Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase
11 de novembro de 2018
Aqui descrevemos um protocolo para investigar a Prenilação e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carregamento de GTPase. Esse protocolo consiste em dois métodos detalhados, nomeadamente o fracionamento de membrana e uma GTPase-lig da imunoabsorção do ensaio. O protocolo pode ser utilizado para medir a Prenilação e GTP carregamento de diferentes outras GTPases pequenas.
O pequeno Rho GTPase é uma proteína de uma superfamília com diversas funções celulares. Por exemplo, essas proteínas estão envolvidas na regulação do destino celular, resposta celular a um estresse, motilidade celular e ciclo celular. A atividade de uma pequena proteína Rho GTPase é regulada por modificação pós-translacional.
Essas modificações estão envolvidas na regulação rigorosa de sua atividade. Como exemplo, a prenilização da proteína e o vínculo GTP são a modificação pós-tradução mais importante dessas proteínas. Meu laboratório recentemente modificou e desenvolveu método simples para investigar a modificação pós-translacional dessas proteínas superfamílias.
Para isso, utilizamos 251 linhas celulares de glioblastoma, e as direcionamos com simvastatina, e medimos modificação pós-translacional dessas proteínas. O método envolve fracionamento subcelular e proteína ligada ao GTP a essa superfamília proteica. Para isso, utilizamos a localização de RhoA, e GTP vinculado à RhoA para medir a modificação pós-translacional desta proteína.
Remova as células da incubadora de 37 graus. Olhe para as células sob o microscópio para confirmar a confluência. As células devem estar entre 70% e 80% confluentes.
Lave as células uma vez com PBS frio. Adicione cinco mililitros de EDTA, e coloque as células de volta na incubadora de 37 graus por cinco minutos. Após cinco minutos de incubação, colete EDTA com células em um tubo de 15 mil.
Coloque o tubo em uma caixa de gelo, e vá para a centrífuga. Configure a centrífuga para 1500g a quatro graus, e gire as células por cinco minutos. Após o giro, remova o supernato e adicione um mililitro de PBS frio.
Triturar bem as células. Transfira a mistura celular para um novo tubo de 1,5 mililitro rotulado. Após a transferência, prossiga para a centrífuga.
Coloque a centrífuga em 1500g a quatro graus, e gire as células por cinco minutos. Verifique o tamanho da pelota. Coloque as amostras no gelo.
Descarte o superata completamente, sem perturbar a pelota. Adicione buffer one. Misture bem por pipetting para cima e para baixo.
Prossiga para a sônica. Defina o sonicator para cinco ciclos, cinco segundos cada, e repita três vezes. A sônicação deve continuar no gelo, mas não é mostrada no vídeo, para fins ilustrativos.
Vá para o ultracentrifuge. Use uma ultracentrifugação para separar as células homogeneiza em frações citoplasmáticas e membranas. Coloque a centrífuga em 100.000g por 35 minutos, a quatro graus.
Verifique o tamanho da pelota. Separe o supernato. Colete o supernato completamente, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
O supernato é a fração citosófica. Coloque o supernato em um tubo recém-rotulado. Adicione buffer dois à pelota.
Esta é a fração da membrana. Misture bem por pipetting para cima e para baixo. Proceda à determinação da proteína e à preparação da amostra de manchas ocidentais.
Carregue as amostras em um SDS-PAGE usando um gel de 15%. Confirme a transferência de proteínas visualizando o marcador de peso molecular, ou usando uma mancha de Ponceau. Adicione anticorpos primários para análise de imunoblotting.
Usamos Rac1/2/3, Cdc42 e RhoA. Tire as placas de cultura da incubadora. Olhe para as células sob o microscópio para confirmar a confluência.
As células devem ser 70 a 80% confluentes. Coloque a placa de cultura no gelo. Aspire a mídia e lave as células com pbs frio gelado pH'd a 7.2.
Aspire a PBS. Incline as placas no gelo por mais um minuto para remover todos os restos de PBS. O PBS residual afeta negativamente este ensaio.
Lise as células em um volume apropriado de tampão de lise gelada contendo inibidores de protease e fosfatase. Colher liseto celular com o raspador de células. Incline a placa de cultura para esta técnica.
Transfira o lysate para um tubo criogênico rotulado e gelado, e mantenha no gelo. Misture bem usando um vórtice. Mantenha 10 microliters do lysate para um ensaio proteico.
Es clique para congelar o restante do lise celular em nitrogênio líquido. Transfira os criobotos congelados instantâneos para um congelador menos 80. Guarde essas amostras.
Note que as amostras não devem ser armazenadas por mais de 14 dias. Prepare as células das outras placas de cultura repetindo passos de um a oito, um por um. Trabalhe rápido e nunca deixe as amostras no gelo por mais de 10 minutos.
Nunca manuseie todas as placas de cultura simultaneamente. Meça a concentração de proteínas. Calcule o volume do tampão de lise para normalizar a concentração de proteína entre as amostras.
Nota: um miligrama por mililitro é geralmente o melhor, no entanto, 0,3 a dois miligramas por mililitro pode ser detectável. Prepare um controle em branco adicionando 60 microliters de tampão de lise e 60 microliters de buffer de ligação a um microtubo. Prepare um controle positivo adicionando 12 microliters de proteína de controle Rho, 48 microliters de tampão de lise e 60 microliters de tampão de ligação.
Tire a placa de afinidade rho de seu saco e coloque no gelo. Dissolva o pó nos poços com 100 microliters de água gelada destilada. Mantenha a placa no gelo.
Descongele as células congeladas em um banho de água a 25 graus Celsius. Adicione o volume calculado de tampão de lise gelada a cada amostra para normalizar a concentração proteica. Transfira 60 microliters de amostras de gelo normalizadas para microtubos, e adicione 60 microliters de buffer de ligação.
Misture bem e mantenha no gelo. Remova completamente a água da microplaca por um movimento vigoroso, seguido de cinco a sete torneiras duras em um tapete de laboratório. Adicione 50 microliters das amostras normalizadas, um controle em branco e um controle positivo aos poços em duplicata.
Coloque a placa em um agitador orbital por 30 minutos a quatro graus Celsius. Nota:a velocidade do agitador deve ser definida a 300 rpm. Limpe as amostras da placa piscando e lave duas vezes com 200 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente.
Remova vigorosamente o tampão de lavagem dos poços após cada lavagem, seguindo-se por toques, e mantenha a placa no banco em temperatura ambiente. Adicione 200 microliters de tampão de temperatura ambiente em cada poço e incubar à temperatura ambiente por dois minutos. Retire a solução dos poços e lave três vezes com 200 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente.
Adicione 50 microliters de um recém-preparado para 250 anticorpos primários anti-RhoA a cada poço. Coloque a placa em um agitador orbital por 45 minutos a 300 rpm, fixada em 25 graus Celsius. Retire a solução dos poços e lave três vezes com 200 microliters de tampão de lavagem à temperatura ambiente.
Adicione 50 microliters de um recém-preparado para 250 anticorpos secundários anti-RhoA a cada poço. Coloque a placa em cima de um agitador orbital por 45 minutos, a 300 rpm, fixada em 25 graus Celsius. Prepare o reagente de detecção hrp misturando volumes iguais de Reagente A e Reagente B.Flick a solução de cada poço, e lave três vezes com 200 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente.
Adicione 50 microliters de reagente de detecção HRP recém-preparado a cada poço. Leia o sinal de luminescência dentro de três a cinco minutos para obter um sinal máximo. Analise os resultados usando um pacote de software apropriado.
Nossos resultados mostram que a simvastatina diminuiu a localização de RhoA na fração da membrana. O que aumentou foi o acúmulo na fração citosófica. Curiosamente, a simvastatina aumentou o GTP ligado ao RhoA.Por quê?
Esperamos que a simvastatina diminua essa atividade. É muito importante que eles meçam tanto a localização subcelular desta proteína, quanto medem a ligação GTP a esta proteína para ter uma avaliação final da atividade dos pequenos Rho GTPases.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para investigar a prenilação e o carregamento de GTP de proteínas GTPases Rho. Os métodos descritos incluem fracionamento de membranas e um ensaio imunoenzimático ligado a GTPase, que pode ser aplicado a várias GTPases pequenas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Bioquímica
Antecedentes
- As pequenas GTPases Rho fazem parte de uma superfamília com diversas funções celulares.
- Elas regulam o destino celular, respostas ao estresse, motilidade e o ciclo celular.
- Modificações pós-traducionais, como a prenilação e a ligação de GTP, regulam rigorosamente sua atividade.
- Compreender essas modificações é essencial para elucidar seus papéis nos processos celulares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método simples para investigar modificações pós-traducionais de GTPases Rho pequenas.
- Medir a prenilação e o carregamento de GTP nessas proteínas.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos regulatórios que governam a atividade das GTPases Rho.
Métodos Utilizados
- Fracionamento de membranas para isolamento de GTPases.
- Ensaio imunossorvente ligado a GTPase para quantificação da ligação de GTP.
- Aplicação do protocolo a várias GTPases pequenas.
- Análise de modificações pós-traducionais.
Resultados Principais
- Isolamento e análise bem-sucedidos de Rho GTPases.
- Demonstrou a eficácia dos métodos desenvolvidos.
- Forneceram informações sobre os processos de prenilação e carregamento de GTP.
- Facilitou pesquisas adicionais sobre GTPases pequenas nas funções celulares.
Conclusões
- O protocolo oferece uma abordagem confiável para estudar modificações nas Rho GTPases.
- Pode ser adaptado para outras pequenas GTPases, ampliando sua aplicabilidade.
- Compreender essas modificações pode levar a insights sobre seus papéis regulatórios nas células.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção precisa da pré-nililação das Rho GTPases e da ligação ao GTP é essencial para reduzir riscos em programas precoces de descoberta que visam a sinalização celular e a regulação do citoesqueleto. Este protocolo permite a avaliação quantitativa de modificações pós-traducionais que impactam diretamente a validação de alvos e a confiança mecanicista em modelos relevantes para doenças. A integração desses ensaios apoia a triagem robusta de portfólios e orienta decisões de avanço ou interrupção em pipelines de oncologia e neurobiologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta dos estados de ativação das Rho GTPases por meio da análise da pré-nililação e da ligação ao GTP.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao distinguir pools de proteínas associadas à membrana versus citosólicas.
- Fornece dados funcionais de validação de alvos para a descoberta de fármacos centrada em vias.
- Facilita a confiança preditiva na modulação da sinalização das pequenas GTPases em modelos de doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece leituras quantitativas validadas da atividade de GTPase adequadas para triagem de compostos.
- Padroniza os protocolos de fracionamento de membranas e ensaios imunossorventes para garantir reprodutibilidade.
- Permite formatos de ensaio escaláveis para reutilização em plataforma entre projetos.
- Permite avaliação confiável dos efeitos de compostos sobre estados de modificações pós-traducionais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao medir a atividade de GTPase em linhagens celulares de glioblastoma.
- Oferece continuidade translacional de modelos celulares à validação pré-clínica da modulação de vias.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular resultados bioquímicos a desfechos fenotípicos.
- Fortalece a desatenção preditiva na seleção de candidatos em pesquisas oncológicas e do sistema nervoso central.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método conecta a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica ao permitir leituras quantitativas e mecanicistas da atividade da Rho GTPase. Está indicado para uso desde a validação de alvos até a identificação de compostos líderes e estudos translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o impacto funcional de modificações pós-traducionais em modelos de doenças.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis de atividade de GTPases em resposta à modulação farmacológica.
- Análises: Oferece medidas de localização na membrana versus citosólica e de ligação ao GTP para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Permite a continuidade dos conhecimentos mecanicistas desde ensaios baseados em células até modelos pré-clínicos.
- Reutilização Corporativa: Oferece um fluxo de trabalho padronizado e adaptável para diversos alvos de pequenas GTPases em diferentes programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios de modificações pós-traducionais.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avançar ou não avançar e a eficiência do capital ao fornecer pontos finais bioquímicos robustos.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas que visam vias de GTPases pequenas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em fracionamento celular, immunoblotting e ensaios imunossorventes quantitativos.
- Necessita de acesso à ultracentrifugação, leitores de microplacas e reagentes de anticorpos validados.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para obter resultados reprodutíveis.
- Adaptável a diversas linhagens celulares e membros da família das GTPases pequenas, com otimização do protocolo.
- As limitações de estabilidade e armazenamento das amostras devem ser gerenciadas para garantir a integridade dos dados.
