Injeções de lipopolissacarídeo em camundongos para imitar a entrada de produtos de origem microbiana após a quebra da barreira Intestinal

O objetivo geral deste experimento é apresentar um modelo que imite a entrada de produtos derivados de micróbios após uma violação da barreira intestinal. Este modelo pode ser usado para investigar respostas imunes após invasão de microrganismos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da doença inflamatória intestinal, como inflamação descontrolada, que é caracterizada por um aumento da permeabilidade epitelial intestinal.

A principal vantagem dessa técnica é que ela não apenas usa uma bomba definida, mas também é uma abordagem descomplicada que não requer cirurgia e pode ser usada em todos os ambientes de laboratório. Demonstrando o procedimento estaremos eu, Rachel Mak'Anyengo, uma pós-doutoranda, e Berna Kaya, uma estudante de doutorado. Manuseie o rato com cuidado, mas com firmeza, e prenda o animal com uma mão.

Certifique-se de que o mouse esteja bem segurado e possa respirar normalmente. Incline o nariz do rato ligeiramente para o chão para expor o abdómen para injeção. Localize a linha média do abdômen e injete o volume de LPS necessário no lado inferior esquerdo ou direito.

É muito importante garantir que a agulha entre na cavidade peritoneal para evitar injeções incorretas. A agulha também não deve penetrar muito fundo na cavidade peritoneal para evitar lesões nos órgãos internos. Gentilmente, retorne o animal para a gaiola de casa.

Monitore os camundongos quanto à ocorrência e gravidade da endotoxemia no momento da injeção e a cada duas horas a partir de então por oito horas. Registre as observações na folha de pontuação anexa. Prepare os tubos de coleta adicionando um mililitro de reagente de isolamento de RNA de etapa única a dois tubos de mililitro pré-preenchidos com esferas de cerâmica de 1,4 milímetro.

Depois de sacrificar e ensanguinar o camundongo, use uma tesoura para cortar a pele e a camada muscular, expondo a cavidade abdominal com os órgãos internos. Disseque cuidadosamente o baço, fígado e cólon. Limpe a gordura de cada órgão e coloque em PBS no gelo.

Em seguida, use uma tesoura ou um bisturi para cortar um pedaço de 0,5 centímetro de comprimento de cada órgão. Seque brevemente o tecido em um pedaço de papel e coloque-o no tubo de coleta, certificando-se de que esteja completamente imerso em reagente de isolamento de RNA. Em seguida, homogeneizar o tecido em um homogeneizador de bancada de alta velocidade.

Para tecidos moles como baço, fígado e cólon, use um ciclo de homogeneização em alta velocidade por 30 segundos. Após a homogeneização, incubar as amostras durante cinco minutos à temperatura ambiente. Mergulhe cuidadosamente os tubos em nitrogênio líquido para congelar o lisado do tecido.

Armazene o lisado congelado a 80 graus Celsius negativos até o isolamento do RNA. Comece o isolamento do RNA descongelando o lisado de tecido congelado no gelo. Depois de descongelado, centrifugue a amostra a 1000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para pellet as partículas de tecido restantes que possam ter sobrado

Após a centrifugação, transfira os sobrenadantes para um novo tubo de 1,5 mililitro sem nuclease e adicione 200 microlitros de clorofórmio gelado por um mililitro de reagente de isolamento de RNA. Agite imediatamente o grilly por 10 a 15 segundos. Depois de incubar as amostras durante dois a três minutos à temperatura ambiente, centrifugar a 12 000 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius.

A amostra agora conterá três fases, a fase inferior de clorofórmio de fenol vermelho, a interfase e a fase aquosa incolor superior. Colete a fase aquosa superior contendo RNA e transfira para um novo tubo de 1,5 mililitro sem nuclease. Para precipitar o RNA, adicione 0,5 mililitros de isopropanol gelado por um mililitro de reagente de isolamento de RNA e misture suavemente invertendo o tubo cinco a seis vezes.

Depois de incubar por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente, centrifugue a 12.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após centrifugação, remover completamente o sobrenadante que contém o isopropanol sem perturbar o gancho. Em seguida, lave os pellets com um mililitro de etanol gelado a 75% por um mililitro de reagente de isolamento de RNA usado para a lise inicial e vortex a amostra brevemente.

Depois de centrifugar a amostra a 7500 ou 12 000 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius, remover completamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Deixe os tubos abertos sob a capa química por três a cinco minutos para secar ao ar o pellet de RNA em temperatura ambiente. Em seguida, dissolva o pellet de RNA em 20 a 50 microlitros de água livre de nuclease, pipetando cuidadosamente para cima e para baixo.

Em seguida, incube a amostra a 55 graus Celsius por 10 a 15 minutos para melhorar ainda mais a solução do RNA. Digerir o DNA contaminante adicionando primeiro água livre de nuclease a um máximo de 10 microgramas de RNA, de modo que o volume final seja de 50 microlitros após a adição de tampão e enzima. Em seguida, adicione cinco microlitros de tampão 10X DNase 1 e um microlitro de DNase 1 recombinante por amostra e misture delicadamente pipetando para cima e para baixo.

Incube a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Após a incubação, vortex a DNase no reagente de ativação, adicione cinco microlitros à amostra e misture bem. Incube por cinco minutos em temperatura ambiente, misturando ocasionalmente à mão.

Depois de centrifugar a 10 000 vezes G durante um minuto e meio, transferir o sobrenadante que contém o ARN isento de ADN para um novo tubo isento de nuclease. Finalmente, medir a concentração e a qualidade do RNA por espectrofotômetro. Após a injeção de LPS, o escore da doença, que inclui avaliações da aparência e atividade dos animais, abertura dos olhos e frequência e qualidade respiratória, foi plotado no eixo Y em relação ao tempo no eixo X.

A QPCR para quantificar a expressão de citocinas revelou que a Il6 atingiu o pico duas horas após a injeção de LPS no baço e no cólon e quatro horas após a injeção no fígado. A expressão de Il1 beta, Tnf alfa e Il10 atingiu o pico quatro horas após a injeção em todos os tecidos. Em oito horas, a expressão de Il6, Il1 beta, Tnf alfa e Il10 retornou aos níveis basais.

Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de considerar a dose de LPS, o estado de higiene dos camundongos, o momento do término do experimento e, o mais importante, o histórico genético da cepa do camundongo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como imitar a entrada de compostos derivados de bactérias em um hospedeiro após uma violação de barreira. A dose baixa e subletal de LPS injetada sistematicamente em camundongos induz a regulação positiva de citocinas pró-inflamatórias, que são quantificadas pela análise de PCR RGQ.