Tintura de FM ciclismo a sinapse: comparando a despolarização de potássio alto, elétrica e Channelrhodopsin estimulação

O objetivo geral deste experimento é observar o ciclo de endo e exocitose de vesículas sinápticas na preparação viva da junção neuromuscular larval de Drosophila usando corantes FM fluorescentes. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como quais genes são críticos para a função do ciclo da vesícula sináptica? A principal vantagem dessa técnica é que você pode rastrear opticamente o ciclo de vesículas em uma preparação viva usando três tipos diferentes de estímulos, alta despolarização de potássio, estimulação elétrica ou usando optogenética.

A este procedimento, adicionar o anticorpo anti-HRP, conjugado a um lexoflor 647 à solução salina dissecante. Em seguida, adicione uma lamínula revestida de elastômero à câmara de dissecação e, em seguida, adicione a solução de dissecação com anticorpo HRP para marcar o terminal pré-sináptico NMJ durante a dissecção. Usando um pincel fino, transfira um terceiro ínstar errante do frasco de comida para uma tampa de vidro revestida de elastômero.

Em seguida, encha uma ponta de micropipeta de vidro com um pequeno volume de cola, usando pressão negativa de ar gerada pela boca. Em seguida, posicione as larvas, com o lado dorsal para cima, com uma pinça e cole a cabeça na lamínula revestida de elastômero com uma pequena gota de cola usando pressão de ar positiva pela boca. Repita este procedimento com a extremidade posterior das larvas, certificando-se de que o animal esteja esticado entre os dois acessórios de cola.

Usando uma tesoura, faça um corte horizontal de um milímetro no corte posterior e vertical ao longo da linha média dorsal. Em seguida, remova suavemente a traqueia dorsal, o intestino, o corpo gordo e outros órgãos internos, cobrindo a musculatura. Repita o procedimento de colagem para as quatro abas da parede do corpo, certificando-se de esticar suavemente o corpo horizontal e verticalmente.

Em seguida, levante o VNC e corte cuidadosamente os nervos motores com a tesoura e remova completamente o VNC. Substitua o soro fisiológico de dissecção por soro fisiológico livre de cálcio para interromper o ciclo de VS. Para estimulação elétrica, prepare uma pipeta de sucção usando o extrator de microeletrodo para obter a conicidade e o tamanho da ponta necessários.

Depois, polir a ponta do microeletrodo com uma micro forja para criar um ajuste firme ao sugar um único nervo motor. Deslize a pipeta de sucção no porta-eletrodo em um micromanipulador, que é conectado a um tubo de plástico longo e flexível e a uma seringa. Em seguida, coloque a preparação com corante FM no estágio do microscópio e levante o estágio até que as larvas e a pipeta de sucção estejam em foco.

Em seguida, aspire uma alça de nervo motor cortado, inervando o hemi segmento selecionado com pressão de ar negativa, gerada pela seringa no eletrodo de sucção. Posteriormente, estimule o nervo motor usando os parâmetros selecionados para conduzir a endocitose SV e a captação do corante FM 143. A etapa mais crítica neste ponto do procedimento é sugar um único axônio motor para o eletrodo de sucção com um ajuste apertado.

Isso pode levar algumas tentativas e erros. Assim que um eletrodo de sucção adequado for encontrado, use o mesmo para todas as condições que estão sendo comparadas para garantir uma tensão de estimulação consistente. Para a descarga do corante FM, sugue o mesmo nervo motor para o mesmo eletrodo e, em seguida, estimule o nervo motor a ativar a exocitose SV e a liberação do corante FM 143.

Para estimulação de canalrodopsina, conecte um LED azul a um estimulador programável usando um cabo coaxial e coloque o LED na porta da câmera. Focalize o feixe de luz LED azul na preparação com corante FM usando a função de zoom do microscópio. A etapa mais crítica no ponto do procedimento é garantir que as configurações de LED sejam mantidas constantes e que você ilumine a mesma parte de cada animal para todas as condições que estão sendo comparadas para garantir uma tensão de estimulação consistente.

Inicie a estimulação luminosa e acompanhe com o temporizador pela duração predeterminada do período de estimulação optogenética. Quando o cronômetro parar, remova rapidamente a solução de corante FM e substitua-a por solução salina sem cálcio para interromper o ciclo SV. Da descarga do corante FM, inicie a estimulação da luz e acompanhe com um temporizador para a duração predeterminada do período de estimulação optogenética.

Quando o período do temporizador terminar, remova rapidamente a solução de corante FM e coloque-a com solução salina livre de cálcio para interromper o ciclo SV. Para quantificar a imagem fluorescente, carregue-a na imagem J e crie uma projeção de intensidade máxima clicando em Image, Stacks, Zproject e, em seguida, usando o canal anti-HRP 647, vá para Image, Adjust, Threshold e deslize a barra de ferramentas superior até que apenas o NMJ seja destacado. Usando a ferramenta varinha, clique no NMJ.

Se o NMJ for descontínuo, segure o botão shift e selecione todas as peças. Em seguida, altere a imagem para o canal de corante FM 143 e vá para Analisar, Medir, para obter a medição de fluorescência. Repita essas etapas para a imagem descarregada do mesmo NMJ.

A fluorescente FM 143 pode ser fotoconvertida em um precipitado denso de elétrons DAB oxidado para visualização via TEM. Aqui está um diagrama esquemático do método de conversão de fotos para rotular a drosófila NMJ após o carregamento de corante FM 143 dependente da atividade. Esta é uma imagem MET representativa de um bouton sináptico de tipo selvagem em repouso, que mostra uma densa população de SVs de tamanho uniforme.

Essas imagens mostram os botões sinápticos que foram estimulados com alta despolarização salina de potássio por cinco minutos sem fotoconversão ou com fotoconversão FM 143. As estruturas homo finais em massa podem ser observadas aqui. E essas imagens mostram os botões sinápticos que foram estimulados eletricamente com o eletrodo de sucção nervosa a 20 hertz por cinco minutos sem fotoconversão ou com fotoconversão FM 143.

Observe que as vesículas carregadas de corante parecem muito mais escuras do que as vesículas adjacentes não carregadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma dissecção de cola larval, bem como o carregamento e descarregamento de corante FM usando alta despolarização de potássio, estimulação elétrica e estimulação optogenética de canalrodopsina. Desde que os corantes FM foram sintetizados pela primeira vez por Fei-Mao, esses corantes versáteis têm sido usados para estudar a mobilização dependente da atividade de pools de vesículas distintos para estudar a diferença entre a endocitose mediada por clatrina, bem como estudar atividades sinápticas evocadas, espontâneas e em miniatura.

Há muitos fatores a serem considerados ao longo deste experimento. Para citar alguns, a concentração externa de cálcio, o tipo de método de estimulação que você usa, bem como quanto tempo para carregar e descarregar o corante FM durante as etapas de captação e liberação. Por favor, leve esses fatores em consideração ao planejar seu próprio experimento.

Boa sorte!