Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

O fluxo de trabalho apresentado aqui pode ajudar a ampliar nossa compreensão do papel celular das chaperonas durante condições de estresse oxidativo. Especificamente, pode ajudar a entender como as chaperonas impedem a agregação de proteínas durante as condições de desdobramento. Para essas duas costas, técnicas diferentes fornecem informações sobre a atividade de acompanhantes segregados por bandeiras.

Também pode ser usado para estudar outras proteínas para interação, como interações sociais enzimáticas e dinâmica de proteínas. A demonstração visual desse método é fundamental, pois envolve o uso de diferentes instrumentos que podem ser desafiadores para novos usuários. Primeiro, gire uma amostra de proteína previamente descongelada para remover agregados.

Em seguida, adicione cinco DTT milimolar e 20 cloreto de zinco micromolar e incube a amostra por pelo menos 1,5 horas a 37 graus Celsius. Para remover a TDT, equilibre uma coluna de dessalinização com tampão fosfato de potássio a 40 milimolares, enchendo a coluna completamente com o tampão e deixando-a escorrer. Usando uma pinça, empurre suavemente o filtro de disco branco na coluna e remova-o.

Encher novamente a coluna com tampão fosfato de potássio e centrifugar a 1000 vezes G durante três minutos. Após a centrifugação, transfira a coluna para um tubo limpo e adicione a amostra de proteína lentamente ao meio da coluna. Centrifugar a coluna a 1000 vezes G durante dois minutos, de modo a que a proteína isenta de TDT fique no fluxo.

Agora verifique a concentração da proteína e meça sua absorbância em 280 nanômetros. Distribuir metade das amostras de proteínas em alíquotas. Incubar as alíquotas em condições anaeróbicas durante 20 minutos para a remoção completa do oxigénio.

Em seguida, sele os tubos com filme plástico e armazene as amostras em condições frias. Em seguida, adicione peróxido de hidrogênio de cinco milimolares recém-preparado à amostra de proteína restante e incube por três horas a 40 graus Celsius enquanto agita. Após a centrifugação, verifique a concentração de proteínas, divida as proteínas oxidadas em alíquotas e armazene-as em condições frias.

Preparar o substrato desnaturado incubando 12 citrato sintase micromolar durante a noite em HEPES 40 milimolares e cloreto de guanidínio 4,5 molares. No dia seguinte, abra o software do fluoroespectrômetro e vá para a medição do curso do tempo. Defina a largura de banda de excitação para 2,5 nanômetros.

O comprimento de onda de excitação para 360 nanômetros. O comprimento de onda de emissão para 360 nanômetros. A largura de banda de emissão para cinco nanômetros.

E o intervalo de dados para 0,5 segundos. Defina a temperatura para 25 graus Celsius. Prepare a amostra adicionando 1600 microlitros de HEPES 40 milimolares a uma cubeta de quartzo.

Insira a cubeta no suporte de amostra de um fluoroespectrômetro, permitindo que a amostra atinja a temperatura desejada. Depois de ajustar a agitação para 600 rpm, inicie a medição até que a linha de base seja estabelecida. Para medir a agregação da citrato sintase na ausência de um acompanhante, adicione 10 microlitros de citrato sintetase desnaturado, 120 segundos após a medição.

Em seguida, continue a medição por 1200 segundos. Para medir a agregação da citrato sintase na presença de Hsp33, adicione Hsp33 60 segundos na medição. Após mais 60 segundos, adicione 10 microlitros de citrato sintetetase desnaturado e continue a medição por 1200 segundos.

Em seguida, carregue o arquivo de dados para realizar a análise de dados e remoção de ruído pelo Kfits. Para remover qualquer ruído, escolha os parâmetros de análise, use o melhor modelo automático e selecione o ruído que está sempre acima do sinal. Remova manualmente os valores discrepantes óbvios usando as linhas ajustáveis verde e vermelha, que filtrarão os ruídos acima da linha verde e abaixo da linha vermelha.

Em seguida, defina a linha de base e a curva de ajuste. Depois de aplicar o limite de ruído, baixe os dados processados. Prepare amostras complexas de substrato de proteína adicionando citrato sintetase a Hsp33 na proporção de 1 para 1,5 a 43 graus Celsius.

Use pelo menos quatro etapas e incube as amostras por 15 minutos a 43 graus Celsius após cada adição para permitir a formação complexa. Centrifugar as amostras a 16000 vezes G a quatro graus Celsius durante 30 minutos para remover quaisquer agregados. Em seguida, coloque as amostras em inserções de vidro de 150 microlitros e transfira-as para frascos.

Em seguida, coloque-os nas bandejas adequadas. Segure os buffers H e D a 25 graus Celsius e mantenha as amostras e o tampão de têmpera a zero a dois graus Celsius. Em seguida, ligue manualmente todas as unidades de resfriamento do espectrômetro de massa.

Quando todos os sistemas de resfriamento atingirem suas temperaturas-alvo, ligue manualmente a HPLC e as bombas de carregamento. Abra o software que controla ambas as bombas, bem como o software que controla o espectrômetro de massa e certifique-se de que o MS esteja em espera. Em seguida, desconecte a válvula de saída de HPLC da fonte MS.

Lave o sistema primeiro com uma solução de limpeza tripla. Em seguida, com o tampão B e, finalmente, com o tampão A.Em seguida, insira a coluna de pepsina no sistema. Depois de lavar o sistema com fluxo e pressão constantes, insira a válvula de saída de HPLC na fonte MS e ligue o MS.

Agora abra o software. Crie uma sequência de execução e insira todos os pontos de tempo, nomes de amostra e locais nas bandejas, bem como os nomes e locais do buffer. Após a conclusão da execução, analise a cobertura peptídica da amostra executando as amostras de controle não deuteradas por meio do software.

Transfira dados para o software HDX Workbench e analise os resultados usando o software. Salve os peptídeos selecionados e continue para análise da captação de deutério. A desnaturação química leva a uma rápida agregação de citrato sintetase induzida pelo redobramento de uma proteína totalmente desnaturada em condições tampão desfavoráveis.

Por outro lado, a agregação induzida por calor resulta de um desdobramento relativamente lento do substrato dobrado nativamente. Em ambas as formas de desnaturação, a adição de Hsp33 oxidado aboliu completamente a agregação, reduzindo as leituras de 360 nanômetros a valores insignificantes. A presença de uma Hsp33 reduzida não teve efeito sobre a estabilidade da citrato sintetase e deu uma curva de agregação semelhante à detectada na ausência de um acompanhante.

O padrão de deuteração entre a chaperona ligada e não ligada Hsp33 ao seu substrato citrato sintetase revela um local de interação do cliente dentro do domínio de comutação redox C-terminal da chaperona. A Hsp33 reduzida tem uma estrutura completamente ordenada, mas torna-se funcional quando detecta o estresse oxidativo. Enquanto a Hsp33 ligada e não ligada reduzida produz curvas peptídicas semelhantes, a Hsp33 oxidada mostra uma diferença de 30% de deuteração entre a chaperona ligada e não ligada, com áreas específicas da proteína ligada indicando um obstáculo alostérico.

Uma vez estabelecido, o ensaio de espalhamento pode ser concluído em poucas horas, enquanto a metodologia DHEX pode ser concluída em dois a quatro dias, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante planejar com antecedência. Lembre-se de que a condição descrita, como temperatura, tempos de incubação e soluções tampão, é específica da proteína e deve ser otimizada para cada proteína.

Seguindo este procedimento, outras metodologias, como reticulação ou precipitação, podem ser realizadas para complementar os estudos de interações de substratos de chaperonas. Em conclusão, esta técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia estrutural explorarem a plasticidade de proteínas em chaperonas moleculares.