr><td>10mL Seringas</td><td>BD</td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo anticorpo anti-p63 (4A4)</td><td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>Coelho anticorpo anti-MVH</td><td>Abcam</td><td>ab13840</td><td>Diluição 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; anti-rato para cabras 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>Diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; anti-coelho para cabras 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Diluição 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)sorbitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240850-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Software de processamento de imagem</td></tr><tr><td>Pipetas de transferência de plástico descartáveis</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários mouse culta

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Pesquisa no campo da biologia reprodutiva de mamíferos, muitas vezes envolve avaliar a saúde geral dos ovários e testículos. Especificamente, nas fêmeas, aptidão ovário frequentemente é avaliada pela visualização e quantificação dos folículos e ovócitos. Porque o ovário é um tecido tridimensional opaco, abordagens tradicionais exigem laboriosamente, cortar o tecido em numerosas seções seriais para visualizar células por todo o órgão inteiro. Além disso, porque a quantificação por este método geralmente envolve apenas um subconjunto das seções separadas pelo diâmetro aproximado de um oócito de pontuação, é propenso a imprecisão. Aqui, um protocolo é descrito que em vez disso, utiliza compensação de tecido de todo órgão e mancha da imunofluorescência de ovários de rato para visualizar os folículos e ovócitos. Em comparação com as abordagens mais tradicionais, este protocolo é vantajoso para a visualização de células dentro do ovário por vários motivos: 1) o ovário permanece intacto em toda a preparação das amostras e processamento; 2) pequenos ovários, que são difíceis de seção, podem ser examinados com facilidade; 3) celular quantificação é alcançada mais facilmente e com precisão; e 4) o órgão todo fotografado.

Este protocolo inclui 6 etapas principais a seguir dissecação dos ovários, conforme descrito na Figura 1. Figura 2 , Figura 3 , Figura 4 destacar as características mais inovadores do presente protocolo, que incluem a otimização do tecido de compensação para os ovários e quantificação de oócito todo tecido usando FIJI...

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar os folículos nos ovários culturas de ratos jovens sem seccionamento serial. Usando a imunofluorescência todo órgão e tecido de compensação, seccionamento físico é substituído com seccionamento óptico. Este método de preparação da amostra e visualização mantém a integridade do órgão e facilita a quantificação automatizada de células específicas.

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de ovários inteiros cultivados que sejam compatíveis com a quantificação folicular automatizada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia reprodutiva, como como diferentes condições interferem na aptidão ovariana. A principal vantagem dessa técnica é que ela é menos trabalhosa e mantém a arquitetura tridimensional do órgão.Embora este método tenha sido otimizado para ovários de camundongos cultivados no quinto dia pós-natal, ele também pode ser aplicado a outras idades e tecidos, como gônadas embrionárias ou testículos de camundongos jovens. Comece com uma superfície de trabalho limpa. Limpe com alvejante a dez por cento e deixe o alvejante permanecer na superfície da área de trabalho por pelo menos cinco minutos.Após cinco minutos, remova o excesso de alvejante com toalhas de papel limpas e etanol a 70%. Limpe bem o microscópio de dissecação com etanol a 70% e coloque uma toalha de papel seca no palco. Enrole pinças e tesouras limpas com uma toalha de papel umedecida com etanol a 70%.Em seguida, faça 50 mililitros de meios de cultura de ovário em um tubo cônico e aqueça em banho-maria a 37 graus Celsius. Depois que o meio aquecer, prepare placas e inserções adicionando primeiro um mililitro de meio de cultura de ovário a placas de cultura de tecidos de 35 milímetros. Em seguida, adicione aproximadamente 0,55 mililitros de meio aos poços de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços e coloque uma inserção em cada poço contendo meio.Certifique-se de que as membranas toquem a mídia. Coloque as placas de 35 milímetros e a placa de suporte de 24 poços em uma incubadora de 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono e oxigênio atmosférico. Em seguida, coloque uma placa quente ao lado do escopo de dissecção e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius.Se a incubadora de cultura de tecidos não estiver perto da área de dissecção, coloque uma das placas de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo meios de cultura de ovário na placa quente. Em seguida, comece a dissecação borrifando a fêmea recém-sacrificada com 70% de etanol e coloque em cima da toalha de papel seca sob o microscópio de dissecação. Depois de fazer uma incisão na cavidade abdominal, expulse os intestinos e localize os ovários.Extrair os ovários e colocá-los no meio de cultura na cápsula de 35 milímetros. Uma vez que os ovários tenham sido dissecados, aumente a ampliação do microscópio de dissecção para visualizar melhor os ovários e qualquer tecido aderido. Com uma pinça de ponta fina limpa, remova todo o tecido não ovariano, como bursa e tecido adiposo, sem danificar os ovários.Em seguida, coloque cada par de ovários em uma inserção de cultura de células pré-embebida e ajuste o volume do meio para garantir que seja suficiente para manter o órgão úmido sem submergi-lo completamente. Coloque os órgãos explantados em uma incubadora de 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono e oxigênio atmosférico. No momento experimental desejado, remova o meio de cultura de ovário da placa e fixe os ovários cultivados na inserção, cobrindo o tecido com solução de PFA a quatro por cento recém-preparada.Sele as bordas da placa com filme de parafina para evitar a evaporação e coloque as amostras a quatro graus Celsius durante a noite. Enxágue o tecido três vezes com etanol a 70%. Em seguida, armazene em frascos de cintilação cheios de etanol a 70% a quatro graus Celsius até o processamento posterior.Comece a coloração removendo o etanol a 70% dos frascos e lavando o tecido fixo com PBS em temperatura ambiente com agitação por no mínimo quatro horas. Depois de remover o PBS, adicione solução de permeabilização suficiente para submergir completamente os ovários. Coloque em um agitador orbital e incube em temperatura ambiente por quatro horas.Substitua a solução de permeabilização por solução de bloqueio suficiente para submergir completamente os ovários. Em seguida, incube os frascos selados à temperatura ambiente por um mínimo de 12 horas em um agitador orbital. Após o bloqueio, coloque as inserções em uma placa de 24 poços e adicione cerca de 750 microlitros de solução de anticorpo primário, garantindo que os ovários estejam completamente submersos.Em seguida, coloque a placa selada no agitador orbital e incube por quatro dias em temperatura ambiente. Após quatro dias, remova o anticorpo primário e adicione uma quantidade generosa de solução de lavagem. Lave os ovários durante a noite.No dia seguinte, substitua por uma solução de lavagem nova e incube no agitador orbital por duas horas ou mais. Após as lavagens, adicione solução de anticorpos secundários. Proteger as amostras da luz e incubar num agitador orbital à temperatura ambiente durante dois dias.Após dois dias, remova a solução de anticorpo secundário das amostras e adicione a solução de lavagem. Comece preparando a solução de limpeza ScaleS0. Misturar a solução por inversão e incubar a 50 graus Celsius durante 30 minutos.Desgaseifique a solução de limpeza ScaleS0. Em seguida, remova a solução de lavagem dos ovários imunomarcados. Adicione a solução de limpeza.Cubra a placa com papel alumínio e devolva-a ao agitador orbital. É extremamente importante ser paciente durante as etapas de coloração e limpeza. Assim que o tecido se tornar transparente, use um bisturi de ponta fina para remover cuidadosamente as membranas de inserção que contêm os ovários cultivados.Coloque a amostra em uma lâmina de vidro e cubra suavemente a amostra com uma lamínula. Em seguida, prossiga para obter imagens das amostras em um microscópio capaz de seccionamento óptico. Esta imagem mostra um ovário pós-natal do quinto dia que não foi limpo.Aqui, o ovário é mostrado uma hora após a adição da solução de limpeza. O ovário começará a se tornar translúcido minutos após ser submerso na solução de limpeza. A secção óptica de ovários cultivados sem limpeza é possível, mas as células profundas do tecido têm um sinal difícil de diferenciar do fundo, o que impede a quantificação adequada do oócito.Em contraste, esta imagem representativa mostra uma amostra limpa na qual a quantificação do oócito em todo o órgão é possível. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os anticorpos precisam se difundir pelo tecido; assim, tecidos mais espessos exigirão maior tempo de incubação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar, manchar e criar imagens de ovários inteiros.O texto descreve o uso de um software livre, o Fiji ImageJ, que pode ser usado para quantificação folicular simples. Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído e azida sódica pode ser perigoso e precauções como o uso de capelas e equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

whole-mount-immunofluorescence-follicle-quantification-cultured-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo descreve a cultura primária / co-cultura de tecido ovariano rato, usando ovários de camundongos recém-nascidos e folículos ovarianos individuais de ratos pré-púberes. As técnicas de cultura de suportar o desenvolvimento de uma forma altamente fisiológico, que permita a investigação do efeito de agentes extrínsecos no ovário, e das interacções entre os folículos do ovário.

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

Culturas de tecido ovarianos podem ser usadas como modelos de atresia de folículo, ovulação e desenvolvimento do folículo e indicar mecanismos reguladores de processos dinâmicos de ovário.

Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse

Aqui, descrevemos, comparamos e contrastamos duas técnicas diferentes para a contagem precisa de folículos de tecidos ovarianos fixos do rato.

Enumeração de folículo preciso em ovários de rato adulto

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para imagens de ovários inteiros para análises quantitativas e qualitativas utilizando imunosscopia de montagem integral, microscopia multifotínica e visualização e análise 3D. Este protocolo acomoda um processamento de alto rendimento, confiável e repetível que é aplicável para toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação.

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Aqui, descrevemos um protocolo para toda montagem imunofluorescência e baseados em imagem volumétrica análise quantitativa de embriões adiantados de rato de palco. Apresentamos esta técnica como uma poderosa abordagem qualitativa e quantitativamente avaliar estruturas cardíacas durante o desenvolvimento, e propor que seja amplamente adaptável a outros sistemas de órgãos.

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

O ovário de Drosophila é um sistema excelente modelo para estudar o desenvolvimento de nicho de células-tronco. Embora métodos para dissecando larvas e adultos ovários foram publicados, dissecções de ovário pupal requerem diferentes técnicas que não tenham sido publicadas em detalhe. Aqui nós esboçamos um protocolo para dissecar, coloração e montagem ovários pupal.

Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila

Aprenda imunofluorescência de órgão inteiro e limpeza de tecido para quantificação automatizada de folículos em ovários de camundongos. Este método preserva a arquitetura tridimensional do órgão e reduz o trabalho manual em estudos de biologia reprodutiva.

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

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