Name: Protocolo para criar feridas crônicas em camundongos diabéticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprenda a criar feridas crônicas em camundongos diabéticos db/db-/- usando estresse oxidativo e inibição enzimática. Este modelo reproduz biofilme e feridas persistentes para estudar mecanismos de cicatrização.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores não têm agradecimentos.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Uma vez que as feridas crônicas são criadas nos camundongos, o modelo pode ser usado para estudar os processos de cicatrização de feridas envolvidas no início da cronicidade. O modelo também pode ser usado para testar a eficácia de uma ampla gama de produtos químicos e drogas que podem reverter o desenvolvimento de feridas crônicas e cicatrização prejudicada e levar ao fechamento da ferida e cicatrização. Os pontos de tempo diferentes após o início da cronicidade podem ser estudados: por exemplo, dias 1-5 após o...

A cicatrização de feridas envolve processos celulares e moleculares complexos que são regulados temporalmente e espacialmente, organizados em estágios seqüenciais e sobrepostos que envolvem muitos tipos de células diferentes, incluindo mas não limitados à resposta imune e à do sistema1. Imediatamente após a pele sustém uma lesão, fatores e células sanguíneas agregado ao local da ferida e iniciar a cascata de coagulação para formar um coágulo. Depois que a homeostase é conseguida, os vasos sanguíneos dilatam-se para deixar no local da ferida o oxigênio, os nutrientes, as enzimas, os anticorpos e os Fatores Quimiotáticos que quimioatraem polymorphonucleocytes para cancelar o leito da ferida de restos extrangeiros e secretam enzimas proteolíticas 2. as plaquetas ativadas secretam uma variedade de fatores de crescimento para estimular os queratinócitos na borda da ferida para re-epitelizar a área ferida. Monócitos recrutados para o local da ferida diferenciam-se em macrófagos que bactérias fagoocitose e neutrófilos mortos e secretam fatores adicionais para manter os sinais proliferativos e pró-migratórios de queratinócitos. Na fase de proliferação, enquanto a re-epitelização continua, novo tecido de granulação composto de fibroblastos, monócitos/macrófagos, linfócitos e células endoteliais continuam o processo de reconstrução2. A angiogênese é estimulada pela promoção da proliferação e migração de células endoteliais, resultando no desenvolvimento de novos vasos. A epitelização e a remodelação da matriz extracelular constroem uma barreira contra o meio ambiente. À medida que a ferida cicatrizar e o tecido de granulação evolui para uma cicatriz, a apoptose elimina células inflamatórias, fibroblastos e células endoteliais sem causar dano tecidual adicional. A resistência à tração do tecido é reforçada por fibroblastos remodelando vários componentes da matriz extracelular, como o colágeno, de modo que o tecido recém-formado é quase tão forte e flexível como a pele não ferida2.
Qualquer desvio desta progressão altamente concertada para o fechamento da ferida leva a feridas danificadas e/ou crônicas3. As feridas crônicas são caracterizadas pelo aumento do estresse oxidativo, inflamação crônica, microvasculatura danificada e matriz de colágeno anormal na ferida4. Estresse oxidativo, especialmente na ferida, pode atrasar o fechamento da ferida2,5. Quando, na primeira fase da cicatrização de feridas, a fase inflamatória torna-se regulamentada, o tecido hospedeiro assume extensos danos devido a um influxo contínuo de células inflamatórias5 que liberam enzimas citotóxicas, um aumento nos radicais livres de oxigênio, e mediadores inflamatórios não regulamentados, resultando em morte celular6,7.
Neste microambiente destrutivo, bactérias formadoras de biofilme aproveitam os nutrientes do hospedeiro e contribuem para o dano do tecido hospedeiro2. Estes biofilmes são difíceis de controlar e remover porque as substâncias poliméricos extracelular hidratadas compor das proteínas, do ADN, do RNA, e dos polisacáridos permitem que as bactérias abrigaram dentro para ser tolerantes às terapias antibióticas convencionais e iludir o resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro2,8,9.
Estudar feridas crônicas é crucial porque impactam ~ 6,5 milhões pessoas e custam ~ $40000000000 por ano nos EUA sozinhos10. Pacientes com diabetes têm aumentado os riscos para o desenvolvimento de feridas crônicas que necessitam de amputação, a fim de conter a propagação da infecção. Estes pacientes têm um risco de mortalidade de 50% dentro de 5 anos da amputação que é atribuída ao mecanismo da patofisiologia do diabetes11. A relação entre o sistema imunológico do hospedeiro e o microbioma na cicatrização de feridas é um tema vital da pesquisa em andamento, pois as conseqüências de feridas crônicas, se não resolvidas, incluem amputação e morte12.
Embora um esforço significativo tenha sido investido na compreensão de como as feridas crônicas se desenvolvem em humanos, ainda não está claro como e por que as feridas crônicas se formam. Experimentos para estudar os mecanismos de cicatrização prejudicada é difícil de conduzir em seres humanos, e os especialistas em cicatrização de feridas só vêem pacientes com feridas crônicas que já atingiram cronicidade por semanas a meses. Assim, os especialistas são incapazes de estudar o que os processos deu errado que levam a ferida a desenvolver para se tornar crônica2. Há uma falta de modelos animais que recapitulam a complexidade das feridas crônicas humanas. Até que nosso modelo estêve desenvolvido, nenhum modelo para estudos crônicos da ferida existiu.
O modelo de ferida crônica foi desenvolvido em camundongos com mutação no receptor de leptina (DB/DB-/-)13. Estes camundongos são obesos, diabéticos, e têm dificuldades de cicatrização, mas não desenvolvem feridas crônicas14. Níveis de glicose no sangue média em torno de 200 mg/dL, mas pode ser tão alto quanto 400 mg/dL15. Quando altos níveis de estresse oxidativo (SO) no tecido da ferida são induzidos imediatamente após o ferimento, a ferida torna-se crônica16. As feridas DB/DB-/- são consideradas crônicas por 20 dias e permanecem abertas por 60 dias ou mais. Biofilme produzido por bactérias pode ser visto desenvolvendo início três dias após o ferimento; um biofilme maduro pode ser visto 20 dias após ferir e persistir até qualquer fechamento da ferida. As bactérias formadoras de biofilme que encontramos nesses camundongos também são encontradas em feridas crônicas diabéticas humanas.
O estresse oxidativo é induzido pelo tratamento das feridas com dois inibidores de enzimas antioxidantes, catalase e glutationa peroxidase, duas enzimas com a capacidade de quebrar o peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio é uma espécie reativa de oxigênio e pode causar danos celulares através da oxidação de proteínas, lipídios e DNA. Catalase cataliza a decomposição do peróxido de hidrogênio em menos produtos químicos nocivos de oxigênio e água. 3-amino-1, 2, 4-triazol (ATZ) inibe a catalase ligando especificamente e covalentemente ao centro ativo da enzima, inativando-o17,18,19. ATZ tem sido utilizado para estudar os efeitos do estresse oxidativo tanto in vitro como in vivo através da inibição da catalase20,21,22,23,24. A glutationa peroxidase catalisa a redução do peróxido de hidrogênio através do antioxidante, glutationa, e é uma importante enzima que protege a célula contra o estresse oxidativo25. O ácido mercaptosuccinic (MSA) inibe a glutationa peroxidase ligando-se ao local ativo da selenocisteína da enzima com tiol, inativando-o26. A MSA tem sido utilizada para estudar os efeitos do estresse oxidativo in vitro e in vivo , bem como20,27,28.
Este novo modelo de feridas crônicas é um modelo poderoso para estudar, pois compartilha muitas das mesmas características observadas em feridas crônicas diabéticas humanas, incluindo inflamação prolongada do sistema operacional aumentado e formação de biofilme natural do microbioma cutâneo. As feridas têm a interação cutâneo-epidérmica danificada, o depósito anormal da matriz, a angiogênese pobre e o vasculature danificado. As feridas crônicas se desenvolverão em camundongos machos e fêmeas, de modo que ambos os sexos podem ser usados para estudar feridas crônicas. Conseqüentemente, o modelo crônico da ferida pode contribuir significativamente para avançar a compreensão fundamental de como tais feridas começam. Usar este modelo crônico da ferida pode fornecer respostas às perguntas fundamentais sobre como o cronicidade é iniciado/conseguido com as contribuições da fisiologia da cura danificada da ferida e do microbioma do anfitrião.

<table><tbody><tr><td>B6. BKS(D)-Leprdb/J&nbsp;</td><td>O Laboratório Jackson&nbsp;</td><td>00697</td><td>Homozigotos e heterozigotos disponíveis&nbsp;</td></tr><tr><td>Loção Removedora de Pêlos Nair com Aloe Calmante e Lanolina</td><td>Nair</td><td></td><td>um depilatório químico</td></tr><tr><td>Buprenex (buprenorfina HCl)</td><td>Henry Stein Animal Health</td><td>059122</td><td>0,3 mg/ml, Classe 3</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazol (ATZ)</td><td>TCI</td><td>A0432</td><td></td></tr><tr><td>Ácido merpantossuccínico (MSA)</td><td>Aldrich</td><td>88460</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td>autoclave esterilizada</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>029405</td><td>NDC 11695-6776-2</td></tr><tr><td>O tanque de oxigênio</td><td></td><td></td><td>deve ser compatível com o sistema de vaporização</td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>JA Baulch & Associados&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de cortar cabelo Wahl</td><td></td><td></td><td>Lithium Ion Pro</td></tr><tr><td>Acu Punch 7mm punções de biópsia de pele</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P750</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm&nbsp;</td><td>3M</td><td>Ref: 1624W</td><td>Curativo de filme transparente (6 cm x 7 cm)</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Conair</td><td></td><td>Almofada de aquecimento seco úmido</td></tr><tr><td>Seringas de insulina</td><td>BD</td><td>329461</td><td>0,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2")</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td> <td>cirúrgica afiada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espátula</td><td></td><td></td><td></td>de metal fino</tr><tr><td>Tubulação Nariz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de rato cone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pequenos recipientes</td><td></td><td></td><td></td> de plástico</tr></tbody></table>

protocolo para criar feridas crônicas em camundongos diabéticos

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

As feridas crônicas se desenvolvem como resultado da regulação defeituosa em um ou mais complexos processos celulares e moleculares envolvidos na cicatrização adequada. Eles impactam ~ 6,5 M pessoas e custo ~ $40B/ano nos EUA sozinho. Embora um esforço significativo tenha sido investido na compreensão de como as feridas crônicas se desenvolvem em humanos, questões fundamentais permanecem sem resposta. Recentemente, nós desenvolvemos um modelo novo do rato para as feridas crônicas do diabético que têm muitas características de feridas crônicas humanas. Usando DB/DB-/- camundongos, podemos gerar feridas crônicas induzindo altos níveis de estresse oxidativo (os) no tecido da ferida imediatamente após o ferimento, usando um tratamento único com inibidores específicos das enzimas antioxidantes catalase e glutationa peroxidase. Estas feridas têm níveis elevados de OS, desenvolvem o biofilme naturalmente, tornam-se inteiramente crônicos dentro de 20 dias após o tratamento e podem permanecer abertos mais por mais de 60 dias. Este novo modelo tem muitas características de feridas crônicas diabéticas em humanos e, portanto, pode contribuir significativamente para o avanço da compreensão fundamental de como as feridas se tornam crônicas. Este é um avanço importante porque as feridas crônicas nos seres humanos causam a dor e a aflição significativas aos pacientes e conduzem à amputação se não resolvidas. Além disso, essas feridas são muito caras e demoradas para tratar, e levam a perda significativa de renda pessoal para os pacientes. Avanços neste campo de estudo através do uso de nosso modelo de ferida crônica pode melhorar significativamente os cuidados de saúde para milhões que sofrem esta condição debilitante. Neste protocolo, nós descrevemos em grande detalhe o procedimento para causar as feridas agudas para tornar-se crônico, que não foi feito antes.

A Figura 5 mostra um exemplo de uma ferida sem tratamento de nervos inibidores que progridem para o fechamento da ferida e uma ferida com o tratamento de nervos inibidores que progridem para a cronicidade. A limpeza transparente foi deixada no lugar na ferida crônica de modo que o biofilme e a acumulação fluida possam ser vistos.
A iniciação crônica da ferida ocorre em menos de 6 horas e a margem da...

As feridas crônicas são desenvolvidas a partir de feridas agudas em um modelo de mouse diabético induzindo altos níveis de estresse oxidativo após uma ferida cutânea de espessura total. A ferida é tratada com inibidores para catalase e glutationa peroxidase, resultando em comprometimento da cicatrização e desenvolvimento de biofilme por bactérias presentes no microbioma cutâneo.

Protocolo para criar feridas crônicas em camundongos diabéticos

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Este modelo de mouse pode ajudar a responder perguntas no campo médico da cronidade da ferida. A maior vantagem deste modelo é que as feridas crônicas em camundongos imitam muitos aspectos das feridas crônicas em humanos. Para começar, coloque o mouse em uma superfície limpa e segure-o no lugar, beliscando a base de sua cauda.Em seguida, prepare os cortadores de cabelo e esteja pronto para afastá-los rapidamente se o mouse fizer algum movimento repentino. Raspe toda a parte de trás do pescoço para a cauda, incluindo toda a cauda. Levemente executar a lâmina contra a direção do crescimento do cabelo para o corte mais eficiente.Não pressione os cortadores profundamente na pele, pois isso pode machucar ou cortar. Em seguida, prepare a pele para uma aplicação de loção depilatória. Umedeça a pele com uma toalha de papel encharcada de água para evitar queimaduras químicas.Pressione levemente com pressão suficiente para molhar o cabelo cortado contra a pele. Em seguida, enquanto a pele está molhada, esfregue um pequeno montão de loção depilatória na região raspada por 15 a 20 segundos. Uma vez aplicada, deixe a loção reagir com a pele por 20 a 45 segundos.Antes de enxaguar a loção, limpe

protocol-to-create-chronic-wounds-in-diabetic-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nós desenvolvemos uma técnica minimamente invasiva para criar um modelo de ferida de coelho isquémica orelha dividindo a artéria central e do nervo e do feixe neurovascular craniana. Um túnel subcutâneo, em seguida, corta todos os tecidos subcutâneos. Este procedimento causa um transtorno pele mínimo e pode ser utilizado com segurança em animais diabéticos.

Uma técnica simplificada para a produção de um modelo de ferida isquêmica

Um modelo murino de cicatrização de feridas cutâneas que podem ser utilizados para avaliar compostos terapêuticos em contextos fisiológicos e patológicos.

Modelo Murino de Cicatrização

Células-tronco adiposo-derivado (ASCs) são facilmente isoladas e colhidas a partir da gordura de ratos normais. ASC as folhas podem ser criadas usando a célula-folha engenharia e podem ser transplantadas Zucker ratos diabéticos gordos, exibindo a espessura total da pele defeitos com osso exposto e então coberto com uma BICAMADA de pele artificial.

Criação e transplante de uma folha de células-tronco adiposo-derivado (ASC) em um modelo de cicatrização de feridas diabética

Aqui descrevemos um modelo murino diabético romance utilizando camundongos sem pelos para monitoramento em tempo real, não-invasivo, de infecções de ferida biofilme bioluminescentes Pseudomonas aeruginosa. Esse método pode ser adaptado para avaliar a infecção de outras espécies bacterianas e microrganismos geneticamente modificados, incluindo várias espécies biofilmes e testar a eficácia das estratégias de antibiofilm.

Venha para o lado da luz: In Vivo monitoramento de infecções por Pseudomonas aeruginosa biofilme em feridas crônicas em um modelo murino Hairless diabética

Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

O andaime DOX-CL preparado satisfazia os pré-requisitos de um curativo DW ideal em resistência mecânica, porosidade, absorção de água, taxa de degradação, liberação sustentada, antibacteriano, biocompatibilidade e propriedades anti-inflamatórias, que são consideradas essenciais para a recuperação de tecido danificado em DWs.

Doxycycline carregado de colágeno-chitosan andaime composto para a cura acelerada de feridas diabéticas

O modelo de feridas diabéticas induzidas por estreptozotocina em ratos machos com SD é atualmente o modelo mais amplamente utilizado para estudar a cicatrização de feridas no diabetes mellitus tipo I. Este protocolo descreve os métodos usados para construir este modelo. Também apresenta e aborda potenciais desafios e examina a progressão e as características angiogênicas das feridas diabéticas.

Um Protocolo para a Construção de um Modelo de Ferida em Rato de Diabetes Tipo 1

As feridas representam um desafio de saúde global. Este estudo desenvolveu uma cabine fotográfica padronizada utilizando planimetria digital para minimizar a variabilidade da medição da ferida. O monitoramento de feridas em camundongos ao longo de 14 dias revelou um aumento inicial na área e no perímetro da ferida, seguido de fechamento gradual. Essa metodologia pode auxiliar na avaliação da cinética de fechamento de feridas em modelos pré-clínicos.

Planimetria digital para avaliar a cinética de fechamento de feridas em um modelo de camundongo

Este documento descreve um protocolo para a hipertermia de corpo inteiro em camundongos que podem estimular a febre como condições até 12-24 horas.

Protocolo para Longa Duração Hipertermia corpo inteiro em Ratos

Nós descrevemos a formação de neo-hepática ilhota em STZ (estreptozotocina) induzida ratos diabéticos por transferência de genes de Neurogenin3 (Ngn3) e betacelulina (BTC), utilizando ajudante dependente do vector adenoviral (HDAD) e reversão da hiperglicemia. O nosso método tem vantagens do ajudante dependente de vectores adenovirais com a sua grande eficácia na transdução in vivo e a expressão do gene de longa duração.

Neo-Islet Formação em fígado de ratos diabéticos por Helper dependente de Transferência de Gene adenoviral Vector Mediada

Aprenda a criar feridas crônicas em camundongos diabéticos db/db-/- usando estresse oxidativo e inibição enzimática. Este modelo reproduz biofilme e feridas persistentes para estudar mecanismos de cicatrização.

Protocolo para criar feridas crônicas em camundongos diabéticos

Explorar mais vídeos