Em Situ Microscopia para determinação em tempo real da morfologia unicelular em bioprocessos

Esse método pode ajudar a responder a questões-chave da heterogeneidade populacional através da avaliação morfológica das células. A microscopia in situ permite estudar condições de cultivo, rendimentos de processos e qualidade do produto. A principal vantagem dessa técnica é uma medição in situ, que fornece dados em tempo real sem amostragem ou trazendo risco de contaminação.

A microscopia in situ acoplada ao reconhecimento automatizado de imagens pode fornecer informações adicionais sobre estruturas celulares, forma e aglomeração celular além do tamanho. Também é possível medir concentrações celulares. O método provou ser uma ferramenta confiável.

Nenhum método alternativo fornece as mesmas informações em tão pouco tempo e baixo esforço para a preparação da amostra. O método foi adaptado a vários bioprocessos e microrganismos, fungos filamentosos seg, micro-alergia e levedura. A sonda é usada em conjunto com um computador.

O hardware consiste em uma única sonda de haste com uma câmera CCD de alta resolução. As células que passam por uma lacuna de medição ajustável são imagens pela câmera. A luz entra na abertura em frente à câmera, o que significa que a iluminação é por transmissão.

Defina os parâmetros de hardware usando concentrações de células que abrangem o alcance esperado. Comece a fazer preparações para medições offline. Use um medidor de espessura para ajustar a lacuna de medição.

Em seguida, gire a porca do parafuso da sonda para definir a lacuna de medição para cinco ou dez vezes o diâmetro máximo esperado da célula. No computador, abra o software do controlador de sonda. No software, selecione a sonda desejada e vá para as ações de seção.

Em seguida, pressione Connect. Em seguida, vá para a guia Controle da sonda e abra-a. Inicie a transmissão de vídeo pressionando o botão de reprodução.

Corrija a sonda em um tripé e execute as seguintes etapas para cada medição. Trabalhe com a sonda e pulverize o etanol na abertura de medição. Limpe cuidadosamente qualquer poeira ou sujeira com papel óptico.

No computador, use a visão ao vivo para verificar se o vidro do sensor está livre de partículas. Em seguida, coloque um papel óptico seco na abertura de medição para o foco. Gire o parafuso de ligação para mover o foco manualmente.

Pare de se concentrar quando as fibras únicas do papel na lacuna de medição forem claramente vistas. Agora, pegue um tubo cheio de caldo de cultura. Mergulhe o microscópio no caldo, para que a lacuna esteja totalmente coberta com suspensão celular.

Use os parafusos de ligação para ajustar o foco nas células. Uma vez que este foco é feito, não alterá-lo novamente durante o experimento. Retorne ao software para o experimento.

Vá para o menu Triggering. No menu Acionamento, defina a taxa de quadros. Um hertz é recomendado para medições offline.

A partir daí, vá para o campo Frames Per Trigger e defina-o conforme necessário para boas estatísticas. Aqui, cerca de 200. Além disso, vá para o menu Geral.

Lá, selecione o diretório em que as imagens serão salvas. Inicie a aquisição de imagens com o botão Iniciar Imagem Trigger Acquisition Acquisition. Mova suavemente o tubo para induzir o fluxo na abertura de medição.

Use as imagens da primeira execução do experimento como um conjunto de treinamento. Tenha o software de código aberto Fiji pronto e solte as imagens do experimento em sua janela. Quando terminar, selecione Analisar, seguido por Ferramentas, depois ROI Manager.

Em seguida, escolha uma ferramenta de seleção. Na imagem, decida sobre uma partícula para anotar que está em foco. Desenhe um círculo em torno dele com a ferramenta de seleção.

Pressione Adicionar para adicionar a anotação ao gerenciador de ROI. Em seguida, selecione uma ferramenta de escova e escolha um tamanho de pixel apropriado. Use a ferramenta de escova para refinar a seleção.

Continue marcando todos os objetos de interesse da mesma forma em cerca de 15 imagens. Salve os arquivos anotados e use-os como um conjunto de treinamento. Quando o algoritmo de reconhecimento estiver treinado e pronto, use-o para visualizar resultados.

No Analisador de Resultados, vá para Arquivo, seguido de Arquivo de Importação. Lá, selecione o arquivo de resultados desejado. Continue pressionando o botão Criar gráfico.

Selecione o gráfico de distribuição. Isso mostrará a distribuição morfológica da cultura. Retorne ao Gráfico de Criação para selecionar o Plot de Sensibilidade.

As informações exibidas podem ajudar a determinar quantas células devem ser analisadas para obter a precisão desejada. Realize medições on-line após concluir medições offline. Para medições on-line, conecte a sonda diretamente a um bioreator.

Uma vez conectado, esterilize corretamente o conjunto. Selecione Monitoramento no painel. Há um botão de reprodução para iniciar a aquisição de imagens e um botão stop para termetá-lo.

Pressione o botão de reprodução. No bioreator, inicie a inoculação da cultura. A câmera capturará o vídeo das células e as identificará automaticamente para análise.

O monitoramento fornece dados on-line de tamanhos celulares e formas de diferentes morfologias celulares durante toda a fermentação. Os resultados em tempo real podem ser formatados de várias formas e também exportados para análise suplementar. Este enredo de distribuições cumulativas do diâmetro da célula S.Cerevisiae é criado a partir de dados analisados utilizando essa técnica.

Ele demonstra que o reconhecimento automático de células é capaz de distinguir células brotantes e não brotantes. A curva sólida é a distribuição durante um cultivo de três horas. A curva pontilhada é a distribuição do mesmo cultivo em sete horas.

A curva tracejada representa dados coletados às 13 horas. O procedimento de anotação é demorado, mas é a chave para alcançar a precisão desejada para a identificação celular. Com este procedimento, se os tempos de medição forem menores do que a dinâmica do processo, a medição em tempo real poderá ser usada para o controle de processos.

Essa técnica abre caminho para o uso da medição da heterogeneidade populacional como parâmetro de processo para cultivos microbianos desde as primeiras etapas de desenvolvimento de processos até a escala de produção.