Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a entomologia do carrapato, como avaliar a presença de bactérias viáveis no carrapato espacial e temporalmente. As principais vantagens desta técnica são que ela não requer seccionamento dos carrapatos ou equipamentos caros, e que permite a visualização espacial e temporal dos transcritos gênicos. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades porque envolve várias etapas e reagentes.

No entanto, essa técnica não é trabalhosa. Embora possa levar cerca de três dias para ser concluído, o tempo prático é de apenas algumas horas por dia. Na preparação, alimente os carrapatos coletados por 48 a 72 horas antes da coleta intestinal.

Para dissecar o intestino do carrapato, adicione 20 a 30 microlitros de solução de MEMFA a uma lâmina de vidro limpa. Em seguida, coloque o carrapato no MEMFA e ajuste o foco para a cabeça do carrapato. Agora, usando um par de lâminas de barbear estéreis de aço de alto carbono, corte a região da cabeça no escudo, deixando o corpo do carrapato intacto.

Em seguida, pressione suavemente o corpo para empurrar os divertículos intestinais e as glândulas salivares para fora da cutícula do corpo. Em seguida, sem danificar as entranhas, separe-as cuidadosamente das glândulas salivares e coloque cuidadosamente os cortes em uma lâmina de barbear. Colete todas as tripas colhidas em um tubo de 1,5 mililitro em 500 micrômetros de MEMFA.

Em seguida, incube o tubo à temperatura ambiente com um balanço suave por uma hora. No dia seguinte, desidrate o tecido conforme indicado no protocolo de texto e armazene-o a menos 20 graus Celsius. Para preparar uma cesta de malha, primeiro use uma lâmina de borda única aquecida em um bisturi para cortar o fundo de um tubo de centrífuga de dois ou cinco mililitros.

A lâmina pode precisar ser reaquecida várias vezes antes que o corte seja concluído. Em seguida, corte um quadrado de uma malha de náilon de 110 mícrons que seja um pouco maior do que as novas aberturas. Em seguida, cole a malha à abertura pressionando levemente o tubo na malha em uma placa de aquecimento ajustada para fogo médio/baixo até que uma boa bobina seja feita.

Depois de esfriar, corte o excesso de malha e certifique-se de que não haja lacunas. Faça 24 dessas cestas para combinar com um prato de 24 poços. Em seguida, faça furos na tampa de uma placa de 24 poços, de modo que a borda da cesta de amostra agarre o orifício e não caia.

Quando concluídos, os cestos de amostra montados devem ficar até os poços. Agora, use este suporte de cesta ajustado para transferir cestas de uma placa para outra com relativa facilidade durante toda a hibridização in situ. Use duas dessas placas para que, enquanto a amostra estiver incubando em uma, a outra possa se preparar para a próxima lavagem.

Esta seção cobre certas etapas da hibridização in situ. Consulte o protocolo de texto para obter uma descrição completa. Para começar, transfira cada amostra de tecido fixo para uma cesta de amostras rotulada.

Organize a placa por condições experimentais e pinte pelo menos cinco tripas por condição. Primeiro, reidrate suavemente as amostras. Evite a introdução de bolhas de ar aumentando gradualmente a proporção de PBS-T para etanol em cada lavagem.

Durante o primeiro dia, após a etapa de pré-hibridização de duas horas, em vez de descartar o tampão de hibridização, armazene-o para uso futuro durante o ensaio. Posteriormente, ao tratar as amostras com solução de hibridização por sonda, cubra a placa confortavelmente com papel alumínio para evitar a evaporação da solução. No segundo dia, carregue o tampão de hibridização reservado na placa de 24 poços e aqueça a placa até 60 graus Celsius.

Mais tarde naquele dia, para remover todos os vestígios de sonda e tampão de hibridização, lave as amostras duas vezes com 2x SSC por três minutos por lavagem. Em seguida, lave as amostras três vezes com 2x SSC por 20 minutos por lavagem a 60 graus Celsius. Em seguida, prepare o anticorpo primário no tampão de bloqueio.

Carregue 500 microlitros dessa mistura em cada poço. Após a etapa de bloqueio, incube em temperatura ambiente por cerca de quatro horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. No terceiro dia, execute a reação de cor em substrato cromogênico.

Cubra a placa de amostra com papel alumínio. E durante a reação, verifique periodicamente se há coloração excessiva com o microscópio de dissecação. No quarto dia, é importante incubar e branquear em uma caixa de luz, pois isso permite que qualquer pigmentação nas amostras ou coloração da solução de Bouin seja removida e aumenta o sinal da sonda para uma visualização clara.

Em seguida, após a lavagem com SSC, transfira cuidadosamente as amostras intestinais invertendo a cesta em uma nova placa de 24 poços. Enquanto estiver em poços, enxágue bem as cestas usando etanol 70%. Em seguida, preceda com imagens das amostras.

É fundamental estimar a qualidade das sondas de RNA antes de usá-las. As sondas podem ser verificadas em um gel de formaldeído. Se eles aparecem como faixas brilhantes e discretas, são de boa qualidade.

Ao colorir, alguma variação na distribuição é normal entre as réplicas biológicas, bem como entre os sete pares de divertículos de intestinos individuais. Portanto, é melhor corar pelo menos cinco tripas por condição para ter uma ideia do padrão médio de coloração. O sucesso geral é melhor medido comparando a coloração de amostras de sentido e antisentido para cada condição.

Ambos devem ser desenvolvidos pelo mesmo período de tempo. As amostras de sentido devem ter pouca ou nenhuma cor roxa, enquanto as amostras antisense devem exibir coloração robusta com fundo mínimo. Criticamente, os tecidos devem estar totalmente imersos na mancha para uma exposição uniforme.

É importante evitar o desenvolvimento excessivo da reação de cor. Isso pode resultar em uma grande quantidade de manchas de fundo, e as amostras de sentido podem começar a parecer amostras antisense. Outro fator que afeta os resultados é o quanto os carrapatos são alimentados de antemão.

Carrapatos que não são alimentados ou alimentados por apenas 24 horas são difíceis de trabalhar. Suas entranhas são mais facilmente danificadas e não mancham bem. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias e meio a três dias se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todos os suprimentos listados na tabela de reagentes e materiais prontos antes de iniciar seu experimento. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.