Um protocolo para adquirir o Tenocyte degenerativa dos humanos

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a biologia degenerativa de tenócitos humanos, pois apenas alguns estudos descreveram o isolamento e a cultura de tenócitos degenerativos humanos em detalhes. A principal vantagem desta técnica é que podemos obter tenócitos degenerativos humanos sem lesões adicionais ao paciente, porque o tecido degenerativo é adquirido durante a cirurgia padrão de epicondilite. Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Soo-Hong Han, Minjung Baek e Hyung Kyung Kim do meu Nível Três.

Para adquirir uma amostra de tecido tendócito degenerativo, use um bisturi cirúrgico número 15 para fazer uma incisão cutânea de três a cinco centímetros logo anterior medial ao epicôndilo lateral e proximal ao nível da articulação para expor o cotovelo lateral e localizar visualmente o extensor radial longo do carpo na interface da aponeurose extensora. Use o bisturi para fazer uma incisão de divisão de dois a três milímetros de profundidade entre o extensor radial longo do carpo e a aponeurose extensora na interface. Após a retração anterior do extensor radial longo do carpo, localize o tecido degenerativo patológico por sua cor acinzentada opaca característica e tecido tipicamente edemaciado e friável, e use o bisturi e as minilâminas para ressecar cuidadosamente, mas com nitidez, todo o tecido degenerativo.

Quando todo o tecido tiver sido colhido, feche a ferida com material de sutura não absorvível de acordo com os protocolos padrão e remova cuidadosamente todo o tecido circundante de um pedaço de amostra de tecido de aproximadamente um centímetro cúbico, colocando o tecido do tendão limpo em 10 mililitros de PBS assim que for aparado. Em seguida, fixe cerca de metade do tecido colhido em formalina a 10% tamponada neutra em uma capela de exaustão química por 12 horas. Para configurar uma cultura de tenócitos, transfira a outra metade das amostras de tecido de controle e degenerado colhidas para placas individuais de cultura de tecidos contendo PBS fresco e pique os tecidos em um metro cúbico ou pedaços menores, digerir os fragmentos de tecido em 30 mililitros de DMEM suplementado com 30 miligramas por mililitro de colagenase dois por grupo de tecido a 37 graus Celsius por uma hora.

No final da digestão, filtre as soluções celulares através de filtros celulares individuais de 100 mícrons e desative a colagenase com um mililitro de FBS por tubo. Colete os tenócitos por centrifugação e ressuspenda os pellets em três vezes 10 a quinta células por 10 mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de antibiótico, concentração de solução antimicótica. Em seguida, semeie as células em uma placa de cultura de 100 centímetros por condição e cultive os tenócitos em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma semana, trocando o meio de cultura a cada três dias até que uma confluência de 80% seja alcançada.

Para análise imunocitoquímica, transfira duas vezes 10 para as quintas células em 200 microlitros de meio fresco para cada poço de uma lâmina de câmara de oito poços por grupo experimental e cultive as células até a confluência por 24 horas. No dia seguinte, lavar as células com PBS, seguido de fixação com 500 microlitros de formaldeído a 4% por poço e permeabilização com 0,5% triton X 100 em PBS por 10 minutos. Para bloquear qualquer ligação não específica, incube as células com albumina sérica bovina a 1% e Tween 20 a 0,05% em PBS, conforme experimentalmente apropriado, seguido de incubação com os anticorpos primários de interesse marcados com fluorescência a quatro graus Celsius durante a noite protegidos da luz.

Na manhã seguinte, rotule as células com os anticorpos secundários apropriados por uma hora em temperatura ambiente protegida da luz e monte as amostras com 0,5 microlitros de um meio de montagem de fluorescência apropriado por câmara. Em seguida, faça a imagem das amostras em um microscópio de fluorescência sob uma objetiva de 400 vezes. Para análise patológica do tecido, incorpore o controle formal e fixo e amostras de tecido tendinoso degenerado em quatro a cinco mililitros de parafina e adquira seções de quatro a cinco mícrons de cada bloco de parafina.

Para hematoxilina em eosina, ou coloração H & E, desparafinize as amostras com três imersões de cinco minutos em xileno, seguidas de hidratação com imersões graduadas de etanol e uma lavagem com água da torneira de dois minutos. Em seguida, rotule as amostras com hematoxilina por cinco minutos, seguida por outra lavagem com água de dois minutos. Mergulhe as amostras enxaguadas em ácido clorídrico a 1% e etanol a 70% por três segundos, seguido de uma lavagem com água de três minutos.

Neutralize o ácido com um mergulho de 10 segundos em 0,5% de amônia, seguido por outra lavagem com água de três minutos. Rotule as amostras neutralizadas com a eosina por cinco minutos e desidrate as amostras coradas com H & E com imersões graduadas em etanol. Após três imersões em xileno, montar as amostras com um meio de montagem adequado e uma lâmina de cobertura.

Para realizar a análise imuno-histoquímica das amostras de tecido, use o kit de detecção refinada de polímero de ligação de acordo com as instruções do fabricante com as seguintes pequenas modificações. Após a desparafinização com xileno, conforme demonstrado, mergulhe as amostras em solução de recuperação de epítopos de ligação por 30 minutos a 100 graus Celsius para recuperação de antígeno, seguida de uma incubação de cinco minutos em peróxido de hidrogênio para extinguir qualquer peroxidase endógena. Em seguida, rotule as seções por quinze minutos em temperatura ambiente com os anticorpos primários de interesse.

No final da incubação, rotular as amostras com o sistema de conjugado secundário de anticorpos ligante polimérico de rábano peroxidase sem biotina adequado durante 50 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, monte as seções com uma lamínula no meio de montagem apropriado e faça a imagem das amostras em um microscópio óptico com uma ampliação de 400 vezes. As análises de H&E revelam que o tecido colhido da epicondilite lateral degenerada demonstra feixes de colágeno desorganizados com perda de polaridade e estruturas de fibras paralelas finas, retas e fortemente compactadas.

De fato, os feixes de colágeno são positivos para a coloração de Alcian Blue nas seções de tecido degenerado, indicando um aumento da presença de proteoglicanos e glicosaminoglicanos no tecido danificado. A análise imuno-histoquímica dos tendões degenerados também indica uma reação positiva granular citoplasmática ao fator de crescimento endotelial vascular que não é observada em amostras de tecido tendinoso saudável de controle. Ambos os tipos de células de amostra de tecido cultivadas podem ser confirmados como tenócitos por imunofluoraquímica, com a maioria das células cultivadas expressando marcadores representativos de tenócitos, como as proteínas moicano e tenomodulina, e demonstrando uma aparência alongada.

É importante notar que os tenócitos degenerativos também demonstram uma taxa mais alta de proliferação em cultura em comparação com os tenócitos colhidos de controles saudáveis, bem como uma maior expressão de vários genes conhecidos por estarem relacionados ao desenvolvimento de tendinopatia. Em conclusão, este protocolo validado usando tenócitos degenerativos abre caminho para futuras investigações em biologia tendínea e para testar novas intervenções.