Name: Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a visualizar a microbiota viável em intestinos de carrapatos usando hibridação in situ em montagem total. Este método acessível permite análise espacial e temporal sem equipamentos caros.

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Agradecemos sinceramente Dr. Mustafa Khokha, Yale University, para proporcionar a utilização dos seus recursos de laboratório. Agradecemos ao Sr. Wu Ming-Jie excelente assistência técnica. EF é um investigador HHMI. Este trabalho foi apoiado por um presente do John Monsky e Jennifer Weis Monsky fundo de pesquisa de doença de Lyme.

1. elaboração de modelos de DNA
<ol><li>Download a sequência de 16S rRNA específica para cada gêneros bacterianos do NCBI design e banco de dados de cadeia polimerase (PCR) compatível para a frente e reverter as primeiras demão que vão amplificar regiões específicas de gêneros (~ 200-250 pares de base long), conforme descrito anteriormente 19. também referir os código-fonte aberto bancos de dados SILVA20,21 e probeBase22 recursos online para pontas de prova do oligonucleotide rRNA-alvo e primers, como sondas de RNA para alguns gêneros de bactérias podem ser comercialmente disponível. Nota: É importante selecionar regiões do gene que são específicos para específicos gêneros e certifique-se de que projetado primeiras demão não amplificar gêneros bacterianos relacionados. Isto é crítico para obter a hibridização da sonda de gêneros/gene-específico.</li>
	<li>Alimente os carrapatos para 24, 48 ou 72 h em ratos, dissecar a coragem de carrapato e preparar RNA e cDNA de guts carrapato como descrito anteriormente23. Uso de cDNA como modelo para PCR amplificar amplicons de gêneros específicos usando um thermocycler. Executar uma parte alíquota do PCR-produto/amplicon em um gel de agarose 1,5% e confirmar que o amplicon corresponde o tamanho esperado pela visualização sob luz ultravioleta (UV), usando um sistema de imagem de gel.</li>
	<li>Clone o bacteriano 16S RNA ribossomal amplicon de interesse em um vetor de TA comercialmente disponível (Tabela de materiais) contendo RNA polimerase promotores apropriados para polymerases do bacteriófago (SP6, T7 ou T3). Sequenciar os clones para confirmar a identidade do amplicon e a direcionalidade do clone em relação a cada um dos promotores. Com base nisso, determine que o promotor de escolha para gerar sentido ou RNA antisenso sondas (Figura 1).</li>
	<li>Linearizar 1 mg do plasmídeo com uma enzima de restrição apropriada em um volume de reação de até 30 µLfor 2 h à temperatura recomendada pelo fabricante. Escolha as enzimas de restrição baseadas o promotor que será utilizado para gerar o sentido ou antisentida sonda (Figura 1). Verifique se a linearização por visualização de 2 µ l de reação de síntese em um gel de agarose 1%.</li>
	<li>Purificar as restantes 28 μL de DNA digerido usando um comercialmente disponível kit de purificação de coluna de produto do PCR e quantificar a concentração de DNA por Espectrofotômetro. Nota: Algumas sondas de sentido podem causar coloração de fundo muito maior do que a sonda antisentida correspondente e outras opções podem precisar de ser explorado. Controles negativos alternativos incluem plasmídeos codificação sequências não representadas na amostra ou outra sonda que produz um padrão distinto de hibridização.</li>
</ol>2. construção de sondas de RNA Digoxygenin-UTP
<ol><li>Prepare a mistura de nucleótidos combinando 7,5 µ l de 100mm UTP, 25 µ l de 10mm digoxygenin-UTP e 10 µ l de cada de 100mm ATP, GTP, CTP e num tubo de centrífuga 1,5 mL.</li>
	<li>Executar em vitro transcrição usando comercialmente disponível T7 ou Sp6 RNA polimerase kits, usando 1 µ l da mistura do nucleotide (passo 2.1) e 0,25 - 1 µ g do modelo de DNA. Trazer o volume até 20 µ l com água. Agite o tubo para combinar e rotação do pulso. Incube a 37 ° C para 2,5-3 h. Nota: A construção da sonda foi bem sucedida com plasmídeo digerido concentrações tão baixas quanto 7 ng / µ l, mas concentrações típicas a esta distância de passo de 15-25 ng / µ l. A reação de transcrição pode também ser incubada durante a noite a 37 ° C, mas isto não aumenta significativamente o rendimento de RNA.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de DNase (2.000 unidades / µ l) e incubar a 37 ° C por 10 min. Não exceda 10 min, ou a enzima pode começar a degradar o RNA.</li>
	<li>Adicione 30 µ l de cloreto de lítio gelada 7,5-8 M e 30 µ l de água livre de nuclease refrigerada para precipitar o RNA. Agite o tubo para misturar. Permitir que a precipitação do RNA para prosseguir durante a noite a-20 ° C.</li>
	<li>Recolher o RNA por centrifugação a 17.000 x g por 20 min a 4 ° C. Lavar o sedimento com 1 mL de etanol a 75% acabadas em água de pyrocarbonate (DEPC) dietílico e, em seguida, repita a centrifugação.</li>
	<li>Remover e descartar o sobrenadante, inverter o tubo em uma toalha de papel limpa e deixe para secar por 10 min. resuspenda o pellet em água livre de nuclease. Se o pellet é facilmente visível, resuspenda em 25 µ l. Se o sedimento é muito pequeno ou não visível, Ressuspender em 15-20 µ l. obter uma estimativa da concentração de RNA por Espectrofotômetro. Nota: RNA típica concentrações variam de 200-500 ng / µ l.</li>
</ol>3. visualização do RNA sondas pela electroforese do Gel do RNA formaldeído para avaliar a pureza de RNA
Cuidado: Formaldeído representa um risco de inalação; Portanto, gere as soluções necessárias para a análise do gel do RNA em uma coifa. Brometo de etídio é um suspeito cancerígeno; Manuseie com cuidado.
<ol><li>Prepare um gel de agarose 1% formaldeído como descrito anteriormente24 e lançar o gel em uma caixa de gel livre de RNases. Legal, uma vez que preencha a caixa de gel com 1x tampão (1 x MOPS em pH 7,0, 5% de formaldeído) em execução.</li>
	<li>Prepare o tampão de amostra (5 µ l 400 mg/mL o brometo de ethidium, 20 µ l 10 x MOPS, 35 µ l formaldeído e 100 µ l formamida). Combine 2 µ l de sonda RNA (passo 2.6) com 8 µ l de tampão de amostra. Incube a 70 ° C durante 10 min.</li>
	<li>Prepare RNA carregando Buffer combinando glicerol 50% de 5 mL, 1 mL 10% de formaldeído, 40mg de bromofenol, 40mg xileno cianol e 20 µ l de EDTA 0,5 M (pH 7,5). Após o uso, guarde esse buffer a-20 ° C.</li>
	<li>Adicionar 3 µ l de tampão de carregamento para a amostra de RNA de passo 3.2 e misture. Manter os tubos de amostra no gelo.</li>
	<li>Carrega o volume de toda a amostra de passo 3.4 no gel. Carrega uma alíquota de escada de single-stranded RNA ao lado para verificar o tamanho do RNA. Funcione o gel a 100 V ou baixe até o corante azul migra aproximadamente 75% da descida do gel. Visualize o RNA sob luz UV, usando um sistema da imagem latente do gel. Nota: Uma sonda de RNA de boa qualidade deve aparecer como uma banda discreta com uma mobilidade correspondente para o tamanho esperado da sonda (Figura 2, faixa 1). Se a sonda aparece como uma banda difusa e manchada com (Figura 2faixa 2) e que isso não deve ser usado.</li>
</ol>4. escala Gut coleção e fixação
<ol><li>Colete Ixodes scapularis ninfas que alimentaram em ratos para os pontos de tempo de interesse. Nota: Para efeitos desta técnica, carrapatos alimentados por 48 ou 72 h trabalho melhor.</li>
	<li>Disse o intestino do carrapato em MEMFA (tabela 1) em uma corrediça de vidro sob um microscópio de dissecação, evitando danos ao órgão, tanto quanto possível. Coloque uma marca em uma corrediça do microscópio limpa em 20-30 µ l de MEMFA. Usando um par de alto-carbono lâmina de barbear estéril aço #11 fatia da região da cabeça com o escudo do tique-taque, deixando o corpo do carrapato. Pressione suavemente o corpo para empurrar os divertículos de intestino e glândulas salivares para fora a cutícula do corpo. Separar as glândulas salivares e intestino e colher as entranhas sobre a lâmina de barbear.</li>
	<li>Colete a coragem em um tubo de 1,5 mL contendo 500 µ l MEMFA. Incubar o tubo em temperatura ambiente com balanço suave por 1h ou overnight a 4 ° C. Nota: As glândulas salivares do carrapato também e podem ser dissecadas e similarmente manchadas.</li>
	<li>Desidrate o tecido lavando suavemente 3 vezes com 1 mL de etanol a 100% gelada. Deixe a coragem afundar naturalmente para o fundo do tubo entre cada lavagem, centrifugação pode danificar o tecido. Para armazenamento a longo prazo, manter as amostras em etanol 100% a-20 ° C.</li>
</ol>5. construção de malha amostra cestas e titular da cesta 24-poço
<ol><li>Corte a parte de baixo de 2 mL ou 5 mL tubos de centrífuga de agarrar-parte superior usando uma lâmina de barbear com arestas único aquecida em um bisturi. Cuidado: A lâmina pode precisar de ser reaquecido várias vezes antes de terminar o corte.</li>
	<li>Corte quadrados de uma malha de nylon 110 µm ligeiramente maior do que a nova abertura do tubo. Bond a malha para o fundo do tubo, pressionando-os juntos levemente em um prato quente em fogo médio-baixo até que seja feita uma boa vedação. Deixe esfriar, garantir que não haja lacunas entre a malha e o tubo e corte malha em excesso em torno das bordas.</li>
	<li>Faça furos na tampa de uma placa de 24 tal que o lábio do cesto de amostra feita no passo 5.2 irá sentar-se no buraco e não cair, rendendo uma armadilha onde as partes inferiores das cestas amostra se sentará lá em poços quando eles são colocados na buracos na capa.</li>
	<li>Use este suporte de cesto montado para transferir cestas de uma placa para outra com relativa facilidade para a totalidade do protocolo em situ da hibridação. Use duas placas de 24 poços, para que enquanto uma incubação ocorre, a outra chapa é preparada para a próxima lavagem.</li>
</ol>6. hibridação in Situ : dia 1 (tempo: 4-5 h)
<ol><li>Coragem de transferência de rotulado cestas de amostra, separados por condição experimental e se destina a sonda de RNA. Nota: Mancha de pelo menos 5 coragem por condição para contabilizar a variação natural entre repetições.</li>
	<li>Hidratar as amostras com cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar no tecido, gradualmente aumentando a proporção de fosfato-salino com 0,1% de tensoativo não-iônico (PTw; A tabela 1) para etanol nas lavagens. Nota: Complete todos os lava no suporte do cesto 24-bem à temperatura ambiente com agitação suave a menos que indicado o contrário. Alíquotas de 500-600 µ l das soluções de lavagem em cada poço do titular tal que coragem em cada cesto está completamente submersos. Prepare todas as soluções com água tratada DEPC para prevenir a degradação de RNA.<ol>
<li>Lave as amostras por 5 min em 500 µ l 100% de etanol.</li>
		<li>Preparar pelo menos 500 µ l por cesta de amostra de 75%, 50% e 25% de etanol no PTw. Re-hidratar as amostras por lavagem por 5 min em cada solução de etanol, movendo-se para o mais baixo da maior concentração de etanol.</li>
		<li>Lave as amostras 4 vezes por 5 min cada no PTw.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilize as amostras com Proteinase K (10 µ g/mL) no PTw por 5 min.</li>
	<li>Prepare o tecido para a hibridização com as sondas de RNA.<ol>
<li>Lave as amostras duas vezes como descrito em 6.2 no suporte do cesto 24-bem à temperatura ambiente com agitação suave por 5 min em buffer de trietanolamina 500 µ l (0,1 M, pH 7.0-8.0) (tabela 1) para manter as amostras em um ambiente livre de amina.</li>
		<li>Tratar as amostras duas vezes com 500 µ l 0,25% ácido acético anidrido no buffer de trietanolamina (0,1 M, pH 7.0-8.0) por 5 min cada e, em seguida, lavar as amostras duas vezes no PTw por 5 min cada. Nota: O anidrido acético acetylates aminas gratuito para neutralizar a carga positiva, que é fundamental para evitar interações eletrostáticas não-específica e certifique-se de ligação específica da sonda para mRNA.</li>
		<li>Corrigir a coragem por 20 min com paraformaldeído de 4% 500 µ l no PTw e, em seguida, lavar 5 vezes no PTw por 5 min cada.</li>
		<li>Prehybridize por incubar as amostras em 500 µ l hibridização /in reserva o titular 24-bem cesta em prato bem 24 (tabela 1) para o 1,5-2,5 h a 60 ° C com agitação suave em um tremendo banho de água. Salve o tampão de hibridização, usado para a etapa de prehybridization para reutilizar no protocolo 2 dia (passo 7.1).</li>
		<li>Prepare soluções de hibridização da sonda diluindo-se sondas de RNA em tampão de hibridização para uma concentração final de 1 µ g/mL.  Incubar amostras com soluções de hibridização da sonda no suporte do cesto 24-bem a 60 ° C com agitação suave durante a noite em um tremendo banho de água (tabela 2). Cobrir a placa carregando o titular cesta confortavelmente com folha de alumínio para evitar a evaporação da solução de hibridação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. hibridação in Situ : dia 2 (Timing: 4.5-5.5 h)
<ol><li>Remover as amostras de soluções de hibridização da sonda e colocá-los para o buffer de hibridização reservada do dia anterior. Incube a 60 ° C, com agitação suave para 3 min. Nota: Soluções de hibridização da sonda podem ser armazenadas a-20 ° C para reutilização até 3 vezes.</li>
	<li>Prepare 2 x tampão citrato de sódio-solução salina (SSC), diluindo 20 x SSC na água tratada DEPC (tabela 1). Lavar as amostras, duas vezes por 3 min com 2 x SSC e, em seguida, 3 vezes por 20 min com 2 x SSC a 60 ° C para remover todos os vestígios de buffer de sonda e hibridação.</li>
	<li>Tratar com RNase A (20 µ g/mL) e RNase T1 (10 µ g/mL) em 2x SSC por 30 min a 37 ° C para remover único encalhado sonda RNA representando livre não-hibridizadas RNA.</li>
	<li>Lave uma vez com 2 x SSC por 10 min à temperatura ambiente. Preparar 0.2 x SSC por diluição 2 x SSC na água tratada DEPC, Então lave duas vezes com 0.2 x SSC por 30 min a 60 ° C para remover o excesso RNases.</li>
	<li>Lave duas vezes com 500 µ l de tampão de ácido maleico (MAB; A tabela 1) para cada 10 min.</li>
	<li>Incube as amostras com bloqueio de solução (2% bloqueio reagente no MAB) para 1,5 a 2 h. Nota: O reagente de bloqueio pode ser difícil de dissolver; aquecimento suave auxilia a dissolução.</li>
	<li>Substitua a solução bloqueio anti-Digoxigenina alcalina fosfatase-conjugado 500 µ l do anticorpo a uma diluição de 1:3,000 em solução de bloqueio e incubar à temperatura ambiente por cerca de 4 h ou a 4 ° C durante a noite.</li>
</ol>8. hibridação in Situ : dia 3 (Timing: 6 h durante a noite)
<ol><li>Lave as amostras de pelo menos 5 vezes por 30 min cada com 500 µ l MAB para remover o excesso anticorpo. Nota: Estas lavagens são flexíveis e podem ser prorrogadas para h 1-2, ou 3-4 lavagens podem ser substituídas por uma lavagem durante a noite a 4 ° C, com impacto mínimo sobre a eficácia.</li>
	<li>Lave duas vezes por 5 min com buffer de fosfatase alcalina, pH 9.5 (tampão de AP; A tabela 1).</li>
	<li>Começa a reação de cor, substituindo a última lavagem com 500 µ l de substrato cromogênico para fosfatase alcalina (Tabela de materiais). Cobrir a placa da amostra com papel alumínio e deixe a coloração proceder à temperatura ambiente por 3 - 5 h ou durante a noite a 4 ° C. Monitore periodicamente a reação de coloração, exibindo o tecido sob um microscópio dissecação para evitar overstaining. Nota: Quando a coloração é completa, uma tonalidade roxa é detectável pelo olho nas amostras antisentido-sondado sob o microscópio, mas o tecido não devem tornar-se muito escuro. Coloração prossegue lentamente a 4 ° C e pode demorar até 20-24 h.</li>
	<li>Parar a reação de cor por lavagem por 5 min em 500 µ l do MAB, em seguida, corrigir o tecido durante a noite em solução de Bouin. Atenção: Lidar com a solução do Bouin em uma coifa; é um carcinógeno corrosivo.</li>
</ol>9. hibridação in Situ : dia 4 (Timing: 3-3.5 h)
<ol><li>Preparar pelo menos 7 mL por cesta de amostra de 1 x SSC por diluição 20 x SSC na água tratada DEPC. Remover a solução do Bouin por lavar as amostras de 4 a 6 vezes com etanol 70% em 1 x SSC até que o tecido não é mais amarelo.</li>
	<li>Preparar 500 µ l por cesta de amostra das soluções de etanol 75%, 50% e 25% em 1 x SSC. Lave as amostras por 5 min em cada solução, movendo-se da maior concentração de etanol para a mais baixa para Re-hidratar o tecido. Lave duas vezes por 5 min cada 1 em x SSC.</li>
	<li>Incube as amostras na solução de água sanitária (tabela 1) para 90 min em uma mesa de luz em uma coifa. Nota: Este passo permite que qualquer pigmentação na coloração da solução de Bouins a ser removido ou amostras e aumenta o sinal de sonda para visualização clara.</li>
	<li>Lavar as amostras duas vezes com 500 µ l de 1 x SSC por 5 min.</li>
	<li>Realocar as entranhas com danos mínimos, invertendo-se o cesto de amostra num poço de uma nova placa de 24 e lavagem com etanol 70% através do fundo de malha usando uma pipeta de transferência. Armazenar a-20 ° C, se necessário.</li>
	<li>Para obter uma visão geral dos padrões de coloração de amostras múltiplas, como mostrado na Figura 3,, manter a coragem em etanol a 70% no 24-placa e vista com qualquer microscópio de campo claro. Para examinar a coragem individual sob um microscópio de campo claro, conforme mostrado na Figura 4, Figura 5, e Figura 6, montar a coragem em 100% glicerol sob as lamelas. Use uma espátula de plástico para manipular suavemente o tecido com danos mínimos. Nota: A alta viscosidade do glicerol ajuda a proteger o tecido de danos por compressão e permite o posicionamento cuidadoso dos divertículos, tais que o tecido pode ser visto de forma otimizada em ampliações.</li>
	<li>Capturar imagens no microscópio usando software de captura de imagem específica do microscópio (Tabela de materiais) e exportar como Tiff imagens para uma software de edição de imagem genérica. Para quantificar as diferenças relativas de coloração entre os tratamentos experimentais, baixe um software de análise de imagem genérico (Tabela de materiais). Abra a imagem dentro do software de análise e siga as instruções dentro do software para medir a intensidade do pixel da coloração e computar parcelas de histograma da coloração.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Este é o primeiro uso de uma técnica de hibridização (WMISH) toda a montagem em situ para estudar a microbiota de um vetor de artrópodes de patógenos. Nosso protocolo foi adaptado de um usado para estudar o desenvolvimento em Drosophila e em embriões de rã25,26. Toda a montagem do RNA em situ hibridização tem sido usada rotineiramente para localizar transcritos do gene espacialmente e temporalmente27 e visualizaç...

Humanos e gado patógenos transmitidos por artrópodes são encontrados em todo o mundo e representam cerca de 20% das doenças infecciosas globalmente1, mas eficaz e seguras vacinas contra a maioria desses patógenos não estão disponíveis. Nossa compreensão do importante papel dos microorganismos comensais, simbióticos e patogénicos, conhecidos coletivamente como o microbiome2, na modulação e moldar a saúde de quase todos os metazoários3 está se expandindo. Agora é evidente que os artrópodes vetores de patógenos também abrigam a microbiota do intestino e estes microbiota associada vetor foram mostrados para influenciar diversos patógenos vetor4,5. O artrópodes microbiome é composto de eubacteria, archaea, vírus e micróbios eucariontes como protozoários, nematoides e fungos6. No entanto, o foco de investigação predominante tem sido em eubacteria devido, em parte, à existência de genes marcadores e bancos de dados de referência para identificar membros bacterianos específicos.
Com foco em Ixodes scapularis, o vetor de escala de vários patógenos humanos incluindo Borrelia burgdorferi7, o agente causador da doença de Lyme, a otimização de uma técnica de visualização microbiana visava melhorar a nossa compreensão da microbiota do intestino carrapato no contexto das interações de vetor-patógeno. Várias questões permanecem para ser respondida no campo microbiome carrapato. O intestino é o local do primeiro encontro estendido entre o carrapato e o patógeno recebido no contexto de patógenos transferidos horizontalmente; Portanto, compreender o papel da microbiota do intestino vector em modulação interações vetor-patógeno irá revelar ideias significativas. Carrapatos têm um modo exclusivo de digestão da refeição de sangue, onde o processamento de farinha de sangue componentes leva intracelular Coloque8. O lúmen do intestino, aparentemente, serve como um recipiente para conter a refeição de sangue como os feeds de carrapato e assimilação e digestão de nutrientes ensue ao longo de vários dias de alimentação e continuam repletion pós. Os patógenos adquiridos pelo carrapato durante a alimentação entram o lúmen do intestino junto com a farinha de sangue e o lúmen torna-se assim um local principal de interações entre o carrapato, patógeno e microbiota residente. Como digestão prossegue através do repletion e carrapato Ixodid muda, o intestino sofre alterações estruturais e funcionais9. A composição e a organização espacial das bactérias do intestino também é susceptível de variar em concerto com o meio de intestino a mudança. É, portanto, importante compreender a arquitetura de bactérias residentes no intestino carrapato para compreender inteiramente a interação de carrapato, patógeno e microbiota do intestino.
Técnicas moleculares para descrever a microbiota associado anfitrião rotineiramente utilizam estratégias de sequenciamento paralelo elevado-throughput10 para amplificar e sequência de ADN ribossómico de 16S bacteriano (rDNA). Estas estratégias de sequenciamento contornar a necessidade de obter axénica culturas de bactérias específicas e fornecer uma descrição detalhada de todos os membros bacterianas representada na amostra. No entanto, tais estratégias são confundidas pela incapacidade de distinguir as contaminações ambientais de residentes de bona fide . Além disso, quando avaliar amostras, tais como carrapatos, que são pequenos em tamanho e, portanto, contenham baixa microbiota específica DNA produz, a probabilidade de amplificação dos contaminantes ambientais é o aumento de11 e resulta na interpretação ambígua de Microbiome composição. Caracterização funcional em conjunto com a visualização de determinadas bactérias viáveis, portanto, será fundamental para definir e discernir a microbiome do tique-taque, temporalmente e espacialmente. Para atingir este objectivo, aproveitamos a toda a montagem do RNA em situ da hibridação. Esta técnica é usada rotineiramente para avaliar padrões de expressão de genes em embriões e órgãos12,13,14 e permite análise semiquantitativa de expressão ao longo de toda a amostra de interesse. Isso difere do tradicional em situ hibridização as técnicas que utilizam cortes de tecido e muitas vezes exigem extensa análise do material seccionado com uma montagem computacional para prever a expressão em todo os órgãos15. Enquanto toda a montagem geralmente se refere a toda organismos12, aqui toda a montagem refere-se a toda coragem ou órgãos. As vantagens de usar a conjunto de montagem do RNA em situ hibridização abordagem para avaliar a arquitetura da microbiota do intestino de carrapato são múltipla. O intestino do carrapato é composto de 7 pares de divertículos, cada par variando em tamanho16. As diferenças funcionais, se algum, entre esses divertículos, não são compreendidas no contexto da biologia de carrapato, assinale a microbiota ou carrapato-patógeno interações. Manipulações do intestino que rompem os divertículos de intestino deslocaria a microbiota presente no lúmen do intestino ou os associados frouxamente o intestino e resultar em erros de interpretação da localização espacial da microbiota. Fluorescência-etiquetada do RNA em situ hibridização tem sido utilizada anteriormente para examinar o carrapato intestino transcrições17 fixação e abrindo divertículos de intestino individuais para garantir a hibridização da sonda e localizar b. burgdorferi transcrições secionando parafina toda carrapatos18. Ambas essas abordagens exigem manipulações dos tecidos carrapato antes da hibridização que afetaria a arquitetura de microbiota do intestino.
Neste relatório, descrevemos em detalhe o protocolo para examinar a escala viável gut microbiota usando toda a montagem em situ da hibridação (WMISH). O uso de toda a montagem do RNA em situ da hibridação permite um entendimento global da presença e abundância de bactérias do intestino específicas nas diferentes regiões do intestino e pode estimular novos insights sobre biologia de intestino carrapato no contexto da colonização do patógeno e transmissão. Além disso, a utilização de sondas de RNA dirigida contra RNA bacteriano específico permite a detecção de bactérias viáveis no intestino carrapato.

<table><tbody><tr><td>Malha de Nylon Sefar NITEX, 110 mícrons</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Vetor Fácil pGEM-T</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I (livre de RNAse)</td> Kit de síntese de RNA New <td>England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 Kit de síntese de RNA</td> de alto rendimento <td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Água, sem RNase, tratado com DEPC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5M, pH 8,0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído, 37%</td> <td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>RNA de levedura</td> <td>torulaSigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>Heparina, sal de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Denhardt, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de bloqueio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos Fab</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Levamisol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Substrato cromogênico para fosfatase alcalina</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>11442074001</tr><tr><td>Solução de Bouin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Escada de RNA de fita simples</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;#11 Lâminas de aço de alto carbono&nbsp;</td><td>C and A Scientific Premiere</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>Agitador orbital NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>DS-500E Agitador</td><td></td>orbital digital</tr><tr><td>Banho-maria agitador</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de documentação em gel</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ Sistema</td><td></td>de documentação em gel</tr><tr><td>Microscópio de campo claro;</td><td>Microscópio de</td> campo brilhante Nikon <td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kit de</td> purificação PCR <td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td>para caixa de luz</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Software de captura de imagem</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>Software de edição de imagem&nbsp;</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 versão 11.0</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Instrumentação compatível com automação</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Alemanha).&nbsp;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização da microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem in situ da hibridação

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Doenças infecciosas transmitidas por vetores artrópodes continuam a ser uma ameaça significativa para a saúde humana em todo o mundo. Os patogénios causadores dessas doenças, não existem isoladamente quando colonizam o vetor; em vez disso, eles provavelmente se envolvem em interações com microorganismos residentes no lúmen do intestino. A microbiota do vetor tenha demonstrada que desempenham um papel importante na transmissão de patógeno para várias doenças transmitidas por vetores. Se bactérias residentes no intestino do carrapato Ixodes scapularis , o vetor de diversos patógenos humanos incluindo Borrelia burgdorferi, influenciam a transmissão de carrapato de patógenos não é determinado. Precisamos métodos para caracterizar a composição das bactérias associadas com o instinto de carrapato para facilitar uma melhor compreensão dos potenciais interações entre espécies no intestino carrapato. Usando toda a montagem em situ hibridização Visualizar transcritos de RNA associados a determinada espécie bacteriana permite a recolha de dados qualitativos sobre a abundância e a distribuição da microbiota no tecido intacto. Esta técnica pode ser usada para examinar as mudanças no meio de microbiota do intestino ao longo da escala de alimentação e também pode ser aplicada para analisar a expressão de genes de carrapato. Coloração de carrapato todo coragem rendimento informações sobre a distribuição espacial bruta do alvo do RNA no tecido sem a necessidade de reconstrução tridimensional e é menos afetada pela contaminação ambiental, que muitas vezes confunde o sequenciamento baseado métodos frequentemente utilizados para o estudo de comunidades microbianas complexas. Em geral, esta técnica é uma ferramenta valiosa que pode ser usado para melhor compreender a microbiota-vetor-patógeno interações e seu papel na transmissão da doença.

A medição e avaliação da qualidade das sondas RNA são essenciais antes de iniciar a coloração. In vitro a transcrição eficácia depende altamente a quantidade e a qualidade do modelo de DNA. Nós rotineiramente visualizado as sondas de RNA em um gel de formaldeído para verificar a pureza e a quantidade de sonda gerada pelas reações da transcrição. As sondas devem aparecer como bandas brilhantes, discretas (Figura 2). Espectrofotométricas medições de co...

Aqui, apresentamos um protocolo para espacial e temporalmente, avaliar a presença de microbiota viável nas entranhas de carrapato usando uma abordagem de hibridação in situ de montagem todo modificado.

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a entomologia do carrapato, como avaliar a presença de bactérias viáveis no carrapato espacial e temporalmente. As principais vantagens desta técnica são que ela não requer seccionamento dos carrapatos ou equipamentos caros, e que permite a visualização espacial e temporal dos transcritos gênicos. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades porque envolve várias etapas e reagentes.No entanto, essa técnica não é trabalhosa. Embora possa levar cerca de três dias para ser concluído, o tempo prático é de apenas algumas horas por dia. Na preparação, alimente os carrapatos coletados por 48 a 72 horas antes da coleta intestinal.Para dissecar o intestino do carrapato, adicione 20 a 30 microlitros de solução de MEMFA a uma lâmina de vidro limpa. Em seguida, coloque o carrapato no MEMFA e ajuste o foco para a cabeça do carrapato. Agora, usando um par de lâminas de barbear estéreis de aço de alto carbono, corte a região da cabeça no escudo, deixando o corpo do carrapato intacto.Em seguida, pressione suavemente o corpo para empurrar os divertículos intestinais e as glândulas salivares para fora da cutícula do corpo. Em seguida, sem danificar as entranhas, separe-as cuidadosamente das glândulas salivares e coloque cuidadosamente os cortes em uma lâmina de barbear. Colete todas as tripas colhidas em um tubo de 1,5 mililitro em 500 micrômetros de MEMFA.Em seguida, incube o tubo à temperatura ambiente com um balanço suave por uma hora. No dia seguinte, desidrate o tecido conforme indicado no protocolo de texto e armazene-o a menos 20 graus Celsius. Para preparar uma cesta de malha, primeiro use uma lâmina de borda única aquecida em um bisturi para cortar o fundo de um tubo de centrífuga de dois ou cinco mililitros.A lâmina pode precisar ser reaquecida várias vezes antes que o corte seja concluído. Em seguida, corte um quadrado de uma malha de náilon de 110 mícrons que seja um pouco maior do que as novas aberturas. Em seguida, cole a malha à abertura pressionando levemente o tubo na malha em uma placa de aquecimento ajustada para fogo médio/baixo até que uma boa bobina seja feita.Depois de esfriar, corte o excesso de malha e certifique-se de que não haja lacunas. Faça 24 dessas cestas para combinar com um prato de 24 poços. Em seguida, faça furos na tampa de uma placa de 24 poços, de modo que a borda da cesta de amostra agarre o orifício e não caia.Quando concluídos, os cestos de amostra montados devem ficar até os poços. Agora, use este suporte de cesta ajustado para transferir cestas de uma placa para outra com relativa facilidade durante toda a hibridização in situ. Use duas dessas placas para que, enquanto a amostra estiver incubando em uma, a outra possa se preparar para a próxima lavagem.Esta seção cobre certas etapas da hibridização in situ. Consulte o protocolo de texto para obter uma descrição completa. Para começar, transfira cada amostra de tecido fixo para uma cesta de amostras rotulada.Organize a placa por condições experimentais e pinte pelo menos cinco tripas por condição. Primeiro, reidrate suavemente as amostras. Evite a introdução de bolhas de ar aumentando gradualmente a proporção de PBS-T para etanol em cada lavagem.Durante o primeiro dia, após a etapa de pré-hibridização de duas horas, em vez de descartar o tampão de hibridização, armazene-o para uso futuro durante o ensaio. Posteriormente, ao tratar as amostras com solução de hibridização por sonda, cubra a placa confortavelmente com papel alumínio para evitar a evaporação da solução. No segundo dia, carregue o tampão de hibridização reservado na placa de 24 poços e aqueça a placa até 60 graus Celsius.Mais tarde naquele dia, para remover todos os vestígios de sonda e tampão de hibridização, lave as amostras duas vezes com 2x SSC por três minutos por lavagem. Em seguida, lave as amostras três vezes com 2x SSC por 20 minutos por lavagem a 60 graus Celsius. Em seguida, prepare o anticorpo primário no tampão de bloqueio.Carregue 500 microlitros dessa mistura em cada poço. Após a etapa de bloqueio, incube em temperatura ambiente por cerca de quatro horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. No terceiro dia, execute a reação de cor em substrato cromogênico.Cubra a placa de amostra com papel alumínio. E durante a reação, verifique periodicamente se há coloração excessiva com o microscópio de dissecação. No quarto dia, é importante incubar e branquear em uma caixa de luz, pois isso permite que qualquer pigmentação nas amostras ou coloração da solução de Bouin seja removida e aumenta o sinal da sonda para uma visualização clara.Em seguida, após a lavagem com SSC, transfira cuidadosamente as amostras intestinais invertendo a cesta em uma nova placa de 24 poços. Enquanto estiver em poços, enxágue bem as cestas usando etanol 70%. Em seguida, preceda com imagens das amostras.É fundamental estimar a qualidade das sondas de RNA antes de usá-las. As sondas podem ser verificadas em um gel de formaldeído. Se eles aparecem como faixas brilhantes e discretas, são de boa qualidade.Ao colorir, alguma variação na distribuição é normal entre as réplicas biológicas, bem como entre os sete pares de divertículos de intestinos individuais. Portanto, é melhor corar pelo menos cinco tripas por condição para ter uma ideia do padrão médio de coloração. O sucesso geral é melhor medido comparando a coloração de amostras de sentido e antisentido para cada condição.Ambos devem ser desenvolvidos pelo mesmo período de tempo. As amostras de sentido devem ter pouca ou nenhuma cor roxa, enquanto as amostras antisense devem exibir coloração robusta com fundo mínimo. Criticamente, os tecidos devem estar totalmente imersos na mancha para uma exposição uniforme.É importante evitar o desenvolvimento excessivo da reação de cor. Isso pode resultar em uma grande quantidade de manchas de fundo, e as amostras de sentido podem começar a parecer amostras antisense. Outro fator que afeta os resultados é o quanto os carrapatos são alimentados de antemão.Carrapatos que não são alimentados ou alimentados por apenas 24 horas são difíceis de trabalhar. Suas entranhas são mais facilmente danificadas e não mancham bem. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias e meio a três dias se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todos os suprimentos listados na tabela de reagentes e materiais prontos antes de iniciar seu experimento. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Estudos de pesquisa a doença de Lyme muitas vezes exigem a geração de carrapatos infectados com o patógeno Borrelia burgdorferi, um processo que normalmente leva várias semanas. Aqui nós demonstramos uma microinjeção baseado procedimento de infecção do carrapato que pode ser realizado em poucas horas. Nós também demonstramos um método de imunofluorescência para na localização in situ de B. burgdorferi dentro de carrapatos.

Métodos para a transferência rápida e localização de Patógenos Doença de Lyme no intestino Tick

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

Fonte: Ng, K. M., Tropini, C. Visualização das Interações Microbiota-Hospedeiro Intestinal via Hibridização In Situ por Fluorescência, Coloração por Lectina e Imagem. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra o procedimento de hibridização fluorescente in situ (FISH) para colorir a microbiota intestinal dentro do tecido intestinal do camundongo, hibridizando sondas fluorescentes com rRNA bacteriano (ácido ribonucleico ribossomal) e contracolorindo as estruturas do hospedeiro para análise...

Hibridização in situ por fluorescência de bactérias intestinais em seções intestinais de camundongos

Este vídeo demonstra a visualização de bactérias no tecido da bexiga desparafinizado de um paciente infectado pelo trato urinário. A sonda marcada com fluorescência hibridizada com RNAs ribossômicos bacterianos 16s revela as bactérias associadas ao tecido e sua distribuição, fornecendo informações espaciais valiosas sobre sua densidade dentro da amostra.

Visualização de bactérias em seções de biópsia de bexiga via hibridização in situ fluorescente

A doença de Lyme é a doença mais comumente relatados transmitidas por vetores na América do Norte. O agente causador, a Borrelia burgdorferi é uma bactéria espiroqueta transmitida por carrapatos ixodídeos. A transmissão e a detecção de infecção em modelos animais é optimizada pela utilização de alimentação de carraça, que aqui descrita.

Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

Aqui nós apresentamos um protocolo de sequenciamento de próxima geração para sequenciação de rRNA 16S, que permite a identificação e caracterização das comunidades microbianas na vetores. Este método envolve a extração de DNA, amplificação e código de barras das amostras através de PCR, sequenciamento em uma pilha de fluxo e bioinformática para combinar dados de sequência de informação filogenética.

Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

O objetivo deste protocolo é visualizar candida albicans forma celular e localização no trato gastrointestinal de mamíferos.

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Este protocolo simplificado detalha um fluxo de trabalho para detectar e imaginar bactérias em amostras complexas de tecido, desde a fixação do tecido até micróbios de coloração com hibridização fluorescente in situ .

Visualização de Interações de Microbiota intestinal via Fluorescência In Situ Hibridização, Mancha de Lectina e Imagem

Micróbios intestinais, incluindo bactérias extracelulares e patógenos intracelulares como o vírus Orsay e microsporídios (fungos), são frequentemente associados a nematoides selvagens de Caenorhabditis . Este artigo apresenta um protocolo para detecção e quantificação de micróbios que colonizam e/ou infectam nematoides de C. elegans e para medir a carga de patógenos após infecções controladas em laboratório.

Hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) para visualizar colonização microbiana e infecção em intestinos de Caenorhabditis elegans

Aqui, descrevemos um procedimento que permite a detecção de bactérias patogênicas em todo o órgão durante a infecção e a quantificação das atividades do repórter fluorescente.

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

Aqui, apresentamos um protocolo para coletar saliva, hemolinfa, glândulas salivares e intestino médio, após a dissecção de um carrapato alimentado individualmente, para estudar a localização específica do tecido de patógenos transmitidos por carrapatos para avançar na compreensão da competência do vetor e das interações patógeno-microbioma.

Extração de saliva, hemolinfa, glândulas salivares e intestino médio de carrapatos individuais (Acari: Ixodidae)

Aprenda a visualizar a microbiota viável em intestinos de carrapatos usando hibridação in situ em montagem total. Este método acessível permite análise espacial e temporal sem equipamentos caros.

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

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