Name: Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda a caracterizar glicoproteínas com dobra da imunoglobulina usando cristalografia de raios-X, interferometria de biolayer e calorimetria de titulação isotérmica. Este método permite analisar interações proteína-ligante em tempo real.

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Foram realizados experimentos de difração de raios x descritos neste trabalho usando de luz síncroton 08-ID e 08-BM na fonte de luz canadense, que é apoiado pela Fundação de Canadá para inovação, ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá, o Universidade de Saskatchewan, o governo de Saskatchewan, Canadá ocidental diversificação económica, o Conselho de pesquisa nacional do Canadá e os institutos canadenses de pesquisa em saúde. Nós gostaríamos de reconhecer o estrutural & biofísicos facilidade do núcleo, o Hospital para crianças doentes, para o acesso aos instrumentos ITC e BLI. J.E.O. foi apoiado por Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483 dos institutos canadenses de pesquisa em saúde. T.S. é um destinatário de Canadá graduação bolsa de Mestrado o prêmio e uma bolsa de pós-graduação Canadá Vanier dos institutos canadenses de pesquisa em saúde. Este trabalho foi apoiado pela operação grant PJT-148811 (J.-p. j) dos institutos canadenses de pesquisa em saúde. Esta pesquisa foi desenvolvida, em parte, graças ao financiamento do programa de cadeiras de pesquisa do Canadá (J.-p. j).

Os autores declaram não interesses concorrentes.

Glicoproteínas de membrana-ancorados são críticas para a função celular e atraentes alvos terapêuticos. Aqui, apresentamos um protocolo para a caracterização estrutural e biofísico do ECD de glicoproteínas de membrana, em paz e em complexos com ligantes de pequenas moléculas e fragmentos de Fab. Usamos com sucesso este protocolo para determinar a estrutura de cristal dos três domínios Ig N-terminal-maioria da porção extracelular do humano CD2228, um crítico co receptor nas células B envolvidos em manter a imunidade humoral na seleção79. Temos também caracteriza-se o sítio de ligação de CD22 com seu ligante natural α2-6 sialyllactose e definido o modo de reconhecimento de um anticorpo terapêutico no sentido humano CD22. Estes resultados fornecem insights sobre a relação estrutura-função de um membro chave da família Siglecs que restringiu a expressão em células B e um roteiro molecular para o desenvolvimento da molécula pequena nova CD22 direcionada e baseados em anticorpos terapêutica. Enquanto este protocolo foi utilizado com sucesso para um receptor de célula B Ig-contendo, propomos que a nossa abordagem pode ser aplicada para a caracterização estrutural e Biofísica de qualquer glicoproteína de membrana com uma organização de domínio distinto. Em tais casos, construa o projeto e combinatório glicano N-lig mutações (ou Gln ou Ala) podem ser avaliadas para encontrar uma construção apropriada para o crescimento de cristais e difração de alta resolução.
Obtenção de uma amostra homogênea e puro glicoproteína é de importância crítica para o crescimento de cristal e difração de raios x, bem como para caracterização biofísica a jusante. N-ligados os glicanos presentes em glicoproteínas são inerentemente heterogêneos e podem causar a heterogeneidade conformacional e química dentro da glicoproteína que pode impedir a formação de cristais. Para reduzir este micro-heterogeneidade, estratégias que introduzem mutações pontuais para remover os resíduos de Asn, previstos para abrigar os glicanos N-ligados, ou usando linhas de células mutantes (como HEK293S) seguido de um tratamento com endoglycosidases (como EndoH) podem consideravelmente Melhore a cristalização sucesso15,21,22. Neste protocolo, discutimos a purificação de glicoproteínas solúveis e Fabs que são secretados na célula do sobrenadante. Secreção de glicoproteína fornece uma rota relativamente simples no sentido de pureza, sem a necessidade de lise celular ou a adição de produtos químicos ou detergentes. A célula sobrenadante, obtido seguinte célula colheita então é executada diretamente sobre uma coluna que tenha afinidade da proteína de interesse (por exemplo, Ni-NTA por glicoproteínas com sua tag ou afinidade de LC para fragmentos Fab). No entanto, dependendo da coluna de utilização e as condições da célula sobrenadante (por exemplo, pH), a capacidade de ligação da proteína de interesse para a coluna pode ser afetada. Se este for o caso, pode ser necessário para se concentrar e troca a célula sobrenadante para melhorar a ligação à coluna de buffer. Além disso, é altamente recomendável que os passos de controle de qualidade durante a purificação ser empregado para ajudar a avaliar a pureza da proteína. Executando um gel de SDS-PAGE ou borrão ocidental de todas as amostras (antes, durante e após as etapas de purificação) pode gerar insights sobre se o esquema proposto de purificação é apropriado para a proteína de interesse. Se o contaminantes bandas são visíveis em SDS-PAGE, ou se várias espécies são obtidos durante a purificação (por exemplo, vários picos na exclusão de tamanho), etapas de purificação adicional deve ser considerada, por exemplo, cromatografia de troca iónica, a ganhar em pureza e aumentar as chances de cristalização a jusante80.
Para cristalização macromolecular, muitas vezes é fundamental para obter rendimentos elevados da proteína de interesse para permitir a seleção de um grande número de potenciais condições de cristalização em concentrações elevadas da proteína encontrar sucessos de cristal apropriado. Geralmente, as linhas de células HEK293 discutidas aqui (HEK293F e HEK293S) são sistemas robustos de expressão e podem ser facilmente dimensionadas para produzir mais amostra, se necessário. No entanto, é possível que a proteína de interesse não pode exprimir suficientemente dentro destas linhas de célula. Nestes casos, outras linhas celulares, tais como Expi293 células81,82, foram encontradas para mostrar níveis superiores de expressão de proteínas em devem ser consideradas como uma alternativa.
Se bem ordenadas, diffracting cristais não são obtidos após o teste de várias construções da proteína de interesse, apesar de alta pureza, pode ser necessário expandir as técnicas de cristalização para promover a formação de cristais. Tem sido demonstrado que Fab fragmentos de anticorpos e nanobodies podem ser potenciadores de cristalização excelente e promover bem-ordenado cristal embalagem83,84,85. Estes fragmentos podem ser expressas purificados a homogeneidade e usados em um complexo com a proteína de interesse para promover a cristalização. Importante, fragmentos Fab produzidos conforme descrito na seção 10 podem ter uma tendência para formar de dímeros não-funcional LC86. Esses dímeros são contaminantes e devem ser removidos durante a purificação. Em nossa experiência, dímeros LC muitas vezes têm um volume de retenção diferentes na exclusão de tamanho, ou eluir como um pico distinto em cromatografia de troca iônica, em assim podem ser removidos da purificação Fab - porém este não é sempre o caso. Se estas técnicas são insuficientes para retirar a purificação Fab dímeros de LC, métodos de purificação adicionais, tais como a purificação da afinidade da proteína G, podem ser empregados para melhorar a pureza.
Alternativa para co-complexação com fragmentos Fab, técnicas bem documentadas como microseeding matriz aleatória podem melhorar as chances de obter cristais bem-ordenado63,70. Este método envolve a adição de pequenas quantidades de cristais esmagados, ideais para a condição de cristalização, fornecendo uma nucleada para promover o crescimento de cristal de cristal. Isso pode ser realizada usando cristais da proteína de interesse, ou aqueles com estrutura de arquitetura e terciário de domínio semelhante. Além disso, microseeding matriz aleatória pode ser executada em tentativas para cristalizar a proteína sozinha, ou em complexo com um fragmento Fab ou pequenas moléculas de interesse. Recentes avanços na microscopia cryo-elétron também fazem desta técnica uma alternativa atraente para cristalografia de raios x para a obtenção de informações estruturais de alta resolução para moléculas com características adequadas87,88, 89,90,91.
Quando a eliminação de conjuntos de dados de difração de raios x falha pelo senhor, HA de imersão pode ser necessária para resolver o problema da fase por dispersão anômala ou substituição isomórfica. Inspeção da sequência de aminoácidos da proteína pode fornecer pistas sobre a estratégia para derivatização HA, incluindo o pH ótimo para vinculação. Em particular, não pareadas cisteínas dentro da proteína especificamente podem vincular HA compostos que contêm mercúrio. Cristais nativos com HA compostos de imersão é um processo iterativo para determinar a identidade do ideal HA composto, sua concentração e o tempo de incubação necessário. Se as tentativas iniciais de imersão não render bem diffracting cristais contendo um HA apropriado para eliminação, pode ser necessário introduzir substituições de aminoácidos para melhorar a probabilidade de ligação HA e melhorar o sinal anômalo. Exemplos incluem mutações para incluir um resíduo de cisteína livre para vincular eficientemente Hg, Au, Pt ou Pb. expressão de proteínas para eliminação anômala em uma mídia de seleno-metionina completada em e. coli é usada extensivamente para eliminação anômalo, no entanto um sistema equivalente que incorpora confiantemente seleno-metionina não está prontamente disponível para células de mamíferos em suspensão92,93e é uma área de desenvolvimento futuro.
Uma vez obtida a estrutura unliganded da glicoproteína de interesse, os cristais com ligantes pequena molécula de imersão pode ser realizada para obter uma estrutura do complexo imune do receptor-ligante. Estes dados fornecem um modelo para o projeto racional de ligantes mais específicos e de alta afinidade que pode ser usado como pequeno-molécula terapêutica, bem como fornece insights de alta resolução sobre a função biológica da glicoproteína. Ao tentar absorver os cristais de glicoproteína com ligantes de pequenas moléculas de interesse, inspeção da estrutura de cristal de unliganded pode indicar se a imersão deve ser possível. Se fechar cristal-embalagem contatos encontram-se em torno do local da ligação de ligante ou ao redor de regiões deverá sofrer mudanças conformacionais sobre vinculação de ligante, imersão provavelmente vai ser problemático. Neste caso, outros métodos, como cristalização co do complexo proteína-ligante devem ser executados.

Proteínas de superfície desempenham um papel crítico na função celular. Através de seus domínios extracelulares, estas proteínas de membrana podem modular interações célula-célula, adesão, transporte e sinalização1,2. A localização extracelular destas proteínas torna-los alvos atraentes para o desenvolvimento de terapêuticas para o tratamento de uma ampla gama de doenças, incluindo câncer e doenças auto-imunes3,4,5 , 6 , 7. uma das dobras de ectodomains de proteína de membrana humana mais comuns é a dobra como imunoglobulinas (Ig), que é formada por sete ou mais β-costas organizadas em duas β-folhas8,9. Normalmente, Ig-contendo glicoproteínas são estruturas de vários domínios com domínios Ig dispostos sequencialmente na porção extracelular da membrana proteína10. Modificações pós-tradução destas proteínas da pilha-superfície, particularmente glycosylation N - e O-ligados, foram mostradas para desempenhar um papel essencial no seu regulamento, dobradura, secreção e função11. Para melhorar a nossa compreensão de sua função e a melhor terapêutica de projeto que pode orientá-las, as técnicas são necessárias que permitem a sua caracterização molecular detalhada. Aqui, apresentamos uma combinação de técnicas que permitem a biofísica (biolayer interferometria (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC)) e caracterização estrutural (cristalografia de raios x) do domínio extracelular do Ig, contendo glicoproteínas de membrana, sozinhos e em complexo com seus ligantes biologicamente relevantes e moléculas terapêuticas (Figura 1).
Glycosylation N-lig é uma das modificações pós-tradução mais comuns em proteínas de mamíferos e ocorre durante a maturação da proteína dentro do retículo endoplasmático e Golgi12,13. Linhas de células, como células de rim humano embrionário (HEK) 293, foram desenvolvidas para a expressão recombinante de grandes quantidades de glicosilados proteínas de mamíferos14,15. Esta linha de celular foi desenvolvida em um formato de suspensão, que permite a facilidade de ampliação de produção de proteína para quantidades maiores em comparação com linhas de células aderentes. Aqui, nós utilizamos duas linhas de células HEK293: HEK293F e HEK293 Gnt eu- / - (HEK293S), que diferem entre si pela ausência de N-acetylglucosaminyl transferase eu (Gnt eu) no último. Por sua vez, produção dos glicanos complexas (como visto em HEK293F) não é possível, e em vez disso alta manose-tipo os. glicanos (predominantemente homem5GlcNAc2) residem no N-lig glicano sites18,19,20 . Com estas linhas de duas células em paralelo permite estudar o efeito de glicano tamanho e complexidade na função biológica e direcionamento terapêutico. Com efeito, glicoproteínas produzidas nas células HEK293F terá maiores, mais complexos os glicanos em comparação com a mesma glicoproteína produzida nas células HEK293S. Glicoproteínas produzidas nas células HEK293S são mais receptivos a cristalização, por causa da heterogeneidade química e conformacional reduzida de seus os glicanos N-ligados. Para melhorar ainda mais crystallizability, glicoproteínas produzidas nas células HEK293S (mas não HEK293F) podem ser tratadas com a enzima endoglycosidase H (Endo H), que resulta no decote de manose alta os glicanos tais que apenas um único N-acetilglicosamina (GlcNAc) moiety permanece em cada local de glicosilação ligados N21,22. Outros métodos também podem ser usados para limitar a N-glicano processamento dentro das células, tais como a adição de inibidores de glycosyltransferase durante a expressão da glicoproteína, incluindo kifunensine23. Abordagens alternativas envolvem a expressão de glicoproteínas nativas (em células HEK293F) seguida por deglycosylation enzimático usando peptídeo N-glicosidase F (PNGaseF). No entanto, deglycosylation com PNGaseF foi mostrado para ser menos eficaz em condições nativas e agregação de aumentos em algumas proteínas; em casos quando a proteína permanece solúvel após tratamento, adquire cargas negativas em sua superfície, devido a deamidation do resíduo asparagina, ácido aspártico,24, o que pode ser prejudicial para sua cristalização. Previsto N-glicosilação sites podem também ser uma mutação, mais frequentemente a resíduos de alanina ou glutamina, para impedir o glycosylation N-ligados nesses locais e gerar amostras de glicoproteína de alta homogeneidade. Alternativamente, glicoproteínas podem ser produzidas em outras culturas de células eucarióticas, incluindo leveduras, inseto e sistemas de planta ou outras linhas de células de mamíferos, como o hamster chinês (CHO) ovarianos células16,17.
Muitos vetores de expressão de mamíferos, incluindo pHLsec, permitem a secreção de glicoproteína recombinante ectodomains na célula média25. Secreção de glicoproteínas de células HEK293 permite a purificação rápida e fácil, sem necessidade de lise celular. Adição de tags de purificação (por exemplo, sua marca, Strep-tag, tag da bandeira, Myc-marca, HA-marca) para N ou C terminus do alvo glicoproteína permite a purificação por uma cromatografia de afinidade de etapa única. Posteriormente, a cromatografia de exclusão pode ser usada para produzir uma amostra monodisperso para caracterização biofísica e estrutural.
Uma amostra de glicoproteína altamente puro e homogêneo sob condições adequadas pode resultar em cristais bem diffracting. Uma vez que foi obtido um conjunto de dados de difração de raio-x completo de tais cristais, fases iniciais necessita de ser determinado para calcular a densidade de elétrons da glicoproteína. Graças a um número cada vez maior de estruturas em banco de dados da proteína (PDB), o método mais comumente usado para eliminação gradual de longe tornou substituição molecular (MR), que usa uma estrutura de proteínas relacionadas para obter fases iniciais26. No entanto, quando o senhor não consegue resolver o problema da fase, como ocasionalmente tem sido o caso de multi-Ig domínio glicoproteínas27,28,29, métodos alternativos são necessários. Neste artigo, detalhamos um método para embeber cristais com átomos pesados (HA) para eliminação gradual, que era necessário para resolver a estrutura do CD22 ectodomínio28. Identificar o direito HA para eliminação gradual é um processo iterativo que depende HA reatividade, átomos disponíveis em glicoproteína em um lattice de cristal dado e a cristalização solução30,31. Alternativamente, os átomos de enxofre natural em resíduos de cisteína e a metionina podem ser usados para eliminação gradual se presente em uma proporção bastante alta para outros átomos na glicoproteína e dados de difração de raios x podem ser coletados com redundância suficiente32, 33.
A função biológica de glicoproteínas de membrana é muitas vezes mediada por interações da proteína-proteína ou interações da proteína-ligante, como com os hidratos de carbono. Quando o ligante é pequeno o suficiente para difundir a partir da solução para o sítio de ligação de glicoproteína na estrutura cristalina, experiências de imersão pode ser bem sucedido para obter uma estrutura de cristal Co glicoproteína-ligante para entender melhor reconhecimento ligante.
Os protocolos aqui apresentados também são relevantes para a compreensão das interacções de glicoproteínas de superfície com ligantes sintéticos de terapêutica34,35 e anticorpo terapêutica36,37. Quando combinado com informações estruturais, vinculação cinética e termodinâmica pode ser poderosa para compreender e melhorar seus mecanismos de ação. Uma técnica que permite a análise cinética dos anticorpos terapêuticos, vinculando a uma glicoproteína é BLI38,39. BLI usa biosensores com um ligante imobilizado para medir a cinética de associação e dissociação com um parceiro de vinculação, em última análise, determinando uma constante de dissociação de equilíbrio (KD). BLI é uma abordagem atraente porque pequenas quantidades de glicoproteínas são necessárias (< 100 µ g), tempo de experiência é rápido (~ 10-15 min por execução), e isso pode ser automatizado. ITC também é útil para estudar as afinidades entre glicoproteínas e vinculação parceiros40,41,42,43. Enquanto o ITC é mais tempo e reagente intensivo, informações valiosas podem ser obtidas sobre a termodinâmica da interação (ΔG, ΔH, ΔS e estequiometria). ITC também é muito útil para o estudo de interações fracas que são frequentemente associadas com a ligação transitória de glicoproteínas de superfície de ligantes. Além disso, essas técnicas podem ser usadas em conjunto para avaliar a vinculação de várias construções e avaliar o efeito de diferentes glycoforms de N-ligadas obtidas expressando a glicoproteína em linhagens celulares diferentes. Realizar BLI e ITC com glicoproteínas produzido em HEK293F, HEK293S e tratados com Endo H pode fornecer uma visão aprofundada do papel dos glicanos em atividade biológica e compromisso terapêutico.
Aplicamos com sucesso esses protocolos para caracterizar o domínio extracelular (ECD) do humano CD2228, um membro de glicoproteína da família ácido siálico-ligação Ig-como lectinas (Siglecs) que é essencial para manter a homeostase de células B44 . Realizamos o projeto de construção em profundidade para facilitar a cristalização e progressivamente o dataset de raios-x por HA de imersão com Hg. Que também embebido CD22 cristais com seu ácido siálico ligante (α2-6 sialyllactose) para obter uma estrutura do complexo imune do receptor-ligante e assim, desde as plantas para a concepção de estrutura interativa de glicano mimetics45,46. Além disso, geramos a ligação de antígeno de fragmento (Fab) do epratuzumab de terapêutica anticorpo anti-CD22 - um candidato terapêutico atualmente em ensaios clínicos de fase III para de linfoma não-Hodgkin47- para determinar sua afinidade de ligação por BLI e ITC para diferencialmente glicosilados ECD CD22 constrói. Estes estudos revelaram um papel crucial para glycosylation N-ligados em noivado epratuzumab, com implicações potenciais para reconhecimento de CD22 disfuncional células B.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu; m Filtro Steritop</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS02RE</td><td></td></tr><tr><td>10 poços 4-15% gradiente SDS-PAGE gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>10x glicobuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td>Vem com reagente Endo H</td></tr><tr><td>10x Kinetics Buffer</td><td>PALL Fort&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1 mL fundo redondo 96 poços bloco</td><td>ThermoFisher</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>22 mm lamínula</td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>96-3 poços INTELLIPLATE&nbsp; reservatório de baixo volume</td><td>Art Robbins Instrumentos</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA Pure</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA Start&nbsp;</td>Dispositivo de filtragem centrífuga <td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 dispositivo de filtração centrífuga 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Auto-iTC200</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubos</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-945</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-947</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-970</td><td></td></tr><tr><td>Banho Seco Digital</td><td>Bio-Rad</td><td>1660562EDU</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Endo H</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td></td></tr><tr><td>Balão Erlenmeyer (base defletora), policarbonato, estéril, 500 mL,</td><td>DuoCAP TriForest Labware</td><td>FBC05000S</td><td></td></tr><tr><td>frasco Erlenmeyer 125 mL (base defletora), policarbonato, estéril, 125 mL com tampa ventilada</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipeta serológica estéril descartável, não pirogénica, 10 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipeta sorológica estéril descartável, não pirogênica, 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipeta sorológica estéril descartável, não pirogênica, 5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipeta sorológica estéril descartável, não pirogênica, 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>768180</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção de DNA FectoPRO, Polyplus</td><td>VWR</td><td>10118-842</td><td></td></tr><tr><td>Células Freestyle 293F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Expression medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12338001</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens Au</td><td>Hampton research</td><td>HR2-444</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens Hg</td><td>Hampton research</td><td>HR2-446</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens M1</td><td>Hampton research</td><td>HR2-448</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens M2</td><td>Hampton research</td><td>HR2-450</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens Pt</td><td>Hampton research</td><td>HR2-442</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293S</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de afinidade HisTrap</td><td>GE Healthcare</td><td>17525501</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap KappaSelect Affinity Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17545811</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap LambdaSelect Affinity Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17548211</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-1 Tela de cristal Bloco de 1,7 mL</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-1</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-2 Tela de cristal de 1,7 mL Bloco</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-2</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-3 Tela</td> <td>de cristal de 1,7 mLAnatrace</td><td>MCSG-3</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-4 Tela de Cristal Bloco de 1.7 mL</td><td>Microplaca Anatrace</td><td>MCSG-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de mercúrio</td><td>Sigma</td><td>1044170100</td><td></td></tr><tr><td>, 96 poços, polipropileno, fundo plano, preto&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Minstrel DT UV</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro shaker</td><td>Infors HT</td><td>MP25-TA-CO2HB</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 / 2000c Espectrofotômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega dispositivo centrífugo</td><td>PALL Ciências da Vida</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA biossensores</td><td>PALL Forte&eacute; Bio</td><td>18-5102</td><td></td></tr><tr><td>Octeto RED96</td><td>PALL ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oryx 4 robô de cristalização</td><td>Douglas Instrument</td><td>ORY-4/1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de platina</td><td>Sigma</td><td>520632-1g</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain</td><td>Protein</td><td>Ark GEN-QC-STAIN-1L</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Sterile 50 mL Sistema de Filtração a Vácuo Descartável 0.22 &micro; m Millipore Express</td><td>EMD Millipore SCGP00525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Aumento 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Cluster de brometo de tântalo</td><td>Jena bioscience</td><td>PK-103</td><td></td></tr><tr><td>Top96 Tela de cristalização</td><td>Reagentes Rigaku</td><td>1009846</td><td></td></tr><tr><td>Tryphan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24-poço com selante</td><td>Hampton research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; 2-6 sialillactose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8556-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização de glicoproteínas com dobra da imunoglobulina por cristalografia de raios-x e técnicas biofísicas

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glicoproteínas na superfície das células desempenham um papel crítico na função celular, incluindo a sinalização, adesão e transporte. Em leucócitos, vários destas glicoproteínas possuem dobras de imunoglobulinas (Ig) e são centrais para a regulamentação e reconhecimento imune. Aqui, apresentamos uma plataforma para o projeto, expressão e caracterização biofísica do domínio extracelular do receptor de célula B humana CD22. Propomos que essas abordagens são amplamente aplicáveis para a caracterização dos mamíferos glicoproteína ectodomains contendo domínios Ig. Dois suspensão rim embrionário humano (HEK) linhas celulares, HEK293F e HEK293S, são utilizadas para expressar glicoproteínas abrigar os glicanos complexos e alta-manose, respectivamente. Estas glicoproteínas recombinantes com glycoforms diferentes permitem investigar o efeito de glicano tamanho e composição na ligação do ligante. Podemos discutir protocolos para o estudo da cinética e termodinâmica de ligação de glicoproteína a candidatos de anticorpo terapêutico e ligantes biologicamente relevantes. Glicoproteínas recombinantes produzidas em células HEK293S são passíveis de cristalização, devido à homogeneidade de glicano, flexibilidade reduzida e susceptibilidade ao tratamento endoglycosidase H. Apresentamos métodos para embeber cristais de glicoproteína, com pesado átomos e pequenas moléculas para determinação de fase e a análise de ligação do ligante, respectivamente. Os protocolos experimentais discutidos aqui segura promessa para a caracterização das glicoproteínas mamíferos dar insights sobre sua função e investigar o mecanismo de ação da terapêutica.

Várias construções de ECD CD22 com êxito foram clonadas para o vetor de expressão pHLsec e overexpressed em mamíferos HEK293F e HEK293S linhas de célula (Figura 2 e 3A). Todas as construções foram purificadas a homogeneidade de tamanho por cromatografia de exclusão e rendeu uma amostra altamente pura para estudos de cristalização (Figura 3B e 3C). A construção de CD22 que levou a cristais bem diffracting era o truncamento de d1-d3 (resíduos 20-330), com cinco dos seis sites previsto glycosylation N-ligadas uma mutação de Asn para Ala (N67A, N112A, N135A, N164A e N231A), produzido em células HEK293S, tal que só o site de glicosilação em posição N101 foi mantida (essa construção é chamada CD2220-330, 5A). Cristais foram obtidos em várias condições de tela de matriz esparsa MCSG-1, mas os melhores cristais eram de uma condição que contém 30% (p/v) de polietilenoglicol 4000, cloreto de lítio 0,2 M e 0,1 M Tris, pH 8,5. Estes cristais nativos difratados para 2.1 resolução Å; usar estruturas conhecidas de domínios do Ig de proteínas relacionadas de Siglec não deu quaisquer soluções em pesquisas de senhor.
Para adquirir informações progressiva, nós embebido nativos cristais com um painel de compostos HA que incluía Hg, Pt, sistema operacional, Ta e Br em concentrações que variam de 1 a 20 mM de HA composto por um tempo de incubação de 5 min para 1D (Figura 4). Temos monitorado cristais para alterações na morfologia e encontrado que cristais embebido com HA composto em 20mm resultou no rachamento rápido e dissolução do cristal. Nós congelamos um total de 63 cristais que manteve sua forma seguindo incubações conjunto que foram embebidas com cluster de tântalo brometo, cloreto de platina, acetato de mercúrio e cloreto de mercúrio. Cristais embebido com 7 mM de cloreto de mercúrio para 30 min mostrado sinal anômalo em um exame de fluorescência para a fonte de luz canadense (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Canadá) e permitiu a múltiplos do comprimento de onda dispersão anômala coleta de dados de raio-x em um único cristal. Esses conjuntos de dados nos permitiram resolver a subestrutura de mercúrio de CD2220-330, 5A, que revelou um átomo de mercúrio único ligado a uma cisteína livre na posição C308 e, finalmente, permitiu-nos construir a estrutura de CD2220-330, 5A para o faseada mapa de densidade do elétron usando AutoBuild78.
Uma vez que a estrutura de unliganded foi resolvida, estávamos interessados em resolver a estrutura de CD22 acoplado a seu ligante, α2-6 siallylactose. Primeiro calculamos a afinidade de CD22 para α2-6 sialyllactose usando ITC para caracterizar a termodinâmica de vinculação da interação. Temos observado uma afinidade de ~ 280 µM e usou esta informação para identificar uma concentração inicial (~ 100 x KD) do ligante a ser usado para imersão de nossos cristais de20-330, 5A CD22 nativos. Nós embebido CD2220-330, 5A cristais com siallylactose de 25 mM para 5 min, 2 h, 14 h, 40 h e 5D e monitorados para alterações na morfologia do cristal. Um total de 75 ~ cristais de vários pontos de tempo e congelado enviado ao CLS síncrotron beamline 08-identificação (Saskatoon, Canadá) para coleta de dados remoto. Um total de seis raios-x de conjuntos de dados foram coletados de cristais bem diffracting. A estrutura de cada conjunto de dados de raio-x foi resolvida pelo senhor usando o unliganded CD2220-330, 5A estrutura como um modelo de pesquisa inicial. A densidade de elétrons resultante para todos os conjuntos de dados então foi inspecionada para densidade positiva no mapa de Fo-Fc que corresponderia para vinculados α2-6 sialyllactose dentro do sítio de ligação de CD22. Notavelmente, todos os conjuntos de dados coletados, mesmo aqueles provenientes de cristais encharcados depois de apenas 5 minutos de tempo de incubação, continha densidade positiva correspondente para o ligante no sítio de ligação. Globais estruturas do unliganded e CD22 liganded foram altamente semelhantes com mínimas alterações conformacionais, que podem explicar o sucesso de experiências de imersão com α2-6 sialyllactose.
Nós próximos caracterizada a superfície antigênica de CD22 reconhecido pelo anticorpo terapêutico epratuzumab em experimentos BLI e ITC (Figura 5). Perfis de cinética e termodinâmica de epratuzumab Fab ligação a CD22 construções com diferentes glycoforms revelam uma crescente afinidade para CD22 com tamanho reduzido glicano N-ligados, com até 14-fold melhoria na afinidade para os glicanos menores (327 nM vs 24 nM em BLI; 188 nM vs 58 nM em ITC). O glicano CD22 N-lig restringir o acesso do anticorpo para o epítopo foi identificado por BLI usando ponto único mutantes de CD22 e resolvendo o epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 co cristal estrutura28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> Figura 1 . Visão geral de caracterização de glicoproteína do projeto de construção para caracterização estrutural e Biofísica. (1) análise de sequências primária da glicoproteína representativa. Em cinza, o domínio extracelular (ECD); em verde, segmento transmembrana (TM); e em azul, o domínio citosólico da glicoproteína. Previsto os glicanos N-ligados são rotulados. (2) clonagem das construções de ECD. (3) expressão de ECD constrói em células de mamíferos. (4) purificação de glicoproteína. Enquanto as proteínas expressas em HEK293F conterá os glicanos complexos, proteínas expressas em HEK293S terá os glicanos manose alta. Tratamento enzimático de glicoproteínas produzidas nas células HEK293S com Endo H resultados em glicoproteínas com apenas um moiety GlcNAc em sítios de glicosilação N-ligados. (5a) glicoproteínas são testadas para a sua ligação com os anticorpos por interferometria biolayer (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Afinidade com ligantes pequenos também pode ser medida pela ITC. ensaios de cristalização (5b) de glicoproteínas com homogênea N-ligados os glicanos, tais como aqueles expressos em HEK293S e deglycosylated, com H. Endo (6), em alguns casos, a mutação dos sítios de glicosilação N-ligados é necessária obter cristais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> Figura 2 . Projeto de CD22 ectodomínio DNA constrói para expressão em células de mamíferos. A) representação do plasmídeo pHLsec usado para transfecção transiente de ECD CD22 construções. Sites AgeI e KpnI usados para clonagem são indicados com caixas vermelhas. B) The CD22 ECD contém sete domínios Ig (d1-d7) e 12 sítios de glicosilação previsto N-ligados (em azul). Quatro construções foram projetadas desde o ECD CD22. C) gel de agarose 1% mostrando PCR amplicons de ECD CD22 constrói para clonagem em vetor de expressão mamíferos o pHLsec. Primeira pista contém marcador de DNA de 1 kb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> Figura 3 . Expressão e purificação de glicoproteínas. A) efeito de densidade celular em rendimentos de expressão. Expressão da glicoproteína na cultura de pequena escala 25 mL de suspensão de HEK293F células transfectadas utilizando três diferentes densidades inicial das células (0,5 x 106 células mL-1, 1,0 x 106 células mL-1e 1,5 x 106 células mL -1). Quantificação realizada por densitometria de SDS-PAGE no painel esquerdo e BLI quantitativo no painel à direita. Valores são representativos de uma preparação de glicoproteína. B) cromatograma da primeira etapa da purificação para construir CD2220-330, 5A de 600 mL do sobrenadante usando uma coluna de afinidade Ni-NTA. A glicoproteína foi eluída usando um gradiente de imidazol (linha cinza), onde 100% corresponde ao buffer de eluição, que contém o imidazol 500 mM. Frações em pool são representadas com linhas verticais. C) cromatograma tamanho-exclusão para construir CD2220-330, 5A usando de alta performance do gel coluna de filtração. Frações em pool do pico eluição são representadas com linhas verticais. Inserir: Gel de SDS-PAGE manchadas de Coomassie mostrando a pureza da glicoproteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> Figura 4 . Cristal de imersão com átomos pesados. A) a estação de trabalho-amostra para embeber nativos cristais com compostos HA. Todas as ferramentas são rotuladas. B) as etapas seguidas para absorver os cristais de construir CD2220-330, 5A com compostos HA. Etapa 1, abra bem contendo cristais e cristais de transferência usando um loop para uma queda de 0,2 µ l sobre uma lamela contendo HA solução diluída na condição de cristalização, tal que a concentração final de HA varia de 1-10 mM. Etapa 2, a queda da placa de cristalização do selo e incube cristais com o HA composto por diferentes períodos de tempo. Etapa 3, montar o cristal embebido no loop e volta-embeber por 30 s em três consecutivos 0,2 µ l gotas contendo a solução de licor mãe suplementada com 20% (v/v) glicerol dispensada sobre uma lamela. Etapa 4, flash congelar o cristal montado em um loop com nitrogênio líquido e colocá-lo em um disco para a expedição para a trajetória de síncrotron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> Figura 5 . Biolayer interferometria e isothermal titulação calorimetria medições. A) experimento representante BLI. Painel superior: exemplo de configuração da placa para um experimento de cinética, onde a seguir é rotulada: 1 cinética x buffer (B), ax 6-glicoproteína marcado carregando (L), concentrações de Fab representativas (500, 250, 125, 62.5 nM), PBS + regeneração de 500 mM tampão (R) e 1 x neutralização de cinética de buffer (B). Bem, cada um contém 200 µ l de solução. Passo número para o experimento de cinética é indicado na parte superior da placa. Painel médio: Dados brutos representativos do experimento BLI executada usando biosensores Ni-NTA e o prato descrito no painel superior. Passo números correspondem à linha de base (1) sua glicoproteína6 x (2) a carregar, da linha de base (3), associação em série diluição da Fab (4) e dissociação (5). Etapas de regeneração não são representados (passos 6-7). Painel inferior: Dados analisados representativos mostrando cru associação e dissociação (linha azul), com a correspondente a 1:1 se encaixam (linha vermelha). B) painel superior: instalação placa representativa para um único ITC executar em um instrumento automatizado de ITC com sete experimentos em 96-poço redondo cadernal. Cada experimento é composto de três poços. O primeiro poço (vermelho) corresponde a amostra para a célula (400 µ l), o segundo poço (verde) corresponde a amostra para a seringa (120 µ l). O terceiro bem é deixado vazio, e as amostras mistas serão devolvidas a este bem após a conclusão do experimento. Experimentos 1, 2 e 7 são reserva nos controles de buffer. Experimentos de 3-5 representam experimentos triplicados com glicoproteína (P) na célula e Fab ou ligante (L) na seringa. Experimento 6 representa um calor de ligante de controle de diluição e deve ser subtraído de experimentos 3-5 durante a análise de dados. Painel inferior: Representante cru (topo) e processados (inferior) ITC dados mostrando Fab (epratuzumab), vinculando a ECD CD22 produziram nas células HEK293F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos abordagens para a caracterização estrutural e biofísica das glicoproteínas com a dobra de imunoglobulina por cristalografia de raios x, Calorimetria de Titulação Isotérmica e interferometria de biolayer.

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da glicoproteína. Fornecendo informações sobre a função da proteína, o papel dos glicanos ligados a N e o mecanismo e ação dos antibióticos direcionados à glicoproteína. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser aplicada a qualquer glicoproteína de interesse.Facilitar a caracterização estrutural e biofísica de uma ampla gama de alvos de glicoproteínas. Demonstrando este procedimento estará Hong Cui, coordenador de projetos de pesquisa em nosso laboratório. Para começar, prepare e transfeccione as células conforme descrito no protocolo de texto.Colha as células por centrifugação a 6.371 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Retenha o sobrenadante e use um filtro de 0,22 mícron para filtrá-lo. Carregar o sobrenadante filtrado a quatro mililitros por minuto numa coluna de Ni-NTA num sistema de cromatografia de bancada.Após isso, lave a coluna com três a quatro volumes de tampão de lavagem. Diluir a glicoproteína purificada da coluna utilizando um gradiente tampão de eluição, enquanto recolhe as frações. Puxar as fracções que contêm o pico evadido num dispositivo de filtração centrífuga com um limite de peso molecular nominal de 10 kilodalton.Em seguida, concentrar centrifugando a 4 000 vezes G e quatro graus Celsius durante 15 minutos ou até a amostra atingir um volume de 500 microlitros. Injete a glicoproteína concentrada em um loop de amostra de 500 microlitros. Carregue a glicoproteína em uma coluna de exclusão de tamanho de alto desempenho pré-equilibrada em um sistema FPLC a quatro graus Celsius enquanto coleta frações.Depois disso, execute um gel SDS-PAGE para identificar quais frações iludidas contêm a glicoproteína e puxe aquelas que contêm. Usando um dispositivo de filtração centrífuga com um limite de peso molecular nominal de 10 kilodaltons, concentre ECD desglicosilada pura a 4.000 vezes G e quatro graus Celsius até que a concentração desejada seja obtida. Depois de determinar a concentração de proteína, centrifugue a amostra a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos, para remover poeira e outros contaminantes.Em seguida, adicione 80 microlitros de solução de cristalização de uma tela de cristalização comercial a cada poço reservatório em uma placa de cristalização de gota de 96 poços. Use um robô de cristalização para dispensar gotas de proteína nos poços da placa de cristalização. Usando um volume total de gota de 200 nanolitros em uma proporção de um para um de proteína purificada para solução de cristalização.Depois disso, sele a placa com fita adesiva. Transfira a placa selada para um gerador de imagens de placas para inspeção por luz visível e ultravioleta. Identifique as condições que fornecem cabeças de cristal de glicoproteína iniciais e otimize ainda mais esses cristais, conforme descrito no protocolo de texto.Crioproteja os cristais mergulhando-os em uma solução de licor-mãe suplementada com 20% de glicerol. Em seguida, monte os cristais em CryoLoops. Usando nitrogênio líquido, congele rapidamente os cristais montados antes da coleta de dados.Depois de produzir cristais de boa difração em uma placa de cristalização de 24 poços, prepare uma solução estoque de 50 milimolares ligante e 20 milimolares Tris em pH 9,0 com cloreto de sódio 150 milimolar. Adicione várias concentrações desta solução de ligante à gota previamente preparada contendo os cristais ECD. Sele a gota para períodos de incubação que variam entre cinco minutos e cinco dias.Usando um microscópio de luz, rastreie visualmente os cristais para identificar possíveis alterações na morfologia. Após a incubação, monte os cristais usando CryoLoops e crioproteja-os em solução de licor-mãe suplementada com 20% de glicerol. Para iniciar a interferometria de biocamadas, prepare 50 milímetros de 1X Kinetics Buffer a partir de 10X Kinetics Buffer conforme descrito no protocolo de texto.Adicione 200 microlitros deste tampão a uma placa de pré-umedecimento. Transfira seis biossensores Ni-NTA para a placa e deixe-os hidratar no tampão por 10 minutos. Em seguida, dilua o ECD marcado com His em um mililitro de 1X Kinetics Buffer a uma concentração final de 25 nanogramas por microlitro.E prepare diluições em série do FAB purificado. Agora aquate os reagentes em uma microplaca de 96 poços, como visto aqui. Onde B representa o tampão cinético 1X, L representa a carga de glicoproteína marcada com His, as entradas numéricas representam as concentrações diluídas de FAB e R representa o tampão de regeneração.Transfira os biossensores hidratados para poços contendo 1X Kinetics Buffer por 60 segundos para colocá-los na linha de base. Em seguida, carregue a glicoproteína a uma concentração de 25 nanogramas por microlitro por 240 segundos a 1.000 RPM. Coloque os biossensores de volta nos poços contendo 1X Kinetics Buffer por 60 segundos para uma segunda linha de base.Transferir os sensores para os alvéolos que contêm as diluições seriadas de FAB durante 180 segundos. Após esta fase de associação, transfira os biossensores de volta para o 1X Kinetics Buffer para uma etapa de dissociação de 180 segundos. Em seguida, abra o software de análise.Na guia um, importe e selecione os dados. Na guia dois, etapa um seleção de dados, escolha seleção do sensor. Realce os poços de referência e clique com o botão direito do mouse para definir o poço de referência.Na etapa dois, subtração, selecione poços de referência. Depois disso, na etapa três, alinhe o eixo Y, selecione a linha de base e defina um intervalo de tempo de 0,1 segundos a 59,8 segundos. Na etapa quatro, selecione a correção entre etapas e alinhe à dissociação.Em seguida, na etapa cinco, processe a filtragem de Savitzky-Golay e clique em processar dados. O portão para a guia três. Na etapa dois, analise com um modelo um para um, selecione associação e dissociação, selecione ajuste global e agrupe por cor.Clique com o botão direito do mouse nas curvas, clique em definir cor e defina todas as curvas para as cores desejadas. Depois disso, selecione ajustar curvas. Se os dados estiverem bem ajustados, exporte o resultado clicando em salvar relatório.Repita o experimento para todas as condições desejadas. Neste estudo, várias construções do domínio extracelular CD22 são clonadas com sucesso no vetor de expressão pHL-sec. Essas construções são então superexpressas nas linhagens celulares HEK293-F e HEK293-S de mamíferos.Enquanto as culturas contendo aproximadamente um milhão e um milhão e meio de células por mililitro, expressaram níveis muito semelhantes de glicoproteínas. Culturas de apenas meio milhão de células por mililitro expressaram visivelmente menos. Depois disso, as culturas são colhidas e a glicoproteína ECD é isolada por cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho para purificar todas as construções até a homogeneidade do tamanho.Produzindo uma amostra altamente pura para estudos de cristalização e biofísica. Seguindo esses procedimentos, outros métodos como microscopia eletrônica de partículas singulares podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a estrutura tridimensionalista do domínio extracelular de comprimento total ou complexos de proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar, purificar e caracterizar estrutural e biofisicamente as glicoproteínas, seus ligantes e anticorpos direcionados.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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