Protocolo para criar feridas crônicas em camundongos diabéticos

Este modelo de mouse pode ajudar a responder perguntas no campo médico da cronidade da ferida. A maior vantagem deste modelo é que as feridas crônicas em camundongos imitam muitos aspectos das feridas crônicas em humanos. Para começar, coloque o mouse em uma superfície limpa e segure-o no lugar, beliscando a base de sua cauda.

Em seguida, prepare os cortadores de cabelo e esteja pronto para afastá-los rapidamente se o mouse fizer algum movimento repentino. Raspe toda a parte de trás do pescoço para a cauda, incluindo toda a cauda. Levemente executar a lâmina contra a direção do crescimento do cabelo para o corte mais eficiente.

Não pressione os cortadores profundamente na pele, pois isso pode machucar ou cortar. Em seguida, prepare a pele para uma aplicação de loção depilatória. Umedeça a pele com uma toalha de papel encharcada de água para evitar queimaduras químicas.

Pressione levemente com pressão suficiente para molhar o cabelo cortado contra a pele. Em seguida, enquanto a pele está molhada, esfregue um pequeno montão de loção depilatória na região raspada por 15 a 20 segundos. Uma vez aplicada, deixe a loção reagir com a pele por 20 a 45 segundos.

Antes de enxaguar a loção, limpe levemente alguma loção em vários locais para verificar a reação. Se a pele é rosa e sem pelos, a reação é completa. Em seguida, segure o mouse para lavá-lo.

Usando a mão nondominante com o polegar pressione a base de sua cauda contra a palma da mão e feche os outros dedos. Em seguida, com o nariz do rato para cima e para longe da água, deixe a água passar por cima das costas do animal. Em seguida, rapidamente, mas suavemente, esfregue a parte de trás do mouse com a outra mão para lavar a loção.

Depois de remover todo o creme depilatório, seque a pele com uma toalha de papel. É importante não aplicar loção nas orelhas, cauda ou em qualquer lugar perto do rosto. Se isso acontecer, limpe imediatamente a loção com uma toalha molhada e, em seguida, passe a água sobre o mouse para evitar danos a essas áreas.

Se alguma mancha escura for notada depois de usar o creme, reaplique o creme para essas áreas. As manchas escuras da pele crescerão mais rápido durante a duração do experimento. Então corte o cabelo curto a cada três ou cinco dias quando necessário.

Um patch ou dois que não estão sobre o local de ferida é aceitável, mas se a parte de trás do mouse tem mais manchas escuras, não use-o para o modelo de ferida crônica. Depois de remover o cabelo, abriga o rato sozinho por pelo menos um dia antes de ferir porque a pele será muito sensível da loção depilatória. 30 minutos antes da cirurgia, injete o rato com 120 microliters de buprenorfina intraperitoneal em PBS estéril.

Todos os volumes deste procedimento assumem um mouse de 60 gramas. 20 minutos antes da cirurgia, injete o rato com 480 microliters de ATZ intraperitoneally em PBS estéril. Divida o volume em ambos os lados do abdômen.

Depois de administrar o ATZ, coloque o mouse em um pequeno recipiente plástico em cima de uma almofada de aquecimento quente até que a cirurgia comece. Cubra o recipiente pequeno com uma toalha de papel para ajudar a conter o calor. O rato deve se acalmar enquanto aquece.

Depois de confirmar um estado anestesiado, prossiga com o ferimento. Para iniciar o procedimento de ferida, pulverize uma limpeza química com 70% de etanol para limpar a parte de trás do rato para limpar o local da ferida e a superfície da pele. Não limpe excessivamente ou haverá o risco de matar as bactérias presentes na pele.

O sucesso do modelo de ferida crônica depende de condições não estéreis. Estes camundongos não são livres de germes e estão alojados em um vivarium convencional. O microbioma bacteriano que reside na pele é crucial para a iniciação e desenvolvimento subsequente de feridas crônicas após o tratamento com inibidores de enzimas antioxidantes.

Agora considere onde é o lugar da ferida. O ideal é usar o lado dorsal do mouse centrado e longe de manchas escuras da pele. Agora realize o procedimento de curativo em 30 a 45 segundos.

Primeiro pressione levemente um soco de biópsia de pele de sete milímetros no local da ferida desejada e gire o soco fundo o suficiente para deixar uma impressão do soco. Em seguida, extirpara a pele delineada puxando para cima o centro do soco com pinças e cortando ao longo do contorno com uma tesoura cirúrgica. Uma vez concluída, cubra a ferida com metade de um pedaço de curativo transparente.

Dentro de 10 minutos após o ferimento, aplique uma alíquota de 60 microliter de MSA em PBS estéril e deposite MSA topicamente na ferida. Mais tarde, seis horas após a cirurgia, administre outra causa de buprenorfina. Doses extras podem ser dadas conforme necessário.

A iniciação crônica da ferida ocorre em menos de seis horas e a margem da ferida é visivelmente alterada por estresse oxidativo. Uma ferida crônica é uma ferida que permanece aberta, ampliada comparando com a ferida inicial e contém biofilme. Depois de 20 dias, a ferida está em plena cronia.

As bactérias que formam biofilme que dominam o local da ferida incluem Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, e várias espécies de Staphylococcus e Corynebacterium. Essas bactérias também são encontradas em feridas crônicas humanas. Depois de assistir a este vídeo você deve ter uma boa compreensão de como criar feridas crônicas em ratos.

Uma vez que você tenha estabelecido essas feridas crônicas, você pode usá-las para investigar muitos dos mecanismos moleculares celulares envolvidos na iniciação da crônica da ferida.