Isolamento do conteúdo do reservatório glândula Mandibular de Bornean ' explodindo das formigas (Formicidae) para Volatilome análise por GC-MS e MetaboliteDetector

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na metabolômica de insetos. A abordagem de perfil de metabólitos pode ser usada para estudar a ecologia química das formigas, elucidando o papel dos voláteis na interação com outros organismos. A principal vantagem do fluxo de trabalho apresentado é: que ele consiste em duas partes distintas que podem ser aplicadas basicamente de forma independente.

Primeiro, o isolamento físico do reservatório da glândula mandibular e seu conteúdo e, segundo, o perfil não direcionado e a identificação da constituinte orgânica volátil, na amostra biológica de interesse. Demonstrando o procedimento estará Michaela Hoenigsberger, uma talentosa estudante de doutorado do meu laboratório. Antes de dissecar as formigas, em uma capela de exaustão, limpe uma placa de Petri de vidro e os instrumentos de dissecação usando lenços de papel e uma mistura de metanol e água.

Armazene o prato a menos 20 graus Celsius. Em seguida, pegue a massa de frascos de rosca curta de 1,5 mililitro, incluindo suas tampas de rosca que contêm septos de PTFE de silício. Armazene os frascos no gelo.

Em seguida, coloque uma bolsa fria maleável congelada em uma caixa de espuma de poliestireno. Em seguida, coloque a placa de Petri em cima da bolsa fria e coloque uma formiga congelada na placa. Agora, examine a formiga com um microscópio estéreo.

Verifique a integridade de seus compartimentos gastrais. A formiga deve ter uma região de gaster intacta. Não use formigas com gases achatados ou vestígios de conteúdo endurecido do reservatório da glândula mandibular em suas superfícies corporais.

Agora, isole o conteúdo do reservatório da glândula mandibular da formiga. Use uma pinça para segurar o propodium e o pecíolo e, em seguida, separe suavemente esses segmentos do corpo. Em seguida, segure o gaster no tergito quatro usando uma pinça fina.

Com outro par de pinças, pegue o tergito um e remova suavemente o tergito retirando-o. Repita esse processo para arrancar os tergitos dois e três, de modo que a porção gastrol dos reservatórios da glândula mandibular fique mais visível. Os reservatórios da glândula mandibular são de cor amarela nas formigas operárias C.Explodens, mas a cor pode variar do branco sobre o amarelo ao vermelho em outras espécies.

Em seguida, usando uma agulha de dissecação, remova suavemente o conteúdo semelhante a cera dos reservatórios da glândula mandibular emparelhada, riscando-os para fora do compartimento gastral. Remova apenas as partes do conteúdo do reservatório da glândula mandibular que podem ser isoladas sem aplicar pressão nas outras glândulas e estruturas corporais presentes no formigueiro. Não é necessário coletar todo o conteúdo do reservatório da glândula mandibular.

Agora, pegue o conteúdo do reservatório da glândula mandibular tocando-o suavemente com a ponta da agulha de dissecção até que grude nele. Em seguida, transfira o conteúdo da glândula para um frasco de rosca curta fria de 1,5 mililitro. Pode ser necessário mover a ponta da agulha ao longo da parede do frasco para injetáveis e espalhar o conteúdo da glândula na parede do frasco para injetáveis.

Mantenha a coleção coberta e no gelo até que possa ser analisada. Entre as dissecações, limpe novamente os instrumentos e o prato com a mistura de metanol e água. Para fazer uma amostra analítica, combine o conteúdo do reservatório da glândula de várias formigas.

Nesse caso, o conteúdo da glândula de cinco formigas operárias C.explodens é agrupado. Para um controle, colete amostras compostas pela glândula de Dufour adjacente aos reservatórios da glândula mandibular. Antes de extrair o conteúdo glandular, determinar as massas das amostras analíticas.

Em seguida, adicione 14 partes de acetato de etila de alta pureza gelado por volume, a uma parte de tecido em massa. Vortex a preparação por cinco minutos em condições resfriadas. Em seguida, centrifugue as amostras durante 10 minutos e recolha os sobrenadantes.

Cerca de 55 a 75 microlitros de sobrenadante são esperados de uma amostra de cinco formigas. Transfira cada sobrenadante para um frasco de rosca curta pré-resfriado de 1,5 mililitro com uma microinserção de 0,1 mililitro e feche bem os frascos usando tampas de rosca contendo orifícios e septos de PTFE de borracha vermelha. Para uma sequência completa de medição GCMS, prepare um frasco de rosca curta de 1,5 mililitro com uma mistura calibrada de índice de retenção, feita pela diluição de soluções padrão de alcano disponíveis comercialmente em hexano, a oito miligramas por mililitro por composto.

Em seguida, prepare outro frasco de acetato de etila puro para servir como o solvente em branco. Na bandeja do amostrador automático resfriado do cromatógrafo de gás, coloque primeiro o branco do solvente, em segundo lugar, a mistura calibrante do índice de retenção, em terceiro lugar, o extrato do conteúdo do reservatório da glândula mandibular e, em quarto lugar, o extrato do conteúdo da glândula de Dufour. Colocar as amostras com o tabuleiro sobre gelo para transporte para o cromatógrafo em fase gasosa.

Insira a bandeja no amostrador automático resfriado. Para cada amostra, injectar um aliquato de um microlitro na especificação de massa GC para separação cromatográfica numa coluna adequada aos compostos-alvo. Como uma coluna de interface do usuário HP-5MS.

Em seguida, defina os parâmetros de GC apropriados. Por exemplo, use hélio no gás de arraste com um fluxo de coluna constante de um mililitro por minuto. Use uma rampa de temperatura do forno começando em 40 graus Celsius por dois minutos, seguida por uma rampa de 10 graus Celsius por minuto até 330 graus Celsius.

Seguido por uma espera de sete minutos. Com esses parâmetros, defina a temperatura de entrada para 270 graus Celsius. Agora, se necessário, ajuste as taxas de divisão para a especificação de massa do GC.

injecção de modo a que forneçam formas e intensidades de pico adequadas para os compostos de interesse. Defina a temperatura auxiliar para 350 graus Celsius. Para a especificação de massa.

Use os parâmetros a seguir. Uma temperatura de fonte MS de 230 graus Celsius, uma temperatura quádrupla MS de 150 graus Celsius, uma faixa de varredura de baixa massa 30 a alta massa 500, para resultar em uma taxa de varredura de cerca de três varreduras por segundo. E um atraso de solvente de 4,1 minutos para o branco do solvente e as amostras experimentais, ou um atraso de solvente de 6,1 minutos para a mistura calibrante do índice de retenção.

Quando as medições forem concluídas, abra o software de análise de dados GCMS e exporte os dados como um arquivo de projeto AIA para um dispositivo de armazenamento portátil para facilitar a transferência de dados para um computador com sistema operacional baseado em Linux de 64 bits. Para analisar os dados, siga a descrição do texto do protocolo do uso do software detector de metabólitos. No campo, as formigas foram coletadas e congeladas a menos 20 graus Celsius por dois dias e, em seguida, armazenadas a menos 80 graus Celsius até serem analisadas.

O conteúdo do reservatório da glândula mandibular de cinco formigas operárias C. explodens foi agrupado e medido por GCMS. A análise dos dados revelou dezenas de compostos putativos do conteúdo da glândula. Os dois metabólitos dominantes no extrato do conteúdo do reservatório da glândula mandibular causaram sobrecarga da coluna.

É por isso que a mesma amostra foi analisada novamente em uma proporção de divisão mais alta de 50 para um. A contaminação cruzada do conteúdo do reservatório da glândula mandibular por constituinte da glândula de Dufour foi investigada por meio de amostras da glândula de Dufour para examinar. Tais contaminantes exibiram tempos de retenção tardios, iniciando em torno de 29 minutos.

Os supostos metabólitos do conteúdo do reservatório da glândula mandibular detectados foram identificados com base em uma combinação de espectro e semelhança do índice de retenção com uma biblioteca interna. Desta forma, foi possível confirmar a identidade de cerca de 10% dos metabólitos detectados, alguns dos quais são listados como compostos de um a cinco. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar, extrair e determinar, um de cada vez, metabólitos, escolhendo a medição de MS.

Uma vez dominado, o isolamento, a extração por solvente e a aquisição de dados, da mesma amostra, podem ser feitos em cerca de duas horas se forem realizados corretamente. Dependendo da complexidade do perfil do composto orgânico volátil, o tempo necessário para a avaliação dos dados varia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a amostra permanentemente resfriada, desde a coleta até a análise.

Além disso, antes da seção, deve-se verificar se o gaster da formiga está fisicamente intacto. Este procedimento também pode ser combinado com a quantificação comparativa ou absoluta dos metabólitos, a fim de responder a perguntas adicionais, como a composição metabólica e as diferentes condições ambientais, ou quantidades absolutas de constituinte enlatado. Convenientemente, as etapas de extração, medição e avaliação de dados deste protocolo também podem ser aplicadas a vários sistemas biológicos, como outros insetos, microrganismos ou plantas.