Name: Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a investigar a atividade de chaperonas durante o estresse oxidativo usando espectrometria de massa HDX-MS. Este método permite mapear mudanças conformacionais em Hsp33 e estudar dinâmicas estruturais de proteínas.

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Os autores são gratos a Meytal Radzinski para suas discussões úteis e crítica de leitura do artigo e Patrick Griffin e seus membros de laboratório para sua assistência ilimitada ao estabelecer a plataforma de análise HDX. Os autores agradecem a Fundação alemã-Israel (I-2332-1149.9/2012), a Fundação científica Binacional (2015056), a concessão de integração de Marie-Curie (618806), a Israel Science Foundation (1765/13 e 2629/16) e a ciência humana de fronteira Programa (CDA00064/2014) pelo apoio financeiro.

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste trabalho, nós fornecemos os protocolos para a análise da atividade de acompanhante redox-dependente e a caracterização das mudanças estruturais sobre a ligação de uma proteína do cliente. Estas são metodologias complementares para definir o potencial complexos de acompanhante-substrato e analisar possíveis sites de interação.
Aqui, nós aplicamos esses protocolos para a caracterização de um complexo entre o acompanhante regulamentadas redox Hsp33 com um substrato bem estudado acompanhante...

Células frequentemente encontram um acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidos como subprodutos da respiração1,2, proteínas e lipídios oxidação3,4e processos adicionais5, 6,7. Apesar de papel benéfico de ROS em diversos processos biológicos, tais como celular, sinalização8,9 e resposta imune10, um desequilíbrio entre a produção de ROS e sua desintoxicação pode ocorrer, líder de oxidativo estresse7. Os alvos biológicos de ROS são proteínas, lípidos e ácidos nucleicos, a oxidação do que afetam sua estrutura e função. Portanto, o acúmulo de oxidantes celulares está fortemente ligado a uma variada gama de patologias, incluindo câncer de9,11, inflamação12,13e envelhecimento14, 15e foram encontrados para ser envolvido no aparecimento e progressão das doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson e ALS doença16,17,18.
Proteínas recém sintetizadas e maduras são altamente sensíveis à oxidação devido as modificações potencialmente prejudiciais de suas cadeias laterais, que forma a proteína estrutura e função de19,20. Portanto, o estresse oxidativo geralmente leva a uma inativação da proteína generalizada, enrolamento e agregação, eventualmente levando a morte celular. Uma das estratégias para lidar com o dano potencial de oxidação da proteína celulares elegantes é utilizar a acompanhantes redox-dependente, que inibem a agregação da proteína generalizada, em vez de formar complexos estáveis com proteínas misfolded cliente21 ,22,23. Estes acompanhantes de primeira linha de defesa rapidamente são ativados por uma site-specific oxidação (normalmente em resíduos de cisteína) que converte-los em potente antiagregação de moléculas24. Desde que o estresse oxidativo resulta na inibição da respiração e em diminuições na ATP celular níveis25, canônicos acompanhantes ATP-dependente são menos eficazes durante estresse oxidativo condições25,26 ,27. Portanto, acompanhantes de ATP independente redox-ativado desempenham um papel vital na manutenção da homeostase de proteína sobre a acumulação de oxidantes em bactérias e eucariotas (por exemplo, Hsp3328 e RidA29 em bactérias, Get330 no fermento, peroxiredoxins31 em eucariontes). A atividade destes acompanhantes depende fortemente reversíveis mudanças conformacionais estruturais induzidas por uma site-specific oxidação que revela regiões hidrofóbicas envolvidos no reconhecimento de proteínas misfolded cliente.
Investigação do mecanismo de antie agregação os princípios que regem o reconhecimento das proteínas do cliente por acompanhantes não é fácil devido à natureza dinâmica e heterogêneo de acompanhante-substrato interações32,33, 34,35,36,37. No entanto, stress-regulado acompanhantes têm a oportunidade de avançar nossa compreensão da função de antidevido agregação à sua capacidade para: 1) obter de duas formas diferentes da dama de companhia, ativo (por exemplo, oxidado) e inativos (por exemplo, reduzido), com a introdução ou remoção de uma condição de estresse facilmente alternar entre eles (por exemplo, oxidante e agente redutor), 2) tem uma ampla gama de substratos, 3) formam complexos altamente estáveis com as proteínas de cliente que podem ser avaliadas por diferentes metodologias estruturais e 4) focar exclusivamente o reconhecimento do substrato e lançamento, mediada por mudanças conformacionais redox dependentes, como a maioria destes acompanhantes não tem a capacidade de dobramento.
Aqui, analisamos atividade antiagregação do acompanhante bacteriana redox-regulada do Hsp33, um componente vital do sistema de defesa bacteriana contra a proteína induzida por oxidação agregação28. Quando reduzida, Hsp33 é uma proteína ligadora de zinco firmemente dobrada com nenhuma atividade de acompanhante; no entanto, quando expostos a estresse oxidativo, Hsp33 sofre grandes mudanças conformacionais que expõem seu substrato vinculação regiões38,39. Após a oxidação, o íon de zinco que está fortemente ligado a quatro resíduos de cisteína altamente conservadas do domínio C-terminal é lançado40. Isso resulta na formação de ligações de bissulfeto dois, um desdobramento do domínio C-terminal e uma desestabilização do vinculador adjacente região41. Os C-terminal e vinculador regiões são altamente flexíveis e são definidas como intrinsecamente ou parcialmente desordenada. Após retornar às condições anti-stress, reduzidas as cisteínas e o acompanhante retorna ao seu estado nativo dobrado com nenhuma atividade antiagregação. O dobrar do acompanhante leva a um maior desdobramento e desestabilização da proteína do limite do cliente, que desencadeia a sua transferência para o sistema de acompanhante canônico, DnaK/J, por redobramento38. Análise de sites de interação do Hsp33 sugere que a Hsp33 usa ambos que sua carregada desordenada regiões, bem como as regiões hidrofóbicas no vinculador e domínio N-terminal para capturar misfolded proteínas do cliente e impede sua agregação38, 42. no estado dobrado, estas regiões estão escondidas pelo vinculador dobrado e domínio C-terminal. Curiosamente, a região de vinculador serve como um guardião dobrado e inativo do Hsp33 estado de, "sentindo" o status de dobramento de seu adjacente de domínio C-terminal34. Uma vez desestabilizado por mutagênese (seja por uma mutação de ponto ou de uma perturbação da sequência completa), Hsp33 é convertido para um acompanhante constitutivamente ativo independentemente o estado redox do seu redox sensíveis cisteínas43.
Os protocolos aqui apresentados permitem monitoramento de atividade de acompanhante redox dependentes do Hsp33, bem como mudanças conformacionais de mapeamento sobre a ativação e a ligação de proteínas do cliente. Esta metodologia pode ser adaptada para outros modelos de reconhecimento de acompanhante-cliente, bem como interações da proteína-proteína de não-acompanhante de investigação. Além disso, apresentamos os protocolos para a preparação de acompanhantes totalmente reduzidas e oxidadas que podem ser usados em estudos de outras proteínas redox-switch, para revelar as funções potenciais de oxidação de proteínas sobre a atividade da proteína.
Especificamente, nós descrevemos um procedimento para monitorar acompanhante atividade em vitro e definir sua especificidade de substrato sob diferentes tipos de agregação de proteínas (quimicamente ou termicamente induzido) usando espalhamento de luz (LS) medido por um fluorospectrometer44. Durante a agregação, luz espalhamento no 360 nm aumenta rapidamente devido a turbidez crescente. Assim, a agregação pode ser monitorada em uma maneira dependente do tempo neste comprimento de onda. LS é um método rápido e sensível para os testes de agregação de proteínas e, portanto, a atividade antiagregação de uma proteína de interesse usando nanomolar concentrações, permitindo a caracterização de parâmetros cinéticos relacionados a agregação da proteína sob diferentes condições. Além disso, o protocolo é descrito aqui não requer instrumentação cara e pode ser facilmente estabelecido em qualquer laboratório.
No entanto, é bastante desafiador para obter curvas cinéticas "limpo" e para derivar parâmetros cinéticos de uma proteína tal luz dispersando experiências, devido ao ruído e ao grande número de exceções geradas por bolhas de ar e grandes agregados. Para superar este obstáculo, apresentamos uma nova ferramenta gráfica, Kfits45, usado para reduzir os níveis de ruído em diferentes medidas cinéticas, especificamente equipados para dados cinéticos de agregação de proteínas. Este software fornece parâmetros cinéticos preliminares para uma avaliação inicial dos resultados e permite que o usuário para "limpar" grandes quantidades de dados rapidamente sem afetar suas propriedades cinéticas. Kfits é implementado em Python e disponível em open source em 45.
Uma das questões desafiadoras no campo diz respeito ao mapeamento de sites de interação entre acompanhantes e suas proteínas de cliente e compreensão como acompanhantes reconhecem uma ampla gama de substratos misfolded. Esta questão é ainda mais complicada quando estudar complexos de proteínas altamente dinâmico que envolvem intrinsecamente desordenado acompanhantes e substratos sujeitos a agregação. Felizmente, espectrometria de massa estrutural avançou dramaticamente na última década e forneceu com sucesso útil abordagens e ferramentas para analisar a plasticidade estrutural e mapear resíduos envolvidos no reconhecimento de proteínas46, 47 , 48 , 49. aqui, nós apresentamos uma tal técnica-hidrogênio-deutério troca espectrometria de massa (HDX-MS)-que permite o mapeamento das alterações no nível do resíduo em uma conformação estrutural sobre modificação de proteína ou proteína/ligante ligação35, 50,,51,52,53,54,55. HDX-MS usa o intercâmbio contínuo de hidrogênios espinha dorsal por deutério, a taxa que é afectada pelo ambiente químico, acessibilidade, e ligações covalentes e não-covalentes56. HDX-MS acompanha estes processos do exchange usando um solvente deuterado, comumente água pesada (D.2O) e permite a medição com base na mudança no peso molecular após o hidrogênio para troca de deutério. Taxas mais lentas de intercâmbio de hidrogênio-deutério podem resultar de hidrogênios participando de ligações de hidrogênio ou, simplesmente, de estérico, que indica alterações locais na estrutura57. Alterações em cima de uma ligação de ligante ou modificações borne-translational também podem levar a diferenças no ambiente de hidrogênio, com uma ligação, resultando em diferenças nas taxas de câmbio (HDX) o hidrogênio-deutério46,53.
Nós aplicamos esta tecnologia para as regiões 1) mapa Hsp33, que rapidamente se desdobrar em cima de oxidação, levando a ativação de Hsp33 e 2) definem a interface de ligação potencial de Hsp33 com seu substrato de misfolded completo, citrato sintase (CS)38.
Os métodos descritos neste manuscrito podem ser aplicados para estudar funções redox dependentes de proteínas em vitro, definindo atividade antiagregação e o papel das mudanças estruturais (se houver), em função da proteína. Essas metodologias podem ser facilmente adaptadas aos diversos sistemas biológicos e aplicadas no laboratório.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos Químicos, Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila HPLC mais</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998-2.5L</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Ácido fórmico Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>suplemento de solvente</td></tr><tr><td>Álcool isopropílico, grau HPLC</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P750717</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A456-212</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>tampão 252859</td><td></td></tr> ácido <tr><td>trifluoroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>76-05-1</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Água para HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>solvente</td></tr><tr><td>ZnCl2, cloreto de zinco</td><td>Merck</td><td>B0755416 308</td><td>reagente</td></tr><tr><td>DTT</td><td>goldbio</td><td>27565-41-9</td><td>agente redutor</td></tr><tr><td>PD mini armadilha G-25 colunas GE saúde GE saúde</td><td></td><td>29-9180-07</td><td>coluna de dessalinização</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio</td><td>Estados Unidos Biochemical Corporation</td><td>20274</td><td>tampão</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio 30%</td> <td>Merck</td><td>K46809910526</td><td>agente oxidante</td></tr><tr><td>citrato sintase</td><td>sigma aldrich</td><td>C3260</td><td>substrato</td></tr><tr><td>HEPES tampão livre de ácido</td><td>sigma aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Gndcl</td><td>sigma aldrich</td><td>G3272-500G</td><td>desnaturante</td></tr><tr><td>Solução de cloreto de deutério</td><td>sigma aldrich</td><td>543047-10G</td><td>tampão</td></tr> de <tr><td>óxido de deutério 99%</td> <td>sigma aldrich</td><td>151882-100G</td><td>solvente</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>bioworld</td><td>42000058-2</td><td>agente redutor</td></tr><tr><td>Micro-inserção de 150uL com interior de mandril e Pés de Polímero, 29*5mm</td><td>La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm</td><td>La-Pha-Pack -Thermo Fischer Cubeta de</td> quartzo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hellma 101-QS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco FP-8500 Fluoroespectrômetro</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer Comfort</td><td>Eppendorf</td><td>13058/0</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R, bancadaCentrífuga</td> Medidor de pH <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, PB-11 sartorius</td><td>Sartorius</td><td>13119/0</td><td></td></tr><tr><td>AffiPro Coluna de pepsina imobilizada (20 mm de comprimento, 2,0 mm de diâmetro).</td>Pré-coluna <td>AffiPro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &Aring;, 1,7um, 2,1 mm x 5 mm)</td><td>Coluna analítica Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 &, 1,7um, 2,1 mm x 50 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara anaeróbica de vinil com porta Airlock</td><td>Espectrômetro de massa COY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-exactive-orbitrap</td><td>Thermo-Fischer Sistema</td> PAL científico <td></td><td></td></tr><tr><td>LHX - sistema robótico para manuseio de amostras HDX</td><td>Sistema PAL</td><td>https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td><td></td></tr><tr><td>Dionex Ultimate 3000, bomba XRS</td><td>Bomba auxiliar Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dionex AXP-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software, Ferramentas de software, Pesquisa de banco de dados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kfits: Dados de agregação de ajuste</td><td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>software Thermo Scientific Xcalibur https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)</td><td>https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Chronos (Axel Semrau)</td><td>http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>software Proteome Discoverer V1.4</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td><td></td><td></td></tr><tr><td>software de bancada HDX</td><td>http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

definição da atividade de chaperona regulada por redox de hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Organismos vivos, regularmente, precisa lidar com ambientes de flutuação durante o seu ciclo de vida, incluindo mudanças de temperatura, pH, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio e muito mais. Estas flutuações podem levar a uma proteína ampla desdobramento, agregação e morte de células. Portanto, as células desenvolveram uma rede dinâmica e stress específico de chaperones moleculares, que mantêm um proteome "saudável" durante condições de estresse. Independente de ATP acompanhantes constituem uma classe principal de chaperones moleculares, que servem como moléculas de defesa de primeira linha, protegendo contra a agregação da proteína em uma maneira dependente do stress. Uma característica que destes acompanhantes têm em comum é sua capacidade de utilizar a plasticidade estrutural para sua ativação específicas de stress, reconhecimento e liberação do cliente misfolded.
Neste trabalho, focalizamos a análise estrutural e funcional de um tal acompanhante intrinsecamente desordenado, a Hsp33 bacteriana redox-regulado, que protege as proteínas contra agregação durante o estresse oxidativo. Aqui, nós apresentamos uma caixa de ferramentas de diversas técnicas para estudar a atividade de acompanhante redox-regulada, bem como para mapear mudanças conformacionais do acompanhante, subjacente a sua actividade. Especificamente, podemos descrever um fluxo de trabalho que inclui a preparação de proteínas totalmente reduzidas e totalmente oxidadas, seguido por uma análise do acompanhante atividade antiagregação em vitro usando espalhamento de luz, incidindo sobre o grau da atividade antiagregação e sua cinética. Para superar valores atípicos frequentes acumulados durante os ensaios de agregação, descrevemos o uso de Kfits, uma nova ferramenta gráfica que permite fácil processamento das medições de cinéticas. Esta ferramenta pode ser facilmente aplicada a outros tipos de medições cinéticas para remoção de outliers e ajuste de parâmetros cinéticos. Para correlacionar a função com a estrutura da proteína, descrevemos a configuração e fluxo de trabalho de uma técnica de espectrometria de massa estrutural, hidrogênio-deutério troca espectrometria de massa, que permite o mapeamento de mudanças conformacionais sobre o acompanhante e substrato durante diferentes estágios de atividade Hsp33. A mesma metodologia pode ser aplicada a outras interações da proteína-proteína e proteína-ligante.

Os dois métodos apresentados possibilitam acompanhar a atividade cinética e dinâmica de interações da proteína entre acompanhante e seu substrato. Além disso, o protocolo de redução-oxidação permite a preparação de um acompanhante totalmente reduzida e totalmente oxidado, dando uma compreensão mais profunda do mecanismo de ativação de redox dependentes desordenadas acompanhantes.
Primeiro, usamos o espalhamento de luz para exami...

Dentre as mais adversas condições de stress que organismos encontram durante seu ciclo de vida envolve o acúmulo de oxidantes. Durante o estresse oxidativo, células dependem fortemente de chaperones moleculares. Aqui, apresentamos os métodos usados para investigar redox-regulado antiatividade agregação, bem como para acompanhar mudanças estruturais que regulam a função de acompanhante usando HDX-MS.

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

O fluxo de trabalho apresentado aqui pode ajudar a ampliar nossa compreensão do papel celular das chaperonas durante condições de estresse oxidativo. Especificamente, pode ajudar a entender como as chaperonas impedem a agregação de proteínas durante as condições de desdobramento. Para essas duas costas, técnicas diferentes fornecem informações sobre a atividade de acompanhantes segregados por bandeiras.Também pode ser usado para estudar outras proteínas para interação, como interações sociais enzimáticas e dinâmica de proteínas. A demonstração visual desse método é fundamental, pois envolve o uso de diferentes instrumentos que podem ser desafiadores para novos usuários. Primeiro, gire uma amostra de proteína previamente descongelada para remover agregados.Em seguida, adicione cinco DTT milimolar e 20 cloreto de zinco micromolar e incube a amostra por pelo menos 1,5 horas a 37 graus Celsius. Para remover a TDT, equilibre uma coluna de dessalinização com tampão fosfato de potássio a 40 milimolares, enchendo a coluna completamente com o tampão e deixando-a escorrer. Usando uma pinça, empurre suavemente o filtro de disco branco na coluna e remova-o.Encher novamente a coluna com tampão fosfato de potássio e centrifugar a 1000 vezes G durante três minutos. Após a centrifugação, transfira a coluna para um tubo limpo e adicione a amostra de proteína lentamente ao meio da coluna. Centrifugar a coluna a 1000 vezes G durante dois minutos, de modo a que a proteína isenta de TDT fique no fluxo.Agora verifique a concentração da proteína e meça sua absorbância em 280 nanômetros. Distribuir metade das amostras de proteínas em alíquotas. Incubar as alíquotas em condições anaeróbicas durante 20 minutos para a remoção completa do oxigénio.Em seguida, sele os tubos com filme plástico e armazene as amostras em condições frias. Em seguida, adicione peróxido de hidrogênio de cinco milimolares recém-preparado à amostra de proteína restante e incube por três horas a 40 graus Celsius enquanto agita. Após a centrifugação, verifique a concentração de proteínas, divida as proteínas oxidadas em alíquotas e armazene-as em condições frias.Preparar o substrato desnaturado incubando 12 citrato sintase micromolar durante a noite em HEPES 40 milimolares e cloreto de guanidínio 4,5 molares. No dia seguinte, abra o software do fluoroespectrômetro e vá para a medição do curso do tempo. Defina a largura de banda de excitação para 2,5 nanômetros.O comprimento de onda de excitação para 360 nanômetros. O comprimento de onda de emissão para 360 nanômetros. A largura de banda de emissão para cinco nanômetros.E o intervalo de dados para 0,5 segundos. Defina a temperatura para 25 graus Celsius. Prepare a amostra adicionando 1600 microlitros de HEPES 40 milimolares a uma cubeta de quartzo.Insira a cubeta no suporte de amostra de um fluoroespectrômetro, permitindo que a amostra atinja a temperatura desejada. Depois de ajustar a agitação para 600 rpm, inicie a medição até que a linha de base seja estabelecida. Para medir a agregação da citrato sintase na ausência de um acompanhante, adicione 10 microlitros de citrato sintetase desnaturado, 120 segundos após a medição.Em seguida, continue a medição por 1200 segundos. Para medir a agregação da citrato sintase na presença de Hsp33, adicione Hsp33 60 segundos na medição. Após mais 60 segundos, adicione 10 microlitros de citrato sintetetase desnaturado e continue a medição por 1200 segundos.Em seguida, carregue o arquivo de dados para realizar a análise de dados e remoção de ruído pelo Kfits. Para remover qualquer ruído, escolha os parâmetros de análise, use o melhor modelo automático e selecione o ruído que está sempre acima do sinal. Remova manualmente os valores discrepantes óbvios usando as linhas ajustáveis verde e vermelha, que filtrarão os ruídos acima da linha verde e abaixo da linha vermelha.Em seguida, defina a linha de base e a curva de ajuste. Depois de aplicar o limite de ruído, baixe os dados processados. Prepare amostras complexas de substrato de proteína adicionando citrato sintetase a Hsp33 na proporção de 1 para 1,5 a 43 graus Celsius.Use pelo menos quatro etapas e incube as amostras por 15 minutos a 43 graus Celsius após cada adição para permitir a formação complexa. Centrifugar as amostras a 16000 vezes G a quatro graus Celsius durante 30 minutos para remover quaisquer agregados. Em seguida, coloque as amostras em inserções de vidro de 150 microlitros e transfira-as para frascos.Em seguida, coloque-os nas bandejas adequadas. Segure os buffers H e D a 25 graus Celsius e mantenha as amostras e o tampão de têmpera a zero a dois graus Celsius. Em seguida, ligue manualmente todas as unidades de resfriamento do espectrômetro de massa.Quando todos os sistemas de resfriamento atingirem suas temperaturas-alvo, ligue manualmente a HPLC e as bombas de carregamento. Abra o software que controla ambas as bombas, bem como o software que controla o espectrômetro de massa e certifique-se de que o MS esteja em espera. Em seguida, desconecte a válvula de saída de HPLC da fonte MS.Lave o sistema primeiro com uma solução de limpeza tripla. Em seguida, com o tampão B e, finalmente, com o tampão A.Em seguida, insira a coluna de pepsina no sistema. Depois de lavar o sistema com fluxo e pressão constantes, insira a válvula de saída de HPLC na fonte MS e ligue o MS.Agora abra o software. Crie uma sequência de execução e insira todos os pontos de tempo, nomes de amostra e locais nas bandejas, bem como os nomes e locais do buffer. Após a conclusão da execução, analise a cobertura peptídica da amostra executando as amostras de controle não deuteradas por meio do software.Transfira dados para o software HDX Workbench e analise os resultados usando o software. Salve os peptídeos selecionados e continue para análise da captação de deutério. A desnaturação química leva a uma rápida agregação de citrato sintetase induzida pelo redobramento de uma proteína totalmente desnaturada em condições tampão desfavoráveis.Por outro lado, a agregação induzida por calor resulta de um desdobramento relativamente lento do substrato dobrado nativamente. Em ambas as formas de desnaturação, a adição de Hsp33 oxidado aboliu completamente a agregação, reduzindo as leituras de 360 nanômetros a valores insignificantes. A presença de uma Hsp33 reduzida não teve efeito sobre a estabilidade da citrato sintetase e deu uma curva de agregação semelhante à detectada na ausência de um acompanhante.O padrão de deuteração entre a chaperona ligada e não ligada Hsp33 ao seu substrato citrato sintetase revela um local de interação do cliente dentro do domínio de comutação redox C-terminal da chaperona. A Hsp33 reduzida tem uma estrutura completamente ordenada, mas torna-se funcional quando detecta o estresse oxidativo. Enquanto a Hsp33 ligada e não ligada reduzida produz curvas peptídicas semelhantes, a Hsp33 oxidada mostra uma diferença de 30% de deuteração entre a chaperona ligada e não ligada, com áreas específicas da proteína ligada indicando um obstáculo alostérico.Uma vez estabelecido, o ensaio de espalhamento pode ser concluído em poucas horas, enquanto a metodologia DHEX pode ser concluída em dois a quatro dias, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante planejar com antecedência. Lembre-se de que a condição descrita, como temperatura, tempos de incubação e soluções tampão, é específica da proteína e deve ser otimizada para cada proteína.Seguindo este procedimento, outras metodologias, como reticulação ou precipitação, podem ser realizadas para complementar os estudos de interações de substratos de chaperonas. Em conclusão, esta técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia estrutural explorarem a plasticidade de proteínas em chaperonas moleculares.

defining-hsp33-s-redox-regulated-chaperone-activity-mapping

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Conformação da proteína e dinâmicas são a chave para a compreensão da relação entre estrutura e função de proteínas. Troca de hidrogênio acoplada a espectrometria de massa de alta resolução é um método versátil para estudar a dinâmica de conformação das proteínas, bem como a caracterização da proteína-ligante e interações proteína-proteína, incluindo interfaces de contato e efeitos alostéricos.

Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

Este estudo descreve técnicas biofísicas, bioquímicos e moleculares que caracterizam a actividade acompanhante de Escherichia coli HdeB sob condições de pH ácido. Estes métodos têm sido aplicados com sucesso para outras chaperonas ácido-protectores, tais como HdeA e pode ser modificado para funcionar com os outros acompanhantes e condições de stress.

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Aqui, apresentamos um protocolo para obter dados de três cores de smFRET e sua análise com um ensemble 3D Hidden Markov modelo. Com esta abordagem, cientistas podem extrair informações cinéticas de sistemas complexos proteína, incluindo cooperatividade ou interações correlacionadas.

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

As sintetizações lanthipeptide catalisam reações multistep durante a biossíntese de produtos naturais de peptídeos. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho contínuo, de baixo para cima, de espectrometria de massa de troca de hidrogênio -deutério (HDX-MS) que pode ser empregado para estudar a dinâmica conformacional das sintetizações de lanthipeptídeo, bem como outras enzimas semelhantes envolvidas na biossíntese de produtos naturais peptídeos.

Uma plataforma de espectrometria de massa de troca de hidrogênio (HDX-MS) para investigar enzimas biossintéticas de peptídeos

Apresentado aqui é um protocolo para uma abordagem de troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforese capilar (HDX), juntamente com espectrometria de massa de cima para baixo. Essa abordagem caracteriza a diferença nas estruturas de alta ordem entre diferentes espécies proteicas, incluindo proteínas em diferentes estados e diferentes proteoformes, conduzindo o diferencial simultâneo HDX e a separação eletroforética.

Troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforose capilar para caracterização conformacional de proteínas com espectrometria de massa de cima para baixo

O conjunto estrutural da alfa-sinucleína monomérica afeta sua função fisiológica e propriedades fisiológicas. O presente protocolo descreve como realizar espectrometria de massa de milissegundos de hidrogênio/deutério e análises subsequentes de dados para determinar informações conformais sobre o monômero dessa proteína intrinsecamente desordenada em condições fisiológicas.

Espectrometria de massa de hidrogênio/deutério-deutério para o estudo da dinâmica estrutural alfa-sinucleína sob condições fisiológicas

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a especificidade da protease no tecido cru rato extratos usando espectrometria de MALDI-TOF.

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Aprenda a investigar a atividade de chaperonas durante o estresse oxidativo usando espectrometria de massa HDX-MS. Este método permite mapear mudanças conformacionais em Hsp33 e estudar dinâmicas estruturais de proteínas.

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério (Vídeo) | JoVE Journal

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

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