Name: Impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica em um sistema de Langendorff Ex Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a analisar e modular o sistema nervoso autônomo intracardíaco usando preparação Langendorff ex vivo. Este método permite estudar eletrofisiologia, arritmogênese e dinâmica de cAMP em corações isolados.

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Os autores gostaria agradecer Hartwig Wieboldt por sua excelente assistência técnica e o UKE microscopia Imaging Facility (Umif) da universidade médica centro de Hamburgo-Eppendorf para fornecer suporte e microscópios. Esta pesquisa foi financiada bythe Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. e pelo DZHK (centro alemão de pesquisa Cardiovascular) [FKZ 81Z4710141].

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelas autoridades locais das comissões de uso, cuidados com animais da Universidade de Hamburgo e o estado de Hamburgo.
1. preparação do aparato de Langendorff
Nota: Um sistema de perfusão de Langendorff comercialmente disponível é usado.
<ol><li>Preparar uma solução de Krebs-Henseleit modificada (119 mM de cloreto de sódio, 25 mM de bicarbonato de sódio, 4,6 mM de cloreto de potássio, 1,2 mM de fosfato de potássio monobásico, 1,1 mM de sulfato de magnésio, 2.5 mM de cloreto de cálcio, 8,3 mM de glicose e 2 mM de sódio piruvato). Adicione uma mistura de 95% de dióxido de carbono de oxygen/5% para a solução de perfusão para evitar a precipitação do cálcio. Filtre o buffer com um tamanho de poros de 0,22 µm.</li>
	<li>Adicione um agente farmacológico para o buffer para investigar seu efeito na eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica conforme necessário.</li>
	<li>Comece o banho de água e coloque a solução de perfusão, incluindo uma mistura de 95% de dióxido de carbono de oxygen/5% nele. Ajuste a temperatura do banho de água, para que a temperatura de solução de perfusão diretamente antes da cânula é ~ 37 ˚ c.</li>
	<li>Inicie a bomba de roletes e encher o aparelho com a solução de perfusão assim que atingir a temperatura correta.</li>
	<li>Ajuste a taxa de bomba antes de anexar o coração, para que nenhuma bolha de ar é deixada na cânula quando montá-lo para o aparelho.</li>
</ol>2. hard - e Software de preparação
<ol><li>Ligar um sistema de aquisição de dados digitais e seu software correspondente ao aparelho de Langendorff para uma gravação contínua da pressão de perfusão, taxa de fluxo e frequência cardíaca.<ol>
<li>Ajustar a pressão de perfusão alvo nas configurações gerais para 80 mmHg.</li>
		<li>Inicie a gravação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um cateter de eletrofisiologia (Tabela de materiais) com eléctrodos de platina, uma superfície de eletrodo de 0,5 x 0,5 mm e um espaçamento de eletrodo de 0,5 mm para a gravação de dados e estimulação com um gerador de estímulo digital designado.<ol>
<li>Coloque o cateter perto da área onde o coração será posicionado após o acessório para o aparelho.</li>
		<li>Preparar a estimulação selecionando 2 eléctrodos do cateter e usar um comprimento de ciclo de 100 ms.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação do coração
<ol><li>Adicionar o frio (~ 2-4 ˚ c) buffer de perfusão (10-20 mL e 40-50 mL, para que todo o prato está coberto) para os 2 pratos de Petri (diâmetro de 6 cm e 10 cm) e o prato com a cânula e o local-los no gelo diretamente próxima e sob o microscópio. Prepare um nó duplo ao redor da cânula.</li>
	<li>Excisar rapidamente o coração após deslocamento cervical, abrindo o tórax usando uma tesoura de Mayo e fórceps estreito padrão. Então segure a aorta e a veia cava acima do diafragma usando a pinça de Londres e excisar o bloco de coração-pulmão cortando todos os vasos e tecido conjuntivo perto da espinha com a tesoura de estrabismo.</li>
	<li>Transferir o bloco de coração-pulmão para o primeiro prato (6 cm de diâmetro) preenchido com o buffer de gelada e remova cuidadosamente os pulmões sem danificar o coração usando estrabismo tesoura e pinça de Londres. Em seguida, coloque o coração sob o microscópio e remova cuidadosamente o timo, o esôfago e a traqueia por usando mola tesoura e pinça Dumont SS.</li>
	<li>Use a tesoura de mola para abrir um buraco de 1,5-2 mm na parte superior da aurícula direita para a inserção do cateter. Corte um buraco na artéria pulmonar. Então cortou a aorta diretamente sob os ramos de supraaortic e remover o tecido da aorta, para que o nó pode ser conectado facilmente.</li>
	<li>Mantenha as almofadas de gordura atrial, incluindo o major atrially localizado ganglionated plexi, ao redor do átrio esquerdo intacto ou removê-los completamente por dissecção cuidadosa.</li>
	<li>Transferir o coração para o prato com a cânula e colocá-la sob o microscópio. Encostar a aorta da cânula com a pinça de Dumont SS e preparado o nó firmemente em torno da aorta. Certifique-se de que a cânula não é colocada muito fundo na aorta, para que a válvula da aorta e os vasos coronarianos são deixados livre.</li>
	<li>Anexe a cânula rapidamente ao aparelho de Langendorff. Certifique-se de que não há nenhuma bolha na cânula.</li>
	<li>Alterne a pressão de perfusão para 80 mmHg, permitindo uma perfusão de pressão constante.</li>
	<li>Insira o cateter cuidadosamente o átrio direito e ventrículo direito sem tocar ou danificar o coração e fixe o cateter à cânula com fita.</li>
	<li>Começa a estimulação com a duração do ciclo preparado de 100 ms, por um período de equilíbrio inicial 20 min.</li>
	<li>Feche a câmara para permitir uma temperatura estável.</li>
</ol>4. eletrofisiológicos parâmetros e arritmogênica
<ol><li>Aplica uma estimulação programada através de eletrodos distais ou proximais do cateter em duas vezes o batimentos atrial ou ventricular limiar estimulação para avaliar os parâmetros eletrofisiológicos, conforme descrito nas etapas a seguir.<ol>
<li>Determinar o tempo de recuperação do nó sinusal como a duração do ciclo de retorno máximo após 10 s de estimulação em um comprimento de ciclo S1S1 de 120 ms 100 ms e 80 ms fixa.</li>
		<li>Determinar o ponto de Wenckebach como a duração do ciclo mais longa S1S1 (8 estímulos; S1S1: 100 ms; 2 redução gradual do ms) com uma perda de 11 da condução nodal AV. Determinar os períodos refratários nodais atrioventricular como a mais longa S1S2 (12 estímulos; S1S1: 120 ms, ms 110 e 100ms; um falta acoplado extrastimulus com 2 ms redução gradual S1S2) com uma perda de condução nodal AV.</li>
		<li>Determinar os períodos refratários atrial e ventriculares, como a mais longa S1S2 (12 estímulos; S1S1: 120 ms, ms 110 e 100ms; um falta acoplado extrastimulus com 2 ms redução gradual S1S2) com uma resposta de batimentos atrial ou ventricular ausente10,11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Executar um extrastimulation programado (S1S1: 120 ms 100 ms e 80 ms, seguidos por até 3 batidas extras; 60-20 ms com uma redução gradual de 2 ms) ou explosão protocolos de estimulação (5 s no S1S1: 50-10 ms com uma redução gradual de 10 ms) em conformidade com as convenções de Lambeth para eva luate arritmogênica ventricular10,11,12.</li>
</ol>5. Epicárdica condução medições
Nota: Registro unipolar Epicárdica electrogramas usando um sistema de gravação de 128 canais, assistida por computador com uma taxa de amostragem de 25 kHz para mapeamento de alta resolução. Usar uma matriz de eletrodo multi 32 (MEA; distância eletroda inter: 300 µm; 1,8 x 1,8 mm). Note que os dados foram filtrados de bandpass (50 Hz) e digitalizados com 12 bits e uma gama de sinal de 20 mV.
<ol><li>Coloque a MEA na área designada do coração e adicionar o aterramento para outra parte do coração13,14,15.</li>
	<li>Coloque um cateter de estimulação Epicárdica perto o MEA e iniciar uma estimulação constante.</li>
	<li>Inicie a gravação após a confirmação do bom contacto dos eléctrodos, verificando a qualidade do sinal e a amplitude.</li>
	<li>Use uma análise off-line para a determinação da velocidade de propagação da onda e dispersão na direção da condução.</li>
</ol>6. Förster ressonância FRET transferência de energia cíclico adenosina monofosfato (cAMP) geração de imagens baseada
Nota: Para medições baseadas no traste, colheita de corações de ratos transgénicos de CAG-Epac1-campos16.
<ol><li>Use um sistema de imageamento autoconstruído em torno de um estereomicroscópio15,17.</li>
	<li>Coloque as duas oculares na frente do coração e ajustá-lo para a acuidade.</li>
	<li>Excitar o sensor de campo com uma fonte de luz [por exemplo, use um único comprimento de onda luz emitida por diodo (440 nm)]. Dividi a emissão de luz em canais de doador e aceptor usando um divisor de feixe (para um par de proteína fluorescente de proteína/amarelo fluorescente ciano, uso um 565dcxr espelho dicroico e filtros de emissão D480/30 e D535/40).</li>
	<li>Assegurar uma temperatura estável colocando um envoltório de plástico em torno da câmara.</li>
	<li>Tirar fotos usando uma câmera científica metal-óxido-semicondutor complementar (sCMOS). Coordene a fonte de luz e a câmera captura de imagem com um software como Micro-Gerenciador de imagem de código aberto.</li>
	<li>Para iniciar a aquisição de imagem, empurre o Acq Multi-D. botão e configurar um lapso de tempo, que adquire uma imagem cada 10 s, com o tempo de exposição adequado, que depende da força do sinal fluorescente (cerca de 100 ms).</li>
	<li>Use o anteriormente descrito e disponível FRET on-line e FRET on-line 2 plugins17 para dividir a imagem em dois canais, selecione as regiões de interesse e monitorar o rastreamento de relação.</li>
	<li>Durante a aquisição, perfundir o coração com a solução de Krebs-Henseleit modificada contendo substâncias diferentes, dependendo da natureza do experimento.</li>
	<li>No final do experimento, desligue a aquisição pressionando o botão parar e salvar a pilha de imagens.</li>
	<li>Analise os dados FRET off-line usando um software de análise dedicado que pode dividir imagens em duas seções idênticas para os canais de doador e aceptor e pode executar análise FRET em várias regiões de interesse. Nota: Um dedicado plug-in (FRET off-line) é necessária, que é fornecido no et al . Sprenger 17.<ol>
<li>Inicie o software. Abra a análise, indo ao menu Plugins e, em seguida, clique em MicroManagere depois em Abrir arquivo de Microgerente.</li>
		<li>Execute o plugin FRET off-line para dividir o lapso de tempo em duas imagens idênticas para os canais de PCP e YFP.</li>
		<li>Use a ferramenta de Seleções à mão livre para marcar a região de interesse na imagem YFP. Pressione o botão Adicionar para adicionar a selecção à janela Multi medida .</li>
		<li>Escolha a região de interesse na Medida Multi janela e pressione Multi para obter uma tabela com valores médios de cinza para cada frame e região. Copie e cole todos os dados em uma folha de Excel.</li>
		<li>Clique na pilha de imagem do PCP. Executar as mesmas ações como na etapa 6.10.4 para a pilha de PCP e cole a mesma folha de Excel com os valores médios de cinza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corrigi os dados off-line para o fator de infiltração do doador para o aceitador canal17.<ol>
<li>Use a seguinte fórmula, onde B é o fator de infiltração: Ratio = (YFP - B x CFP) / PCP</li>
		<li>Determinar o fator de infiltração B por um coração expressando o PCP só de imagem e medir a porcentagem da fluorescência no canal YFP doador (B = YFP / PCP).</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Neuromorphology
Nota: Analise o sistema nervoso autônomo intracardíaco usando immunostainings de toda a montagem de corações murino intactas. Note que a maioria dos gânglios intracardíacos é localizada no tecido adiposo epicárdico perto das veias pulmonares.
<ol><li>Usar diferentes colorações para a representação de Neurofilamento (estruturas neuronais gerais; frango anti-NF-H, 1:3, 000), Tirosina Hidroxilase (TH, simpáticas estruturas neuronais; coelho α TH, 1:1, 000) e colina acetiltransferase (ChAT, parassimpático estruturas neuronais; cabra α ChAT, 01:50).</li>
	<li>Após a perfusão no aparato de Langendorff, consertar os corações de rato em 10 mL de formalina para 24h e armazená-los em tampão fosfato salino (PBS) no 4 ˚ c.</li>
	<li>Branquear os corações em lixívia de Dent (4:1:1 metanol: água oxigenada solução 30% (w/w) em H2O: dimetilsulfóxido (DMSO)) durante 1 semana a 4 ˚ c e re-hidratá-los posteriormente a PBS em uma série de decrescente metanol em PBS (100%, 75%, 50%, 25%; 1 h cada) 18.</li>
	<li>Realizar a incubação do seguinte formato com uma agitação suave no 4 ˚ c-24-placa:<ol>
<li>Permeabilize os corações em 1% Triton-X-100/PBS (PBS-T) por 3 x 1 h à temperatura ambiente antes de bloqueá-los durante a noite em um tampão de bloqueio [5% albumina de soro bovino (BSA) / PBS-T + 0,2% de azida de sódio].</li>
		<li>Diluir os anticorpos como segue: cabra α ChAT (01:50), coelho α TH (1:1, 000), Neurofilamento α de frango (1:3, 000); anticorpos secundarios para rotulagem fluorescente (1: 500; ou de acordo com as instruções do fabricante); biotinilado anticorpos secundários para rotulagem cromogênico (1: 200; ou de acordo com as instruções do fabricante).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube as amostras em anticorpos primários diluídos em um tampão de bloqueio durante uma semana a 4 ˚ c.</li>
	<li>Lave os corações para 3 x 15 min em PBS-T antes da incubação do anticorpo secundário em um tampão de bloqueio por 4 dias.</li>
	<li>Lave os corações para 3 x 15 min em PBS-T e armazená-los em um meio de montagem para a coloração fluorescente para 3h em temperatura ambiente ou usar um kit de deteção complexo avidina-biotina de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Pre-incube os corações por 1h em um buffer de comercial para 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), antes de desenvolvê-los sob um controle visual em um buffer contendo DAB de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Armazene as amostras em água bidestilada.</li>
	<li>Para cortes de parafina, desidratar e incorporar os corações em parafina.<ol>
<li>4-µm espessura seções de corte e deparaffinize-los de acordo com os procedimentos de rotina do laboratório. Se e como a recuperação do antígeno precisa ser executada precisa ser estabelecido para cada instalação individual uma vez que depende da combinação de anticorpos.</li>
		<li>Permeabilize as seções por 10 min em 0,2% Triton X-100/Tris-salino (TBS), seguido de lavagens de 3 x 5 min na TBS.</li>
		<li>Bloqueá-los com 3% BSA/TBS por 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incube-os durante a noite a 4 ˚ c [anticorpos primários: cabra α ChAT (01:50), coelho α TH (1: 500), frango Neurofilamento α (1:1, 000)] ou 2 h à temperatura ambiente (marcado com fluorescência anticorpos secundários, 1: 500) em 1% BSA/TBS com 3 x 5 min lava TBS in-between.</li>
		<li>Adicionar 1 µ g/mL de trihydrochloride de H33342 de bisbenzimide para a solução de anticorpo secundário ou usar um método diferente de coloração nuclear.</li>
		<li>Monte as lâminas em um meio de montagem para a coloração fluorescente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste manuscrito, o conhecido Langendorff ex vivo coração perfusão sistema é apresentado como uma ferramenta para estudar o impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica usando mapeamento diferente e técnicas de estimulação incluindo as abordagens endocárdico e Epicárdica.
Várias partes do protocolo são cruciais para a instalação. Em primeiro lugar, é importante o uso de uma técnica de preparação em que as almofadas de gordura atrial permanecer intacto...

O sistema de perfusão do Langendorff ex vivo coração continua a ser uma ferramenta relevante para a realização de um amplo espectro de fisiológicas, bioquímicas, morfológicas e estudos farmacológicos em centralmente desnervados corações1,2 ,3,4,5 , desde a sua invenção no final 19th do século6. Até à data, este sistema é ainda amplamente utilizado para vários tópicos (EG., reperfusão de isquemia) ou estudar cardíaco farmacológico efeitos7,8e é uma ferramenta básica em pesquisa cardiovascular. A longevidade deste método resulta de várias vantagens (ex., as medições são realizadas sem a influência do sistema nervoso central ou outros órgãos, circulação sistêmica ou hormônios circulantes). Se necessário, produtos farmacêuticos podem ser adicionados de forma controlada para o buffer de perfusão ou aplicados diretamente às estruturas específicas. Experimentos são reprodutíveis, e um número relativamente elevado de experiências pode ser executado em um curto período de tempo. A natureza aberta (em parte) da instalação do pode tornar difícil de regulação da temperatura e precisa ser levado em conta. Embora o sistema de Langendorff também é usado em maior espécie9, animais menores são usados principalmente como a instalação experimental é menos complexo e uma maior variabilidade biológica (EG., transgénicos mouse modelos) podem ser usados.
No menu configuração experimental do presente protocolo, a influência do sistema nervoso autonomic intracardíaca de parâmetros eletrofisiológicos básicos, arritmogênica ventricular, condução Epicárdica e dinâmica de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) é avaliada. Um grande número de gânglios intracardíacos, que localizam-se principalmente nas almofadas de gordura atrial e agora são conhecidos para controlar Eletrofisiologia Cardíaca independente de controle neural central, é que também deixou intacta ou removido manualmente com cuidado mecânica dissecação. Uma modulação farmacológica do sistema nervoso autonomic é realizada globalmente pela adição de produtos farmacêuticos para o buffer de perfusão ou localmente pela modulação alvo de gânglios atrial. Após os experimentos, os corações são adequados para uma avaliação reagidos como todas as células do sangue foram removidas devido a perfusão contínua, que pode aumentar a qualidade da coloração.
O objetivo geral das técnicas descritas é oferecer novas perspectivas para estudos detalhados sobre o impacto a nível do sistema nervoso autônomo na eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica no coração do mouse. Uma razão para usar essa técnica é que é possível estudar e alterar o sistema nervoso autônomo sem o impacto do sistema nervoso central. Uma grande vantagem é o fácil emprego de experimentos farmacológicos, em quais pro - ou antiarrítmicas Propriedades potenciais de velhos e novos agentes podem ser testados. Além disso, modelos de rato transgénico e nocaute de várias doenças cardíacas estão disponíveis para investigar os mecanismos subjacentes a arritmias, insuficiência cardíaca ou doenças metabólicas. Esta abordagem tem reforçado a nossa compreensão de como o sistema nervoso autônomo no nível atrial podem afetar Eletrofisiologia Cardíaca ventricular e a indução de arritmias.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>Solução de Krebs-Henleit modificada</td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401676</td><td>Solução de Krebs-Henleit modificada</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>Solução de Krebs-Henleit modificada</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>Krebs-Henleit modificado solução</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>Solução de Krebs-Henleit modificada</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>Solução de Krebs-Henleit modificada</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Solução de Krebs-Henleit modificada</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio bioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8574</td><td>Krebs-Henleit modificado solução</td></tr><tr><td>Carbogen (95% O2 / 5% CO2)</td><td>SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Alemanha</td><td>Solução de Krebs-Henleit modificada</td> Filtro estéril steritop-GP 0,22 EMD Millipore SCGPT05RE Solução de Krebs-Henleit modificada Sulfato de atropina Sigma-Aldrich A0257 Neuromodulação <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de hexametônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2138</td><td>Neuromodulação</td></tr><tr><td>Base livre de nicotina 98-100%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>Neuromodulação</td></tr><tr><td>Solução de formalina tamponada neutra 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio 30% (p / p) em H2O</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Alemanha</td><td>H1009</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Merck</td><td>, KGA, Darmstadt, Alemanha</td><td>D8418</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Comprimidos salinos tamponados com fosfato</td><td>Gibco / Invitrogen</td><td>18912-014</td><td>Coloração</td></tr> <tr><td>de montagem inteiraTriton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Albumina bovina fração V</td><td>Biomol, Hamburgo, Alemanha</td><td>11924.03</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Frango anti-neurofilamento</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Coelho anti-tirosina hidroxilase</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Cabra anticolina acetiltransferase</td><td>EMD Millipore</td><td>AP144P</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Burro &alfa; coelho IgG Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Burro &alfa; cabra IgG Alexa 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11057</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Burro &alfa; frango IgY Alexa 647</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Alemanha</td><td>AP194SA6</td><td>Inteiro coloração de montagem</td></tr><tr><td>Burro conjugado com biotina &alfa; coelho igG</td><td>R & D Systems</td><td>AP182B</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Burro conjugado com biotina &alfa; cabra igG</td><td>R& D Systems</td><td>AP192P</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Cabra conjugada com biotina &alpha; frango igY</td><td>R& D Systems</td><td>BAD010</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Meio de montagem Vectashield</td><td>Vector laboratories, Burlingame, CA, EUA</td><td>H-1000</td><td>Imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Vectastain ABC kit</td><td>Vector laboratories, Burlingame, CA, EUA</td><td>PK-4000</td><td>Imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Steady DAB / Plus</td><td>Abcam plc, Cambridge, Reino Unido</td><td>ab103723</td><td>Coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>HistoClear</td><td>DiaTec, Bamberg, Alemanha</td><td>HS2002</td><td>Imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>BisBenzimida H33342 tricloridrato (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA</td><td>B2261</td><td>Imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Vectashield HardSet meio de montagem</td><td>Vector laboratories, Burlingame, CA, EUA</td><td>VEC-H-1400</td><td>Imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Sistema de perfusão</td><td>HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Alemanha</td><td>&nbsp; 73-4343</td><td>Aparelho Langendorff</td></tr><tr><td>Sistema de aquisição de dados e software correspondente para cateter e parâmetros fisiológicos</td><td>Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, Nova Zelândia</td><td>PL3508 PowerLab 8/35</td><td>Configuração de Langendorff</td></tr><tr><td>Cateter octopolar</td><td>CIB' ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, EUA</td> configuração <td>personalizada</td><td>Langendorff</td></tr><tr><td>Gerador de estímulo</td><td>STG4002, Sistemas Multicanal, Reutlingen, Alemanha</td><td>STG4002-160&micro; A</td><td>Configuração de estimulação</td></tr><tr><td>Software de estimulação</td><td>Sistemas multicanais, Reutlingen, Alemanha</td><td>MC_Stimulus II</td><td>Configuração de estimulação</td></tr><tr><td>Sistema de aquisição de dados e software correspondente para eletrogramas epicárdicos</td><td>ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Alemanha</td><td>USB-ME128-System</td><td>MEA setup</td></tr><tr><td>Multi-electrode array</td><td>MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Alemanha</td><td>EcoFlexMEA36 MEA</td><td>configuração</td></tr><tr><td>Multi-electrode array software de gravação</td> Multi <td>Channel Systems, Reutlingen, Alemanha</td><td>MC_Rack</td><td>MEA configuração</td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>15003-08</td><td>Preparação do Coração</td></tr><tr><td>Estrabismo Tesoura Fine</td><td>Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>14575-09</td><td>Preparação do Coração</td></tr><tr><td>Mayo Tesoura</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>14110-15</td><td>Preparação do Coração</td></tr><tr><td>Dumont SS Fórceps</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>11203-25</td><td>Preparação do Coração</td></tr><tr><td>London Fórceps</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>11080-02</td> Preparação <td>do Coração</td></tr><tr><td>Fórceps de Padrão Estreito</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>11003-13</td><td>Preparação do coração</td></tr><tr><td>Plastic Wrap</td><td>Parafilm M, Bemis NA, com sede em Neenah, WI, Estados Unidos</td><td></td><td>Estereomicroscópio de materiais consumíveis</td></tr><tr><td></td><td>Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemanha</td><td></td><td>FRET</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED, Andover, UK</td><<td>em>pE-100</td><td>FRET</td></tr><tr><td>DualView</td><td>Photometrics, Tucson, AZ, USA</td><td>DV2-SYS</td><td>FRET</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros DualView</td><td>Photometrics, Tucson, AZ, USA</td><td>05-EM</td><td>FRET</td></tr><tr><td>optiMOS scientific CMOS camera</td><td>Qimaging, Surrey, BC, Canadá</td><td>01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td>Software de imagem FRET</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Micro-Gerente; Vale Lab, Universidade da Califórnia em São Francisco, CA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de Análise</td><td>FRET Software Image J; Domínio público, NIH, EUA</td><td></td><td>FRET</td></tr></tbody></table>

impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica em um sistema de langendorff ex vivo

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Desde a sua invenção noséculo 19 tarde , o sistema de perfusão do Langendorff ex vivo coração continua a ser uma ferramenta relevante para o estudo de um amplo espectro de parâmetros fisiológicos, bioquímicos, morfológicos e farmacológicos em corações centralmente desnervadas. Aqui, descrevemos uma configuração para a modulação do sistema nervoso autonomic intracardíaca e a avaliação da sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênica e dinâmica de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP). O sistema nervoso autônomo intracardíaco é modulado pela dissecção mecânica da gordura atrial almofadas-no quais murino gânglios estão localizados principalmente — ou pelo uso de intervenções farmacológicas globais, bem como alvo. Um cateter eletrofisiológicos octapolar é introduzido no átrio direito e o ventrículo direito, e multi eletrodos epicárdico colocado matrizes (MEA) para mapeamento de alta resolução são usados para determinar arritmogênica e Eletrofisiologia cardíaca. Transferência de energia de ressonância Förster (FRET) imagem é realizada para o monitoramento em tempo real dos níveis de campo em diferentes regiões cardíacas. Neuromorphology é estudado por meio de anticorpos-baseado coloração de todo o coração usando marcadores neuronais para orientar a identificação e a modulação de metas específicas do sistema nervoso autonomic intracardíaco nos estudos realizados. A configuração de Langendorff ex vivo permite um elevado número de experimentos reprodutíveis em um curto espaço de tempo. No entanto, a natureza parcialmente aberta da instalação (ex., durante as medições de MEA) dificulta o controle de temperatura constante e deve ser mantida a um mínimo. Esse método descrito torna possível analisar e modulam o sistema nervoso autônomo intracardíaco em corações descentralizadas.

A Figura 1 mostra uma imagem da instalação do Langendorff incluindo 2 eletrodos multi matrizes (MEAs). Antes do experimento, o cateter intracardíaco é posicionado perto da cânula para facilitar uma rápida e fácil inserção no ventrículo direito átrio/direita e certifique-se de um curto período de tempo até que o equilíbrio pode começar. A parte inferior da câmara pode ser aumentada (veja as setas na Figura 1) para que a câmara est...

Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação do sistema nervoso autonomic intracardíaca e a avaliação da sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênica e acampamento dinâmica usando uma configuração de Langendorff ex vivo .

Impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica em um sistema de Langendorff Ex Vivo

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

O objetivo geral desta configuração ex vivo de Langendorff é analisar e modular o sistema nervoso autônomo intracardíaco e avaliar sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênese e dinâmica do cAMP em corações descentralizados. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite aos pesquisadores analisar e modular o sistema nervoso intracardíaco em corações descentralizados. Embora esse método possa fornecer informações sobre corações saudáveis, obtivemos evidências iniciais de que essa abordagem também pode ser usada para estudar várias formas de doença cardíaca estrutural.Comece iniciando o banho-maria e colocando a solução de perfusão incluindo uma mistura de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, ajuste a taxa de bombeamento antes de conectar o coração, para que não fiquem bolhas de ar na cânula ao montá-la no aparelho. Defina a pressão de perfusão alvo para 80 milímetros de mercúrio nas configurações gerais e comece a gravar.Use um cateter de eletrofisiologia com eletrodos de platina, uma superfície de eletrodo de 0,5 por 0,5 milímetros, com um espaçamento de eletrodos de 0,5 milímetros para o registro de dados e estimulação com um gerador de estímu

impact-intracardiac-neurons-on-cardiac-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Jungen, C., et al. Impacto dos neurônios intracardíacos na eletrofisiologia cardíaca e arritmogênese em um sistema Ex vivo Langendorff. J. Vis. Exp. (2018). O vídeo demonstra uma técnica ex vivo para estimular o sistema nervoso intracardíaco para avaliar a suscetibilidade do coração à arritmia. Usando um aparelho de perfusão, um coração de camundongo isolado é perfundido com um tampão oxigenado. O sistema nervoso intracardíaco é então estimulado em alta frequência para induzir arritmias.

Estimulação do Sistema Nervoso Intracardíaco para Avaliar a Suscetibilidade à Arritmia

Aqui, descrevemos a preparação de fatias ventriculares viáveis ​​de camundongos adultos e seu uso para gravações de potencial de ação de eletrodos afiados. Essas preparações multicelulares proporcionam uma estrutura de tecido in vivo preservada, o que os torna um modelo valioso para estudos eletrofisiológicos e farmacológicos in vitro .

Faixas de coração ventricular de eixo curto murino para estudos eletrofisiológicos

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método de investigação da dinâmica cardíaca por meio de um modelo animal translacional. A abordagem experimental descrita incorpora optocardiografia de dupla emissão em conjunto com um estudo eletrofisiológico para avaliar a atividade elétrica em um modelo cardíaco suíno isolado e intacto.

Estudos de Optocardiografia e Eletrofisiologia de Ex Vivo Langendorff-perfundido Corações

Este protocolo descreve o procedimento de secção e cultivo de fatias cardíacas humanas para testes de drogas pré-clínicos e detalha o uso de mapeamento óptico para o registro de tensão transmembrana e sinais de cálcio intracelular simultaneamente a partir dessas fatias.

Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas

Este protocolo visa descrever uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco usando o registro de matriz de microeletrínda de todo o tecido do nódulo sinoatrial para identificar defeitos de marcação de ritmo em camundongos. Agentes farmacológicos também podem ser introduzidos neste método para estudar seus efeitos no ritmo intrínseco.

Microelectrode Array Gravação da Taxa de Disparo de Nó Sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcação cardíaca em camundongos

O presente protocolo descreve métodos de expressão transgênica em corações de ratos e camundongos por injeção intramiocárdica direta do vírus sob orientação ecocardiográfica. Métodos para a avaliação da suscetibilidade de corações a arritmias ventriculares pela estimulação elétrica programada de corações isolados, perfundidos por Langendorff, também são explicados aqui.

Expressão Transgênica Viral em Corações de Roedores e Avaliação do Risco de Arritmia Cardíaca

A combinação de poração a laser e matrizes de microeletrodos (MEA) permite registros semelhantes ao potencial de ação de cardiomiócitos primários cultivados e derivados de células-tronco. A forma de onda fornece uma visão superior do modo de ação dos compostos de teste do que as gravações padrão. Ele vincula patch-clamp e leitura de MEA para otimizar ainda mais a pesquisa de segurança cardiovascular no futuro.

Medições do Potencial de Ação Induzidas por Laser de Cardiomiócitos em Matrizes de Microeletrodos para Maior Previsibilidade da Farmacologia de Segurança

Este protocolo ilustra um método para estimulação optogenética de neurônios cardíacos intrínsecos em corações de camundongos transgênicos. A abordagem descrita é usada para investigar a cinética da ativação súbita de neurônios cardíacos em corações perfundidos ex vivo e as interações entre a atividade colinérgica e catecolaminérgica.

Ativação optogenética de neurônios autônomos cardíacos intrínsecos em corações de camundongos perfundidos excisados

Descrevemos um protocolo para registro extracelular multicanal espinhal juntamente com o registro da função cardíaca e análise dos neurônios do corno dorsal espinhal bloqueados cardíacos. Este método oferece uma estrutura temporalmente sincronizada para estudar os mecanismos da coluna vertebral subjacentes às alterações funcionais viscerais torácicas induzidas pela acupuntura.

Estudando os perfis de codificação da estimulação somática nas respostas neuronais cardíacas bloqueadas no corno dorsal espinhal de ratos

Este protocolo descreve a fabricação avançada de materiais e métodos ex vivo de coração de rato para biointerface bidirecional óptica e elétrica, permitindo estimulação cardíaca precisa, gravação e modelagem de infarto para pesquisa em bioeletrônica.

Interfaces elétricas e optoeletrônicas bidirecionais em corações de ratos ex vivo saudáveis e isquêmicos

Aprenda a analisar e modular o sistema nervoso autônomo intracardíaco usando preparação Langendorff ex vivo. Este método permite estudar eletrofisiologia, arritmogênese e dinâmica de cAMP em corações isolados.

Impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica em um sistema de Langendorff Ex Vivo

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