Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da glicoproteína. Fornecendo informações sobre a função da proteína, o papel dos glicanos ligados a N e o mecanismo e ação dos antibióticos direcionados à glicoproteína. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser aplicada a qualquer glicoproteína de interesse.

Facilitar a caracterização estrutural e biofísica de uma ampla gama de alvos de glicoproteínas. Demonstrando este procedimento estará Hong Cui, coordenador de projetos de pesquisa em nosso laboratório. Para começar, prepare e transfeccione as células conforme descrito no protocolo de texto.

Colha as células por centrifugação a 6.371 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Retenha o sobrenadante e use um filtro de 0,22 mícron para filtrá-lo. Carregar o sobrenadante filtrado a quatro mililitros por minuto numa coluna de Ni-NTA num sistema de cromatografia de bancada.

Após isso, lave a coluna com três a quatro volumes de tampão de lavagem. Diluir a glicoproteína purificada da coluna utilizando um gradiente tampão de eluição, enquanto recolhe as frações. Puxar as fracções que contêm o pico evadido num dispositivo de filtração centrífuga com um limite de peso molecular nominal de 10 kilodalton.

Em seguida, concentrar centrifugando a 4 000 vezes G e quatro graus Celsius durante 15 minutos ou até a amostra atingir um volume de 500 microlitros. Injete a glicoproteína concentrada em um loop de amostra de 500 microlitros. Carregue a glicoproteína em uma coluna de exclusão de tamanho de alto desempenho pré-equilibrada em um sistema FPLC a quatro graus Celsius enquanto coleta frações.

Depois disso, execute um gel SDS-PAGE para identificar quais frações iludidas contêm a glicoproteína e puxe aquelas que contêm. Usando um dispositivo de filtração centrífuga com um limite de peso molecular nominal de 10 kilodaltons, concentre ECD desglicosilada pura a 4.000 vezes G e quatro graus Celsius até que a concentração desejada seja obtida. Depois de determinar a concentração de proteína, centrifugue a amostra a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos, para remover poeira e outros contaminantes.

Em seguida, adicione 80 microlitros de solução de cristalização de uma tela de cristalização comercial a cada poço reservatório em uma placa de cristalização de gota de 96 poços. Use um robô de cristalização para dispensar gotas de proteína nos poços da placa de cristalização. Usando um volume total de gota de 200 nanolitros em uma proporção de um para um de proteína purificada para solução de cristalização.

Depois disso, sele a placa com fita adesiva. Transfira a placa selada para um gerador de imagens de placas para inspeção por luz visível e ultravioleta. Identifique as condições que fornecem cabeças de cristal de glicoproteína iniciais e otimize ainda mais esses cristais, conforme descrito no protocolo de texto.

Crioproteja os cristais mergulhando-os em uma solução de licor-mãe suplementada com 20% de glicerol. Em seguida, monte os cristais em CryoLoops. Usando nitrogênio líquido, congele rapidamente os cristais montados antes da coleta de dados.

Depois de produzir cristais de boa difração em uma placa de cristalização de 24 poços, prepare uma solução estoque de 50 milimolares ligante e 20 milimolares Tris em pH 9,0 com cloreto de sódio 150 milimolar. Adicione várias concentrações desta solução de ligante à gota previamente preparada contendo os cristais ECD. Sele a gota para períodos de incubação que variam entre cinco minutos e cinco dias.

Usando um microscópio de luz, rastreie visualmente os cristais para identificar possíveis alterações na morfologia. Após a incubação, monte os cristais usando CryoLoops e crioproteja-os em solução de licor-mãe suplementada com 20% de glicerol. Para iniciar a interferometria de biocamadas, prepare 50 milímetros de 1X Kinetics Buffer a partir de 10X Kinetics Buffer conforme descrito no protocolo de texto.

Adicione 200 microlitros deste tampão a uma placa de pré-umedecimento. Transfira seis biossensores Ni-NTA para a placa e deixe-os hidratar no tampão por 10 minutos. Em seguida, dilua o ECD marcado com His em um mililitro de 1X Kinetics Buffer a uma concentração final de 25 nanogramas por microlitro.

E prepare diluições em série do FAB purificado. Agora aquate os reagentes em uma microplaca de 96 poços, como visto aqui. Onde B representa o tampão cinético 1X, L representa a carga de glicoproteína marcada com His, as entradas numéricas representam as concentrações diluídas de FAB e R representa o tampão de regeneração.

Transfira os biossensores hidratados para poços contendo 1X Kinetics Buffer por 60 segundos para colocá-los na linha de base. Em seguida, carregue a glicoproteína a uma concentração de 25 nanogramas por microlitro por 240 segundos a 1.000 RPM. Coloque os biossensores de volta nos poços contendo 1X Kinetics Buffer por 60 segundos para uma segunda linha de base.

Transferir os sensores para os alvéolos que contêm as diluições seriadas de FAB durante 180 segundos. Após esta fase de associação, transfira os biossensores de volta para o 1X Kinetics Buffer para uma etapa de dissociação de 180 segundos. Em seguida, abra o software de análise.

Na guia um, importe e selecione os dados. Na guia dois, etapa um seleção de dados, escolha seleção do sensor. Realce os poços de referência e clique com o botão direito do mouse para definir o poço de referência.

Na etapa dois, subtração, selecione poços de referência. Depois disso, na etapa três, alinhe o eixo Y, selecione a linha de base e defina um intervalo de tempo de 0,1 segundos a 59,8 segundos. Na etapa quatro, selecione a correção entre etapas e alinhe à dissociação.

Em seguida, na etapa cinco, processe a filtragem de Savitzky-Golay e clique em processar dados. O portão para a guia três. Na etapa dois, analise com um modelo um para um, selecione associação e dissociação, selecione ajuste global e agrupe por cor.

Clique com o botão direito do mouse nas curvas, clique em definir cor e defina todas as curvas para as cores desejadas. Depois disso, selecione ajustar curvas. Se os dados estiverem bem ajustados, exporte o resultado clicando em salvar relatório.

Repita o experimento para todas as condições desejadas. Neste estudo, várias construções do domínio extracelular CD22 são clonadas com sucesso no vetor de expressão pHL-sec. Essas construções são então superexpressas nas linhagens celulares HEK293-F e HEK293-S de mamíferos.

Enquanto as culturas contendo aproximadamente um milhão e um milhão e meio de células por mililitro, expressaram níveis muito semelhantes de glicoproteínas. Culturas de apenas meio milhão de células por mililitro expressaram visivelmente menos. Depois disso, as culturas são colhidas e a glicoproteína ECD é isolada por cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho para purificar todas as construções até a homogeneidade do tamanho.

Produzindo uma amostra altamente pura para estudos de cristalização e biofísica. Seguindo esses procedimentos, outros métodos como microscopia eletrônica de partículas singulares podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a estrutura tridimensionalista do domínio extracelular de comprimento total ou complexos de proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar, purificar e caracterizar estrutural e biofisicamente as glicoproteínas, seus ligantes e anticorpos direcionados.