Name: Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Isolation und Expansion von CD34+CD31+-Endothelzellen aus menschlichem Fettgewebe zur Adipogenese-Induktion. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Adipozyten-Differenzierung und Fettstoffwechsel.

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Die Autoren wollen Becky Marquez, der klinischen Koordinator am Sentara Bariatrisch Zentrum, für ihre Hilfe mit dem Prozess der Patient screening und Zustimmung bestätigen. Diese Forschung wurde durch R15HL114062, Anca D. Dobrian unterstützt.

Das institutionelle Review Board Committee an der Eastern Virginia Medical School genehmigte Forschung und Sammlung von menschlichen Fettgewebe Proben in der Studie verwendet. Informierter Zustimmung wurde von den Patienten gesammelt.
1. Vorbereitung der Puffer, Medien und Instrumente
<ol><li>Bereiten Sie eine Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered Lösung (KRBBS): 135 mM Natriumchlorid, Kaliumchlorid 5 mM, 1 mM-Magnesium-Sulfat, 0,4 mM Kalium Phosphat Diabas-, 5,5 mM Glukose, 1 mM Adenosin, 0,01 % Antibiotikum/antimykotische Mix (50 µg/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin, 30 µg/mL von Gentamicin, 15 ng/mL Amphotericin) und 10 mM HEPES (pH = 7,4). Diese Lösung wird jeweils für die Gewebe-Sammlung und die Verdauung frisch zubereitet.</li>
	<li>Bereiten Sie eine frische Kollagenase-Lösung: 1 mg/mL der Kollagenbildung, Typ 1, in KRBSS; machen Sie 3 mL/g Fett. Vorwärmen der Kollagenase-Lösung bei 37 ° C in einem Wasserbad vor der Gewebe-Verdauung.</li>
	<li>Bereiten Sie einen CD34 Zelle Isolation Puffer: 2 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 mM EDTA in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Bereiten Sie angereizte Medien: DMEM/F12, 5 % FBS, 50 µg/mL Penicillin/Streptomycin, 1,25 µL/mL von Humaninsulin (5 µg/mL oder 144 mU/mL) und 0,36 µL/mL von 2,8 mM Rosiglitazon (1 µM).</li>
	<li>Bereiten Sie eine 0,3 % Öl Rot O (ORO) Stammlösung (Gewicht/Volumen) durch Auflösen von 0,3 g Oro in 100 mL Isopropanol.</li>
</ol>2. adipösen Stromazellen vaskulären Bruchteil Isolation
Hinweis: Die Studie umfasste eine Cross-Sectional Kohorte von krankhaft übergewichtige Typ-2-Diabetiker (T2D) und nicht-diabetischen Themen, im Alter von 18 bis 65 Jahren, in der adipositaschirurgie am Sentara Metabolic und Gewicht-Verlust-OP-Zentrum (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Ausschlusskriterien enthalten eine autoimmune-Erkrankung Typ 1 Diabetes Mellitus, einschließlich der Bedingungen erfordern chronische immunsuppressive Therapie, entzündungshemmende Medikamente, Thiazolinendiones, aktiver Tabakkonsum, chronische oder akute Infektionen oder eine Geschichte der Bösartigkeit innerhalb der letzten 12 Monate behandelt. T2D wurde definiert als eine Fastende plasmaglukose von 126 mg/dL oder höher, ein Glukose von 200 mg/dL oder mehr nach eine 2 h-Glukose-Toleranz-test oder dem Einsatz von antidiabetischen Medikamente.
<ol><li>Sammeln Sie menschliche omentalis (OM) und subkutanem Fettgewebe (SC) (AT) von menschlichen Themen in der adipositaschirurgie.</li>
	<li>Halten Sie den OM und SC AT in separaten Ampullen mit Hank es gepufferte Salzlösung mit 50 µg/mL von Penicillin/Streptomycin bei Raumtemperatur unmittelbar nach Entnahme von Gewebe.</li>
	<li>Sorgfältig reinigen und Entfernen von fibrotische und eingebrannte Abschnitten des Gewebes mit 70 % Ethanol tupfte Scheren und Pinzetten, wenn die Probe im Labor nach der Extraktion des Gewebes kommt.</li>
	<li>Das Fettgewebe wiegen und It in 5 g (oder weniger) aliquoten für die Kollagenase Verdauung zu partitionieren.</li>
	<li>Hacken Sie fein 5 g des AT in 5 mL einer Kollagenase-Lösung in einem Funkeln Fläschchen bei Raumtemperatur, mit zwei Paar der Schere.</li>
	<li>Das Hackfleisch / Gewebe für insgesamt 15 mL eine zusätzliche 10 mL der Kollagenase-Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Die Proben für 1 h bei 37 ° C in einem Wasserbad mit kontinuierlichen schütteln zu verdauen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Spitze aus einer 20 mL Spritze zu einem stumpfen Ende.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Quadrat von 9 x 9 cm von einem Netz von 250 µm und schieben Sie es auf halbem Weg in ein 50 mL konische Röhrchen mit dem stumpfen Ende Spritze.</li>
	<li>Gießen Sie die Proben in die 20 mL Spritze mit stumpfen Ende und den Filter durch die 250 µm-Nylon-Netzgewebe in das 50 mL konische Röhrchen, Adipozyten und Stromazellen vaskuläre Zellen von unverdauten Gewebe zu trennen. Hinweis: Verwenden Sie mehr als 5 g AT pro 50 mL konische Rohr, nicht, wie das Netz durch überschüssige fibrotische unverdaute Material verstopft wird.</li>
	<li>Das Funkeln Fläschchen mit 10 mL KRBBS waschen Sie aus und Gießen Sie ihn durch den Filter verbleibenden Zellen gesammelt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die gefilterten Proben für 5 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um die Adipozyten zu schweben an der Oberseite des Rohres und einige der Stromazellen vaskulären Zellen sich auf der Unterseite des Rohres zu ermöglichen.</li>
	<li>Nutzen Sie eine 20 mL Spritze und ein 20 x 6 in pipettieren Nadel die Stromale vaskulären Bruch-Schicht zu entfernen und auf einem sauberen 50 mL konische Rohr übertragen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 mL KRBBS und lassen Sie die Proben zu sitzen auf der Bank für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.12 – 2.14 zweimal. Hinweis: Diese Schritte werden sichergestellt, dass keine der Stromazellen vaskulären Zellen mit der schwimmenden Adipozyten Verunreinigung.</li>
	<li>Halten Sie die Stromale vaskulären Brüche aus beiden Depots auf dem Eis für die Weiterverarbeitung, wie in den folgenden Schritten beschrieben. Hinweis: Lassen Sie die Zellen nicht auf Eis für mehr als 1 h, da dies auf die Zellviabilität auswirken kann. Die Adipozyten können in flüssigem Stickstoff für die Langzeitspeicherung Blitz eingefroren oder frisch für Experimente verwendet.</li>
</ol>3. Isolation von Fettgewebe Endothelzellen
<ol><li>Drehen Sie sich die Stromale vaskulären Brüche (SVF) mit 500 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie die Proben aus der Zentrifuge und der Überstand Gießen Sie vorsichtig ab; halten Sie die Tablette mit der SVF-Zellen.</li>
	<li>Sanft Aufschwemmen der Zelle Pellets in 5 mL PBS. Hinweis: Wenn mehr als 5 g eines AT-Depots in mehrere Aliquote verarbeitet wurde (siehe Punkt 2.4), bündeln Sie die Zelle Pellets zusammen.</li>
	<li>Drehen Sie die Proben bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen des Überstands, Aufschwemmen der Zellen in 1 mL PBS und die Zellen zu zählen. Hinweis: Hier wurde ein automatische Zelle Zähler für Zellzählung verwendet. Die Zellviabilität wurde durch eine Mischung von 12 µL Zellsuspension mit 12 µL einer Acridin Orange/Propidium Jodid (AO/PI) Lösung erzielt (siehe Tabelle der Materialien). Die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Gramm AT für jedes Depot ist: (a) OM-Depot: 1,69 x 105 ± 4,51 x 104; (b) SC-Depot: 1,24 x 105 ± 6,45 x 104. Die Lebensfähigkeit der Zellen von beiden Depots war > 90 %.</li>
	<li>Pellet-Proben bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C. Hinweis: Ein CD34 Immunomagnetic Auswahl Protokoll (siehe Tabelle der Materialien) wurde für Schritte 3,7 – 3.15 angepasst.</li>
	<li>Das Pellet in 100 µL CD34 Isolierung Puffer aufzuwirbeln. Hinweis: Die gesamte zellenzahlen erfordern die folgenden Resuspension Bände: (a) < 2 x 107 Zellen: Aufschwemmen das Pellet in 100 µL; (b) 2 x 108– 5 x 108 Zellen: das Pellet in 1 mL aufzuwirbeln. In Schritten 3,9 – 3.16, waren die Mengen der verwendeten Reagenzien für verkleinert < 2 x 107 Zellen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL CD34 cocktail und inkubieren Sie die Probe für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Fügen Sie 5 µL des magnetischen Beads und inkubieren Sie die Probe für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Jede Probe 2,5 mL CD34 Isolierung Puffer hinzu, und legen Sie die Proben in den Magneten für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Invertieren den Magnet für 5 s, aus der Isolation-Puffer zu gießen.</li>
	<li>Die Proben vom Magneten zu entfernen, und wiederholen Sie die Schritte 3.10 und 3.11 4 X.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schlauch vom Magneten und 2 mL CD34 Isolierung Puffer.</li>
	<li>Pellet-Zellen bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie der Zelle Pellets in 1 mL CD34 Isolierung Puffer und zählen Sie die Zellen zu. Hinweis: Hier ist die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Gramm AT: (a) OM-Depot: 4,75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC-Depot: 1,06 x 104 ± 9,53 x 103. Ein CD31 Kunststoff Immunobead-Protokoll wurde für Schritte 3.16 – 3,34 angepasst (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Pellet-Zellen bei 500 X g für 5 min und das Pellet in 250 µL Puffer B und 250 µL Waschpuffer aufzuwirbeln.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie gründlich CD31 Perlen durch aufschütteln der Röhre.</li>
	<li>Fügen Sie 20 µL CD31 Perlen. Hinweis: Aufgrund der Ergebniszelle zählt > 1 x 106, das Volumen war nach Vorgaben des Herstellers verkleinert.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe mit Schaukeln für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Legen Sie ein Sieb auf einen sterilen 50 mL konische Rohr. Hinweis: Die größere Öffnung des Siebes muss oben sein.</li>
	<li>Hinzugeben Sie vor der Zelle Trennung 1 mL Waschpuffer auf das Sieb equilibrate. Übernehmen Sie die Mischung unter Schritt 3.16 in das Sieb erzeugt.</li>
	<li>Waschen Sie das Sieb mit 5 mL Waschpuffer in einer kreisförmigen Bewegung für ein Gesamtvolumen von 20 mL. Legen Sie den Stecker auf einer sterilen 50 mL konische Rohr und schließen Sie den Luer-Lock.</li>
	<li>Legen Sie das Sieb auf den Stecker. Fügen Sie 1 mL Waschpuffer entlang der Mauer des Siebes. Fügen Sie 1 mL der aktivierten Puffer D entlang der Mauer des Siebes. Die Probe sanft Wirbeln und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL Waschpuffer. Die Perlen trennen Sie der Zellen durch pipettieren nach oben und unten 10 X. Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen erzeugen.</li>
	<li>Öffnen Sie das Luer-Lock und lassen Sie die freistehenden Zellen in der 50 mL konische Rohr fließen. Waschen Sie das Sieb 10 X mit 1 mL Waschpuffer jedes Mal.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Anschluss und Sieb und Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL komplette EGM-2 Medien für Kultur. Hinweis: Die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Gramm AT an dieser Stelle ist: (a) OM-Depot: 5,92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC-Depot: 4.12 x 103 ± 2,1 x 103. Die Lebensfähigkeit der Zellen von beiden Depots lag bei über 90 %.</li>
</ol>(4) Induktion von angereizte in isolierten Endothelzellen
<ol><li>Wachsen Sie die Zellen in Zellkultur behandelt 6-Well-Platten mit kompletten EGM-2 Medien in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator. Ersetzen Sie die Medien alle 3 – 4 Tage, bis die Zellen Zusammenfluss von 80 – 90 % erreichen. Hinweis: Die Verdoppelung der Bevölkerung ist zwischen 2 – 3 Tage.</li>
	<li>Erweitern Sie die Zellen durch Ausplattieren sie auf 100 mm Petrischalen und Teilen der Zellen 1:3 einmal. Zu diesem Zeitpunkt sind die Zellen auf Durchgang 2.</li>
	<li>Die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer automatischen Zelle entgegenzuwirken (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Ca. 100 – 200.000 Samenzellen in 6-Well-Platten, die doppelte Brunnen für jedes Depot und Kultur, die sie in völliger EGM-2 Medien für 2 Tage zu gewährleisten.</li>
	<li>Aus jedem Wachstumsmedien Aspirieren und ersetzen Sie es mit 2 mL DMEM/F12 mit 5 % FBS und 50 µg/mL von Penicillin/Streptomycin zur Bekämpfung Zellen und ersetzen Sie es mit 2 mL angereizte Medien (siehe Punkt 1.4) für die Behandlung der Zellen.</li>
	<li>Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 Inkubator für 13 Tage austauschen der jeweiligen Medien alle 3 bis 4 Tage. Hinweis: Zellen fangen an, nach 4 Tagen Behandlung Lipide ansammeln.</li>
	<li>Durchführung von ORO und Nil rote Färbung nach veröffentlichten Methoden15–17.</li>
	<li>Um Zellen für eine RNA-Extraktion zu isolieren, entfernen Sie das Medium aus dem 6-Well Induktionsplatten und waschen Sie ihn mit 1 mL sterile PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 350 µL einer Guanidium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Lösung (siehe Tabelle der Materialien), jeweils gut und bei 5 – 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Kratzen Sie die Zellen aus der Platte mit einem Schaber Zelle und übertragen Sie die Zellen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Hinweis: Die Proben können im RNA-Gewinnung und Weiterverarbeitung zu einem späteren Zeitpunkt-80 ° C Gefrierschrank gelagert werden.</li>
	<li>Die Proben unter Verwendung einer angepassten RNA-Extraktion mRNA entziehen (siehe Tabelle der Materialien)-Protokoll.</li>
	<li>Führen Sie eine Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Bewertung der Genexpression mit folgenden Sonden: Adiponectin, UCP-1, und CIDEA (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Hier, RT-PCR-Verfahren wurden durchgeführt mit den folgenden standard-Protokoll: Denaturierung (95 ° C; 15 s), Glühen und Erweiterung (60 ° C, 1 min) für 40 Zyklen. Die Proben, die Gene mit CT -Werte > 35 galten nicht nachweisbar.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Im Mittelpunkt dieses Papiers ist es, eine Methodik für die Isolierung, Expansion und adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelzellen von viszeralen und subkutanen Depots von menschlichen Fettgewebe zur Verfügung zu stellen.
Methoden sind berichtet worden, für die Isolierung von Endothelzellen aus verschiedenen vaskulären Betten von Nagetieren oder Menschen, bei denen in erster Linie Techniken mit CD31 Antikörper eindringmittel beschriftet oder gekoppelt mit magnetischen Beads<sup class=...

Aktuelle Belege dafür, dass sowohl beim Menschen als auch bei Mäusen eine Teilmenge von Zellen, die ihren Wohnsitz in das Fettgewebe Gefäßsystem in entweder weiß oder Beige/braunen Fettzellen1,2,3unterschieden werden kann. Der Phänotyp dieser Zellen ist ein Thema der Kontroverse, mit Nachweise für Endothelzellen, glatte Muskulatur/Pericyte oder ein Spektrum von intermediate Phänotypen4,5,6,7. Der Umfang der Ausarbeitung dieser Methode war, das adipogenen Potenzial von CD34 + CD31 + Endothelzellen aus verschiedenen Fettdepots von übergewichtigen Menschen isoliert zu testen. Andere Studien in der Literatur konzentrieren sich auf das Potenzial der gesamten Stromazellen vaskulären Fraktion oder der bekannten Adipocyte Stammväter2,8,9adipogenen. Da derzeit vorhandene Technologien speziell Fettgewebe Endothelzellen für Drug Delivery10ausrichten können, ist Verständnis das Potenzial solcher Zellen adipogenen unterziehen Induktion auf weißem oder beigem Adipozyten wichtig für zukünftige gezielte Therapien.
Verschiedene Gruppen berichteten die Kombination von CD31 und CD34-Marker als Surrogate, endotheliale Zellen aus menschlichen Fettgewebe11,12,13zu isolieren. In der Regel erfolgt die Isolierung mit zwei aufeinander folgenden Schritten und eine positive Selektion mit magnetischen Beads. In diesem Bericht wurde Immunoseparation mit CD34 + magnetische Beads mit Plastikperlen CD31 kombiniert eingesetzt. Wir fanden diese Technik besser als die sequentielle magnetische Immunoseparation in Bezug auf die Erhaltung der typischen Kopfsteinpflaster endotheliale Morphologie. Darüber hinaus konnten wir erzeugen genügend Zellen für die Expansion und adipogenen Induktion ab weniger als 1 – 2 g Fett benötigt. Eine kleine Probe-Biopsie des subkutanen Fettgewebes ist genug, um die benötigte Menge an Zellen für downstream-Anwendungen zu produzieren. Dieser Aspekt ist potentiell wichtig, insbesondere dann, wenn diese Methode für das Screening für eine Reaktion auf adipogenen Induktion an Probanden genutzt wird.
Im Gegensatz zu anderen Systemen, die in der Literatur beschrieben, nutzt diese Methode nur zwei Zutaten zur adipogenen Einarbeitung von CD34 + CD31 + Zellen: einem PPARγ-Agonisten — Rosiglitazon – und Humaninsulin. Wichtig ist, fällt die Menge an Insulin verwendet in Normal/Hochton des zirkulierenden post-absorptive Insulin in Menschen14. Der Grad der Ansprechbarkeit auf Insulin von den Zellen in Vitro, gemessen durch Phosphorylierung von Akt, korreliert nicht mit ihrer Fähigkeit zur Reaktion auf die Induktion cocktail. Interessanterweise mit diesem Induktion cocktail und experimentellen Bedingungen, eine Mischung aus weiß und Beige/braunen Zellen stammen wie von der Größe und Anzahl der intrazellulären Lipid Tröpfchen und den Ausdruck von molekularen Markern bestimmt. Dieses einfache und kostengünstige Induktion Protokoll zusammen mit der quantitativen Erfassung des Phänotyps der Responder Zellen (weiße vs. Beige) ermöglicht ein Screening der Agents, die potenziell das Gleichgewicht der differenzierten Beige verändern können : weiße Fettzellen.
Diese Methode bietet auch einen translationalen Ansatz für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der angereizte des vaskulären endothelialen Vorläuferzellen im menschlichen Fettgewebe. Mit dieser speziellen Isolierung/Differenzierung Technik können Ermittler Verhören verantwortlich für angereizte in eine Teilmenge der vaskulären endothelialen Zellen aus verschiedenen Fettdepots in schlanke und übergewichtige Menschen verschiedene Wege.

<table><tbody><tr><td> Großgeräte </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biosicherheitswerkbank </td><td> Nuaire </td><td> nu-425-400 </td><td></td></tr><tr><td> Zellkultur-Inkubator </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 800 DH </td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td> Forma Scientific </td><td> 2568 </td><td> Reziproker Shaker </td></tr><tr><td> RT-PCR-Gerät </td><td> BIO-RAD </td><td> CFX96-C1000 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrophorese-Box </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini PROTEAN 3 Zellen </td><td></td></tr><tr><td> Transblot-Box </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini Trans-Blot Cell </td><td></td></tr><tr><td> Elektrophorese-Netzteil </td><td> BIO-RAD </td><td> PowerPac Basic </td><td></td></tr><tr><td> ELISA Reader </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax M5 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Reader </td><td> LI-COR </td><td> Odyssey </td><td> Nahinfrarot </td></tr><tr><td> Kühlzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5810 R </td><td></td></tr><tr><td> Tischzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> MiniSpin Plus </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Olympus </td><td> BX50 </td><td></td></tr><tr><td> Inverses Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> TMS </td><td></td></tr><tr><td> KRBSS Buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEPES < </td><td> p>Research Products International </td><td> H75030 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 792519 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchlorid-Dihydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7902 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumphosphat monobasis </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 746398 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumphosphat monobasisches Monohydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> Kalium Chlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Acros Organics </td><td> 410950010 </td><td></td></tr><tr><td> Adenosin </td><td> Acros Organics </td><td> 164040250 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> GE Biowissenschaften im Gesundheitswesen </td><td> SH30574.02 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin/Streptomycin </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Digest </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 mL Spritze </td><td> Global Medical </td><td> 67-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Nylon Mesh, 250 & Mikro; m </td><td> Sefar </td><td> 03-250/50 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettiernadeln </td><td> Popper </td><td> 7934 </td><td></td></tr><tr><td> Feinschere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Gewebezange </td><td> George Tiemann & Co </td><td> 160-20 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenase, Typ I </td><td> Worthington Biochemical </td><td> LS004196 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischale, 100 mm </td><td> USA Scientific </td><td> 5666-4160 </td><td> TC behandelt</tr><tr><td> > Eppendorf Röhrchen, 1,5 mL </td><td> USA Scientific </td><td> 1615-5500 </td> <td></td></tr><tr><td>konische Röhrchen, 15 mL </td><td> Nest Scientific </td><td> 601052 </td><td></td></tr><tr><td> konische Röhrchen, 50 mL<td> > Nalgen </td><td> 3119-0050 </td><td></td></tr><tr><td> Szintillationsfläschchen </td><td> Kimble </td><td> 74505-20 </td><td> Tissue Dicing </td></tr><tr><td> Cell Isolation </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom </td><td> Auto 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer Slides </td><td> Nexcelom </td><td> CHT4-SD100-002 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer Viability Stain </td><td> Nexcelom </td><td> CS2-0106-5mL </td><td> Acridin Orange/Prop idium Jod </td></tr><tr><td> Anti-CD34 Magnetische Perlen </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18056 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD31 Kunststoffperlen </td><td> pluriSelect USA </td><td> 19-03100-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect 10x Waschpuffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00080-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Verbindungsring </td><td> pluriSelect USA </td><td> 41-50000-03 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Detachment Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00046-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Inkubationspuffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00060-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect S Zellsieb </td><td> pluriSelect USA </td><td> 43-50030-03 </td><td></td></tr><tr><td> Zellkultur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platten </td><td> USA Scientific </td><td> CC7682-7506 </td><td> TC behandelt</tr><tr><td> > 4- Objektträger mit guter Kammer </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 354559 </td><td> Fibronektin-beschichtet </td></tr><tr><td> 4-Well-Objektträger mit Kammer </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 154526PK </td><td> Unbeschichtetes Glas </td></tr><tr><td> Humane mikrovaskuläre Fettzellen (HAMVEC) </td><td> Sciencell Research Laboratories </td><td> 7200 </td><td> Primäre Zelllinie </td></tr><tr><td> Endotheliale Zellmedien (ECM) </td><td> ScienCell Research Laboratories </td><td> 1001 </td><td> Komplettes Kit </td></tr><tr><td> DMEM/F12 Basalmedien<td> > Thermo-Fisher Scientific </td><td> 11320082 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Rocky Mountain Biologicals </td><td> FBS-BBT </td><td></td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Lilly </td><td> U-100 </td><td> Humalog </td></tr><tr><td> Rosiglitazon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2408 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Analysis </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oil Red O Dye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td> Hergestellt in Isopropanol</tr><tr><td> > 96-Well-Platten </td><td> USA Scientific </td><td> 1837-9600 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-PCR-Platten </td><td> Genesee Scientific </td><td> 24-300 </td><td></td></tr><tr><td> RNA-Extraktion </td><td> Zymo Research </td><td> R2072 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> cDNA-Synthese </td><td> BIO-RAD </td><td> 1708841 </td><td> Supermix </td></tr><tr><td> JumpStart PCR-Polymerase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307-250UN </td><td> Warmstart, mit PCR-Puffer N </td></tr><tr><td> Magnesiumchloridlösung </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8787-5ML </td><td> 3 mM final in PCR-Reaktion </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan AdipoQ </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00605917_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan CIDEA </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00154455_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan RPL27 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs03044961_g1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan UCP1 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00222453_m1 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Assay </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> QPBCA-1KT </td><td> Kit </td></tr><tr><td> Bis-acrylamide </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610146 </td><td> 40%ige Stammlösung </td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfat </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610700 </td><td></td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BIO-RAD </td><td> <>1610800 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Glycin </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610718 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecalsulfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-100 </td><td></td></tr><tr><td> Bromphenol Blue </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Membrane </td><td> EMD Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-SK4 </td><td></td></tr><tr><td> Odyssey Blocking Buffer, Tris </td><td> LI-COR </td><td> 927-50000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-AKT-Antikörper </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 2920S </td><td> Maus monoklonal </td></tr><tr><td> Anti-pAKT-Antikörper </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 9271S </td><td> Kaninchen polyklonal </td></tr><tr><td> Anti-UCP1-Antikörper </td><td> Abcam<td> <> p>ab10983 </td><td> Kaninchen polyklonal </td></tr><tr><td> Anti-Maus-IgG-Antikörper </td><td> LI-COR </td><td> 926-68070 </td><td> polyklonale Ziege, IRDye 680RD </td></tr><tr><td> Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper </td><td> LI-COR </td><td> 926-32211 </td><td> <>p Ziegen-Polyklonal, IRDye 800CW </td></tr><tr><td> Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 111-025-003 </td><td> Ziegen-Polyklonal, TRITC </td></tr><tr><td> Phosphatpuffer Kochsalzlösung </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> 37%ige Formaldehydlösung </td><td> Elektronenmikroskopie </td><td> 15686 </td><td> 4%ige Lösung zur Zellfixierung</tr><tr><td> > Normales Ziegenserum </td><td> Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td> 10%ige Blockierungslösung </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td> 0..1 % Permeabilisierungslösung </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Calcein AM </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 65-0853-39 </td><td> Zellfluoreszenzvisualisierung </td></tr><tr><td> Matrigel Basalmembranmatrix </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 356231<td> > Wachstumsfaktor reduziert </td></tr><tr><td> DiI-markiert acetyliert LDL </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> L3484 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, expansion und adipogenen induktion von cd34 + cd31 + endothelial zellen aus menschlichen omentalis und subkutanem fettgewebe

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Adipositas wird begleitet von einer umfangreichen Umbau des Fettgewebes in erster Linie über Adipocyte Hypertrophie. Extreme Adipocyte Wachstum führt ein schlechtes ansprechen auf Insulin, lokale Hypoxie und Entzündungen. Durch die Stimulierung der Differenzierung der funktionalen weiße Fettzellen aus Vorläuferzellen, radikale Hypertrophie der Adipocyte Bevölkerung verhindert werden kann und infolgedessen die metabolische Gesundheit des Fettgewebes verbessert werden kann, sowie eine Reduzierung der die Entzündung. Auch kann durch die Stimulierung einer Differenzierung der Adipozyten Beige/braun, der Ganzkörper-Energieaufwand erhöht werden, was zu Gewichtsverlust. Dieser Ansatz könnte die Entwicklung von Fettleibigkeit Komorbiditäten wie Diabetes Typ 2 und Herz-Kreislauf-Erkrankungen verhindern.
Dieses Papier beschreibt die Isolation, Erweiterung und Differenzierung der weiße und Beige Adipozyten aus einer Teilmenge von menschlichen Fettgewebe Endothelzellen, die die CD31 und CD34-Marker Co Ausdrücken. Die Methode ist relativ billig und nicht arbeitsintensiv. Es erfordert Zugang zu menschlichen Fettgewebe und das subkutane Depot eignet sich für die Probenahme. Für dieses Protokoll frisches Fettgewebe Proben aus krankhaft übergewichtigen Probanden [Body-mass-Index (BMI) > 35] werden während der bariatrischen Chirurgie Verfahren gesammelt. Mit einem sequentiellen Immunoseparation von den Stromazellen vaskulären Bruch, sind genügend Zellen von weniger als 2 – 3 g Fett hergestellt. Diese Zellen in Kultur über 10 – 14 Tage erweitert werden können, können kryokonserviert werden und behalten ihre Eigenschaften adipogenen mit bis zu 5 – 6 Durchgang passagierung. Die Zellen werden für 14 Tage mit einer adipogenen cocktail mit einer Kombination von Humaninsulin und PPARγ-Agonisten-Rosiglitazon behandelt.
Diese Methode kann verwendet werden, für den Erhalt der Nachweis der Konzept-Experimente an molekularen Mechanismen, die adipogenen Antworten in Endothelzellen Fettzellen zu fahren, oder für das screening von neuer Medikamenten, die die adipogenen verbessern können Antwort geleitet, entweder in Richtung weiß oder Beige/braun Adipocyte Unterscheidung. Mit kleinen subkutanen Biopsien, kann diese Methode zur Bildschirm aus non-Responder Probanden für klinische Studien zielte darauf ab, Beige/braun und weiße Fettzellen für die Behandlung von Adipositas und Komorbiditäten zu stimulieren.

Unser Protokoll bezweckt eine in-vitro- Ansatz zur adipogenen Potenzial von CD34 + CD31 + vaskuläre Zellen aus verschiedenen Depots von menschlichen Fettgewebe zu bestimmen. Abbildung 1Azeigt ein vereinfachtes Flussdiagramm-Diagramm. Der erste Schritt durch eine positive Selektion von CD34 Ausdruck Zellen führt zu &gt; 95 % CD34 + Zellen in der Bevölkerung der frisch isolierten Zellen (Abbildung 1A). Wichtiger ist, ist d...

Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Adipositas zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung der Schlüsselfaktoren und Mechanismen, die eine robuste adipogene Reaktion während des Umbaus des Fettgewebes verhindern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung von CD34+CD31+Endothelzellen aus menschlichem Fettgewebe ermöglicht, beginnend mit kleinen Gewebemengen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmal, als wir Zellen im menschlichen Fettgefäßsystem identifizieren wollten, die auf adipogene Stimulation reagieren.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Zellisolierung aufgrund des oft begrenzten Zugangs zu frischem menschlichem Fettgewebe schwierig zu praktizieren sind. Entnahme von humanem, omentalem und subkutanem Fettgewebe von menschlichen Probanden, die sich einer bariatrischen Operation unterziehen. Unmittelbar nach der Gewebeextraktion ist das humane omentale und subkutane Fettgewebe in getrennten Durchstechflaschen aufzubewahren, die Hanks gepufferte Salzlösung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Penicillin-Streptomycin bei Raumtemperatur enthalten.Sobald die Prob

isolation-expansion-adipogenic-induction-cd34-cd31-endothelial-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von fluoreszenzmarkierten Stammzellen (ADSCs) aus Fettzellen (ADSCs) aus dem periaortalen Bogenfettgewebe von Mäusen. Nach der Isolierung werden die NCADSCs nachgewiesen, mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung sortiert und anschließend auf einer Platte kultiviert, wodurch die Zellproliferation gefördert wird.

Isolierung von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus periaortalem Fettgewebe der Maus

Die transkriptionelle Heterogenität innerhalb menschlicher Fettgewebe-abgeleiteter Stromazellen kann auf Einzelzellebene mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und osteogenen Genen definiert werden.  Wir beschreiben ein Protokoll, das die Durchflusszytometrie zur Isolierung von Zellsubpopulationen mit erhöhtem osteogenem Potenzial verwendet, das zur Verbesserung der kraniofazialen Skelettrekonstruktion verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Adipozyten-Progenitor-Zellen (APC) -Populationen aus perivaskulärem Adipositus (PVAT) mittels magnetisch-aktivierter Zellsortierung (MCS). Diese Methode ermöglicht eine erhöhte Isolierung von APC pro Gramm Fettgewebe im Vergleich zu Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS).

Expansion und Adipogenese Induktion von Adipozyten-Progenitoren aus perivaskulärem Fettgewebe, isoliert durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

Dieses Protokoll beschreibt den technischen Ansatz zur Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Depots aus weißem Fettgewebe (WAT) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder immunomagnetische Kügelchentrennung.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Wir präsentieren eine einfache Methode, um hochlebensfähige Fettvorläuferzellen von mausepididymalen Fettpolstern mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren.

Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben

Dieses Protokoll bietet eine effiziente Kollagenase-Verdauungsmethode für die Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktions-SVF-Zellen aus menschlichem viszeralem Fett in einem einzigen Prozess, einschließlich einer Methodik zur Gewinnung hochwertiger RNA aus Adipozyten und einer Phänotypisierung von SVF-Makrophagen durch Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die Analyse durch Durchflusszytometrie.

Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Dissektion von Maus-Fettdepots und zur Isolierung und Verdauung entsprechender Arterien, um die Endothelzellpopulation freizusetzen und dann zu identifizieren. Frisch isolierte Zellen, die in nachgeschalteten Anwendungen eingesetzt werden, werden das Verständnis der vaskulären Zellbiologie und der Mechanismen vaskulärer Dysfunktion voranbringen.

Isolierung und Identifizierung vaskulärer Endothelzellen aus unterschiedlichen Fettdepots für Downstream-Anwendungen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Fettgewebe aus Sprague-Dawley-Ratten.

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

In dieser Arbeit beschreiben wir die Isolierung, Kultivierung und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus, was die Untersuchung der perivaskulären Fettgewebsfunktion und ihrer Beziehung zu Gefäßzellen ermöglicht.

Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus

Das Fettgewebe ist eine ausgezeichnete Quelle für mesenchymale Stammzellen. Hier bringen wir die Schritt-für-Schritt-Extraktion, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe von Schweizer Mäusen an.

Isolierung, In-vitro-Expansion und Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen aus epididymalem Fettgewebe der Maus

Die Größe und Zerbrechlichkeit reifer Adipozyten haben die Techniken und Werkzeuge, die für ihre Untersuchung und Isolierung zur Verfügung stehen, eingeschränkt. Hier wird ein Protokoll für die Isolierung reifer muriner Adipozyten beschrieben, das leicht an verschiedene Fettdepots und Mausdiäten angepasst werden kann.

Isolierung und Kultivierung von primären murinen Adipozyten aus mageren und adipösen Mäusen

Erfahren Sie die Isolation und Expansion von CD34+CD31+-Endothelzellen aus menschlichem Fettgewebe zur Adipogenese-Induktion. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Adipozyten-Differenzierung und Fettstoffwechsel.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe (Video) | JoVE Journal

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

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