Name: Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprenda a mapear a atividade da lactato desidrogenase diretamente em amostras de tecido. Este protocolo permite detectar enzimas geradoras de NAD(P)H e analisar variações espaciais na atividade enzimática em biologia.

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HAC foi o estudioso Milton E. Cassel da Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabalho foi financiado por subsídios para HAC de nacional Instituto de médico geral Ciências R01 GM081686, R01 AR070245, Instituto Nacional de geral (médico de Ciências R01 GM0866465, o Eli e Edythe amplo centro de medicina regenerativa & investigação em células estaminais Rose Hills e Hal Gaba awards), centro de saúde/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, a sociedade de leucemia linfoma, impacto Iris Cantor feminino presenteia partir do Jonsson Comprehensive Cancer Center de WEL e HAC. Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de câncer do institutos nacionais da saúde sob prêmio número P50CA092131. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. HAC é um membro do Eli & Edythe amplo centro de medicina regenerativa & investigação em células estaminais, o Instituto de Biologia Molecular de UCLA e o programa interdepartamental de bioinformática da UCLA.

Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal a Universidade da Califórnia, Los Angeles.
1. gerar Slides de pele de rato congelado
<ol><li>Eutanásia em ratos, em conformidade com a política da instituição. Nota: Siga a política institucional para vestuário de protecção. Todos os protocolos que envolvam animais devem ser aprovados pelo Comitê institucional Animal conta.</li>
	<li>Remova o cabelo do rato com um aparador de pelos de animais.</li>
	<li>Faça incisões na pele com uma tesoura. Usando fórceps, levante a pele longe do mouse. Usando a tesoura, corte a seção da pele.</li>
	<li>Preencha o cryomold com o congelamento reagente composto (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Coloque a pinça de seções em cryomolds preenchido usando bico de pele. Oriente a pele para que fatias de tecido irão gerar uma secção transversal da pele da epiderme para a derme, hipoderme e músculo (Figura 2). Nota: se possível, montar experimental e controlar ratos juntos no mesmo cryomold para que possam ser seccionados a mesma lâmina e processados juntos. Tome cuidado para não criar bolhas.</li>
	<li>Coloque cryomold na superfície plana de um bloco de gelo seco em um balde de gelo e deixe congelar. Continue a observar a orientação da pele. Ajuste se necessário. Nota: Use criogênicas luvas ao manusear o gelo seco.</li>
	<li>Transferi o cryomolds em um freezer-80 ° C para armazenamento. As amostras podem ser mantidas no congelador por aproximadamente 3 meses sem perda significativa de atividade enzimática. Não deixe as seções congeladas dessecar.</li>
	<li>Usando um criostato a-20 ° C, pedaço de tecido para criar seções 7-10 µm de espessura para a melhor pele morfologia21.</li>
</ol>2. Preparar lâminas para coloração
<ol><li>Estabelece o conjunto de slides para ser testado. Incluem um slide de controle no qual NAD vai ser retido e outro controle slide no qual o substrato, lactato, vai ser retido. Incluem uma lâmina de controlo positivo de um bloco de tecido congelado anteriormente investigado.</li>
	<li>Brevemente corrigi slides contendo seções de pele com formol a 4% por 5 min por pipetagem 1 mL de formol a 4% para o slide, ou durante o processamento de vários slides, mergulhando de slides em um recipiente que contém formol a 4%. Nota: A fixação irá garantir que a pele não descasque fora das lâminas de durante os seguintes procedimentos e preservar a morfologia da pele. Cuidado: Formol é uma substância cancerígena e perigosos; usar luvas, não deixe que ele toque sua pele e execute esta etapa em uma coifa de química.</li>
	<li>Lave slides pelo menos 1 fosfato mL tampão salino, pH 7,4, por slide por pipetagem ou mergulhando.</li>
</ol>3. preparar a solução de coloração
<ol><li>Reagentes juntos de vórtice para coloração de atividade de lactato desidrogenase (pH de Tris 50mm 7.4, 750 µM NADP, 80 µM Fenazina methosulfate (PMS), cloreto de nitrotetrazolium azul 600 µM e lactato de 30 mM) em um tubo de tamanho apropriado dependendo da quantidade de coloração solução necessária. Nota: 1 mL é suficiente para cobrir completamente um slide.</li>
	<li>Prepare uma solução de segunda em que todos os reagentes estão presentes exceto NAD. Prepare uma solução de terceiros, em que todos os reagentes estão presentes exceto lactato.</li>
</ol>4. Incubar em solução de coloração
<ol><li>Suavemente a pipeta a coloração da solução ou soluções de controle sobre as guias preparadas cobrindo a seção em sua totalidade (1ml é suficiente para um slide). Se vários slides estão sendo processados juntos, mergulhar todos os slides na solução de coloração ao mesmo tempo (verifique se o recipiente tem a solução suficiente para cobrir completamente a secção de tecido).</li>
	<li>A incubar em um ambiente umidificado a 37 ° C, no escuro. Se a solução de coloração é em cima do slide, coloque o slide em um ambiente umidificado para evitar a evaporação.</li>
</ol>5. monitorar os Slides
<ol><li>Monitore a conversão da solução de coloração de clear para azul por inspeção visual. Quando as amostras atingiram o nível desejado de cor azul, pare a reação, removendo a coloração da solução. Nota: Para a pele, 10 minutos é suficiente. O tempo depende do órgão e a atividade enzimática.</li>
	<li>Enxágue slides com solução salina tamponada fosfato pipetando (1ml é suficiente para cada slide) ou mergulhando. Nota: a colheita de amostras que será comparada entre si deve ser mantida na coloração da solução para a mesma quantidade de tempo.</li>
</ol>6. counterstain e montar
<ol><li>Pipetar um corante de contraste para os slides quando as lâminas atingem um nível adequado de cor azul. Nota: Counterstains que por sua vez os núcleos vermelho ou verde fornecerá bom contraste com o azul criado pelo formazan precipitant.</li>
	<li>Montar com aquosa ou aquosos médio22de montagem. Uma a três gotas (40-50 µ l) de meio de montagem é suficiente, dependendo do tamanho da lamínula.</li>
</ol>7. imagem slides e quantificar
<ol><li>Slides de imagem sob um microscópio de luz. Tire fotografias de experimental e amostras de controle e todos os controles negativos em 10x, 20x e ampliação de 40 X.</li>
	<li>Determine a intensidade da mancha azul em diferentes regiões com software de análise de imagem.</li>
</ol>

<ol><li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells%2C+with+special+reference+to+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li>
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<li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li>
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</ol>

Os autores têm sem interesses concorrentes para divulgar.

O método descrito aqui pode ser usado para monitorar a atividade da lactato desidrogenase ou outras enzimas metabólicas que geram NADH ou NADPH, em diferentes tipos de células em um tecido ou dentro de diferentes partes de um tecido ao longo do tempo. Lactato desidrogenase é uma enzima importante para a compreensão da biologia das células-tronco e tumores, e a capacidade de monitorar a atividade da lactato desidrogenase em células individuais é susceptível de fornecer importantes insights sobre a função desta enzima....

Compreender os locais dentro de tecidos em que as enzimas têm alta ou baixa atividade é essencial para a fisiologia e desenvolvimento da compreensão. Níveis de transcrição ou proteína são frequentemente utilizados como substitutos para a atividade enzimática. Embora tais estudos podem ser informativos, eles não fornecem informações que podem ser críticas para determinar a atividade de uma enzima, tais como modificações borne-translational, a presença de complexos de proteínas, ou Localização subcellular da enzima. Quando a atividade enzimática é medida diretamente, é frequentemente monitorado em proteína homogeneizada lysates que já não contêm informações sobre células individuais dentro a mistura ou a distribuição espacial das células com alta ou baixa atividade dentro de um tecido.
Nós fornecemos aqui um protocolo detalhado para mapear a distribuição espacial da atividade enzimática dentro de uma amostra de tecido. A metodologia é baseada em estudos anteriores, demonstrando que os sais de tetrazólio podem ser usados para localizar a atividade de desidrogenases, redutases e oxidases em tecido congelado1. Com esses métodos, um formazan insolúvel em água é formado quando os prótons são transferidos para um tetrazólio sal2,3. Glicose-6-fosfato desidrogenase gera NADPH e um próton e foi detectada com actividade de tetrazólio. Glicose-6-fosfato desidrogenase tem sido monitorado em hepatócitos linguado Europeu4, em células alveolares tipo 2 dos pulmões5 e néfrons do rim5. Sais de tetrazólio também tem sido usados para monitorar atividade transketolase em tecido congelado6. Uma abordagem semelhante foi usada recentemente para monitorar a atividade de desidrogenases múltiplas no mesmo tecido adjacente slides7.
Descrevemos aqui um método para usar sais de tetrazólio para monitorar a distribuição espacial da atividade da lactato desidrogenase (Figura 1). Lactato desidrogenase pode converter piruvato gerado pela glicólise de lactato e a reação inversa. Atividade da lactato desidrogenase, consequentemente, é um determinante importante da entrada do piruvato no ciclo do ácido cítrico contra sua secreção como lactato. Níveis de lactato no sangue são frequentemente usados para diagnosticar uma variedade de doenças, incluindo câncer,8,9,10, porque ele pode sinalizar que doença ou lesão tem células danificadas e a enzima foi liberada.
Existem quatro genes de lactato desidrogenase: LDHA, LDHB, LDHC e LDHD11. LDHA e LDHB são pensados para ter surgido de duplicação de um início de gene LDHA12. LDH é ativo como um tetrâmero e LDHA e LDHB podem formar homotetramers e heterotetramers uns com os outros. LDHA é relatado para ter maior afinidade para o piruvato, enquanto LDHB é relatado para ter maior afinidade para lactato e preferencialmente converter lactato para piruvato13. O promotor LDHA contém sítios de ligação para o HIF1α, cMYC e FOXM1 fatores transcrição11. Além disso, como muitas outras enzimas glicolíticas14,15, LDH pode ser modificado por modificações borne-translational. Receptor 1 do fator de crescimento fibroblástico pode fosforilar LDHA em Y10, que promove a formação do tetrâmero, ou Y83, que promove o NADH substrato ligação16. LDHA também pode ser acetilado17. Por estas razões, uma compreensão completa da atividade LDH requer monitoramento não só os níveis de proteína LDH, mas atividade de enzima também.
O método que apresentamos aqui, além de outras abordagens têm sido utilizadas para monitorar a atividade da lactato desidrogenase. Atividade da lactato desidrogenase pode ser monitorada por espectrometria no lisado homogeneizada proteína. A geração de NADH como o lactato é convertido em piruvato pode ser medida com base na absorbância em 340 nm, enquanto o desaparecimento do NADH pode ser monitorado como o piruvato é convertido em lactato18. Atividade de lactato desidrogenase também tem sido monitorada com ressonância magnética (MRI). 13 C-piruvato pode ser administrada e a conversão de piruvato para lactato pode ser monitorizada como a razão de [1 -13C] lactato / [1 -13C] piruvato. Elevados índices de [1 -13C] lactato / [1 -13C] piruvato têm sido observadas no câncer de tecido19. Enquanto abordagens baseadas em MRI podem fornecer informações sobre a atividade da lactato desidrogenase no normal e doença os tecidos, as metodologias não têm a resolução necessária para determinar o nível de atividade em células específicas. A metodologia fornecida aqui pode fornecer informações sobre a atividade da lactato desidrogenase em áreas de tecido e até mesmo em células únicas.
Usando em situ ensaios de atividade, encontramos que a atividade da lactato desidrogenase é rica em células-tronco o folículo piloso da pele de rato20. Nós também usamos o método para monitorar a atividade da lactato desidrogenase em células-tronco embrionárias cultivadas e encontrou que a atividade é superior nas células-tronco da camada do alimentador. Finalmente, monitorado a atividade da lactato desidrogenase em aorta de rato fresco e observado a coloração em células musculares lisas. Descrevemos aqui um protocolo detalhado para monitorar a atividade da lactato desidrogenase em pele de rato congelado.

<table><tbody><tr><td>Instrumentos</td><td></td><td></td> cirúrgicos <td>Para coletar pele de camundongos eutanasiados</td></tr><tr><td>Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td>Para congelar pele</td></tr><tr><td>de camundongo Composto Tissue-Tek O.C.T. Fisher</td><td>Scientific</td><td>NC9638938</td><td>Para montagem de criomoldes</td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-106</td><td></td></tr><tr><td>Gelo seco</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corrediça de Adesão de Polisina</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-78</td><td></td></tr><tr><td>4% formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td>Diluído em água</td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato, pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vórtice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base Tris Fisher</td><td>Scientific</td><td>23-245-684</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Fenazina metossulfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de azul de nitrotetrazólio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>L-lactato de lítio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2250</td><td>Substrato</td></tr><tr><td>37&deg; C incubadora (ou incubadora de cultura de tecidos)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Braziliant! Contra-mancha</td><td>Anatech</td><td>861</td><td>Contra-mancha</td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas para lâminas</td><td>Microscópio</td><td></td> óptico Fisher Scientific 12-544D <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metabolismo de mapeamento: monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapeamento de atividade enzimática no espaço e no tempo é fundamental para o entendimento da base molecular do comportamento celular em tecido normal e doença. Ensaios de atividade metabólica in situ podem fornecer informações sobre a distribuição espacial da atividade metabólica dentro de um tecido. Nós fornecemos aqui um protocolo detalhado para monitorar a atividade da enzima lactato desidrogenase diretamente em amostras de tecido. Lactato desidrogenase é um determinante importante de se glicose consumida será convertido em energia via glicólise aeróbica ou anaeróbica. Uma solução contendo lactato e NAD é fornecida para uma secção de tecido congelado. Células com atividade alta lactato desidrogenase irão converter o fornecido lactato para piruvato, enquanto simultaneamente converter fornecido nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) para NADH e um próton, o que pode ser detectado com base na redução da nitrotetrazolium azul para formazan, que é visualizada como um precipitado azul. Descreveremos um protocolo detalhado para monitorar a atividade da lactato desidrogenase em pele de rato. Aplicação deste protocolo, encontramos que a atividade de lactato desidrogenase é alta em células-tronco a quiescente do folículo de cabelo dentro da pele. Aplicando o protocolo de células-tronco embrionárias cultivadas rato revelou maior coloração em células-tronco embrionárias cultivadas de fibroblastos embrionários de rato. Análise da aorta de rato recém isolado revelou coloração em células musculares lisas perpendicular à aorta. A metodologia fornecida pode ser usada para mapear espacialmente a atividade das enzimas que geram um próton em tecido congelado ou fresco.

Nós já relatado resultados para ensaios em situ de atividade em pele de rato20. Como mostrado na Figura 3, observou-se altos níveis de atividade da lactato desidrogenase em células-tronco no folículo piloso na base do folículo de cabelo quando os procedimentos descritos acima foram seguidos. Estas conclusões foram corroboradas pela célula de fluorescência ativada triagem de pele para pilhas de haste do folículo piloso e confir...

Descreveremos um protocolo para mapear a distribuição espacial da atividade enzimática por enzimas que geram nicotinatmide adenina dinucleótido fosfato (NAD(P)H) + H + diretamente em amostras de tecido.

Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia, como a atividade de enzimas em diferentes locais dentro dos tecidos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite ao pesquisador detectar atividade enzimática diretamente nas amostras de tecido. Para iniciar este procedimento, remova os pelos do mouse com um aparador de pêlos de animais.Faça uma incisão na pele das costas usando uma tesoura. Em seguida, levante a pele e corte-a. Em seguida, encha o Cryomold com composto reagente de congelamento.Usando uma pinça de ponta fina, coloque as seções de pele no criomolde do campo. Oriente as seções da pele de forma que a seção transversal da pele da epiderme à derme, hipoderme e músculo seja visível. Se possível, monte os camundongos experimentais e de controle juntos no mesmo criomolde, para que possam ser seccionados na mesma lâmina e processados juntos.Tome cuidado para não criar bolhas. Coloque o Cryomold sobre uma superfície plana de um bloco de gelo seco num balde de gelo. Para armazenamento, transfira o Cryomold para um freezer negativo de 80 graus Celsius.As amostras podem ser mantidas no freezer por aproximadamente três meses sem perda significativ

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve um ensaio colorimétrico para medição de lactato em lisados celulares usando a enzima lactato desidrogenase. Esta enzima converte lactato em piruvato, juntamente com a conversão de NAD em NADH que reage com corantes de tetrazólio e dá um produto colorido que pode ser medido espectrofotometricamente para quantificar o lactato.

Ensaio Colorimétrico para Quantificação de Lactato em Amostras de Teste

Este vídeo demonstra a lactato desidrogenase, ensaio de LDH para medir o efeito citotóxico de uma substância de teste e seu efeito na integridade da membrana em fatias de pulmão humanas de corte de precisão. O ensaio fornece uma medida quantitativa da morte ou dano celular na amostra.

Avaliação da citotoxicidade e integridade da membrana em fatias pulmonares por meio do ensaio de lactato desidrogenase

A polarização nuclear dinâmica com subsequente dissolução da amostra permitiu estudos em tempo real do metabolismo em sistemas biológicos. O piruvato de [1-13C]hiperpolarizado foi usado para estudar a atividade da lactato desidrogenase em uma linhagem celular de carcinoma de próstata in vitro.

hiperpolarizado 13 C Metabolic Espectroscopia de Ressonância Magnética e imagem

Aqui, apresentamos um protocolo que pode ser usado para microscopicamente Visualizar e quantificar a atividade de desidrogenases em células e tecidos e sua cinética, função e Localização subcellular.

Mapeamento metabólico: Citoquímica quantitativa enzimática e histoquímica para determinar a atividade de desidrogenases em células e tecidos

Aqui, é descrito um protocolo simples e bem validado para medir a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. O método baseia-se em quantificar a proporção de lactato desidrogenase (LDH) em frações de célula sedimentáveis em comparação com os níveis LDH totais do celulares.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Aqui, nós compartilhamos métodos de medição do consumo de oxigênio mitocondrial, um definição conceito de nutricional energética e vazamento de prótons, a principal causa de ineficiência na geração mitocondrial de ATP. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes para ajudar a avaliar a função mitocondrial.

Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Aqui apresentamos um protocolo para visualizar o transporte de monocarboxilatos, glicose e ATP em células gliais e neurônios usando sensores baseados em transferência de energia de ressonância de Förster codificados geneticamente em uma preparação cerebral ex-vivo de larvas de Drosophila .

Visualização de monocarboxilatos e outros metabólitos relevantes no cérebro de larvas ex vivo de Drosophila usando sensores codificados geneticamente

Aqui, descrevemos em detalhes métodos para extrair macrófagos da medula óssea, baço e coração infartado e, posteriormente, avaliar o fluxo metabólico em células vivas.

Análise do fluxo metabólico ex vivo em macrófagos esplênicos e cardíacos e monócitos da medula óssea

Este protocolo integra um sistema de biorreator personalizado com espectroscopia de RMN ¹³C hiperpolarizada para medir o metabolismo do piruvato em tempo real em células vivas, melhorando a reprodutibilidade e a precisão cinética para estudos metabólicos e aplicações de triagem de medicamentos.

Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada de 13C

Aprenda a mapear a atividade da lactato desidrogenase diretamente em amostras de tecido. Este protocolo permite detectar enzimas geradoras de NAD(P)H e analisar variações espaciais na atividade enzimática em biologia.

Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

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