Name: Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a analisar padrões de splicing alternativo de pré-mRNA em seções de cérebro de camundongo usando hibridização in situ com sondas de junção de exons. Este método sensível permite detectar isoformas específicas com amplificação de sinal.

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Este trabalho foi apoiado pela associação americana do coração [subsídio 0365274B para H.L.], National Cancer Institute [P50CA150964 GI SPORE para Z.W.], National Institutes of Health [escritório de pesquisa infra-estrutura compartilhada instrumentação Grant S10RR031845 para a microscopia de luz imagem facilidade na Case Western Reserve University] e China Scholarship Conselho [X.G.]. Os autores graças a Richard Lee do núcleo de Imaging de microscopia de luz por sua ajuda com a digitalização de slides.

Todos os experimentos descritos aqui que envolvem ratos foram aprovados pelo Comitê de utilização e caso Western Reserve University institucional Cuidado Animal. O título do protocolo de 2016-0068 (PI: Hua Lou) é "Papel de alternativo pre-mRNA emendar no desenvolvimento de vertebrados".
Nota: Informações de todos os equipamentos, reagentes e suprimentos utilizados neste protocolo são incluídas na Tabela de materiais.
1. prepare a formalina parafina fixa incorporado (FFPE) seções
<ol><li>
Eutanásia em 1 CD1 de rato e 1 rato C57BL/6J por deslocamento cervical. Cuidadosamente corte o crânio com uma tesoura cirúrgica e fórceps. Remova o cérebro com uma colher. Nota: 5 meses CD1 masculinos ratos e camundongos machos de 3 meses C57BL/6J foram utilizados e mostraram resultados semelhantes.<ol>
<li>Lave o cérebro com PBS. Consertar o cérebro com uma solução de formol a 10% em temperatura ambiente (RT) para 30 h colocando o cérebro todo em 50 mL da solução de formalina.</li>
		<li>Alterar a solução de fixação para PBS e incubar o cérebro em PBS durante a noite a 4 ° C. Desidratar e incorporar o cérebro com xileno e parafina usando os procedimentos padrão de18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Use um micrótomo para corte de tecido incorporado em 5 seções µm. Ponha a fita de parafina em banho maria RT primeiro e depois em um banho de água de 45 ° C para espalhar a faixa de opções.
	<ol>
<li>Quando as rugas e dobras na fita desaparecerem, imediatamente monte seções em lâminas de vidro. Ar secos slides durante a noite em slides RT. leve ao forno por 1h a 60 ° C antes do uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pré-tratamento da amostra
<ol><li>
Deparaffinize cortes de tecido. Execute estas etapas em uma coifa.
	<ol>
<li>Preencha dois lavar pratos (figura 1A) com 250 mL de xileno fresco e dois com 250 mL de etanol a 100%. Inserir slides de tecido em um rack de lavagem (figura 1A) e coloc a lavagem da cremalheira em lavar pratos seguindo a ordem e incubação tempo indicado na tabela 1.</li>
		<li>Durante cada incubação, levante o cesto de lavagem acima e para baixo mais de 3 vezes no lavar prato. Após cada incubação, mover-se rapidamente a cremalheira de lavagem para o prato seguinte de lavagem para impedir os cortes histologicos desseque.</li>
		<li>Depois de concluir as etapas de incubação, retire o cesto de lavagem com slides do lavar prato. Coloque o Carré numa incubadora de 60 ° C por 5 min ou até que as lâminas estejam completamente secas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desenhe uma 0,75 '' x 0,75 '' barreira em torno da seção de tecido com uma caneta de barreira hidrofóbica. Ar seco a barreira por 3 min em RT</li>
	<li>
Fatias de pré-tratamento
	<ol>
<li>Preparar reagentes e equipamentos<ol>
<li>Acender o forno de hibridização (figura 1B) e definir a temperatura a 40 ° C 30 min antes de usar.</li>
			<li>Molhe o papel de humidificação (Figura 1E) com água destilada completamente e colocá-lo na bandeja de controle de umidade (Figura 1, à esquerda). Manter a bandeja de controle de umidade no forno da hibridação.</li>
			<li>Prepare a 700 mL de 1x fresco alvo recuperação de reagentes, acrescentando 630 mL de dH2O a 70 mL de 10 x alvo recuperação de reagentes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aplica o peróxido de hidrogênio.<ol>
<li>Coloque os slides deparaffinized no banco. Adicione 5-8 gotas de peróxido de hidrogênio a uma seção para cobrir totalmente o tecido. Incubar durante 10 minutos a RT.</li>
			<li>Toque os slides em um pedaço de papel absorvente para remover a solução de peróxido de hidrogênio, um slide de cada vez. Imediatamente inserir o slide em um rack de lavagem e mover o cesto para um prato de lavar roupa cheio de dH2O.</li>
			<li>Lave os slides, movendo o rack acima e para baixo em água destilada por 3 a 5 vezes. Tirar a grade de lavagem para um prato de lavagem cheio de água destilada fresca e slides de lavagem mais uma vez.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Executar recuperação de alvo<ol>
<li>Coloque um copo de vidro de 1.000 mL em uma chapa quente. Adicione 700 mL de 1x fresco alvo recuperação de reagentes para o copo e cubra com papel alumínio. Inserir um termômetro na medida através da cobertura da folha (Figura 1). Ligar a chapa e coloque em alta por 10-15 min.</li>
			<li>Quando a temperatura dos reagentes de recuperação atinge 98 ° C, passar o controle de temperatura da placa quente de alta para baixa para manter uma fervura suave. Não ferva mais de 15 min.</li>
			<li>Enquanto isso, cuidadosamente Abra o papel alumínio e coloque a grelha de lavagem com fatias dentro o regente de recuperação. Cobrir o copo novamente e incube por 15 min.</li>
			<li>Uso de fórceps para retirar o suporte do copo para um prato de lavagem preenchido com 200 mL de dH2O e enxaguar por 15 s.</li>
			<li>Mover o cesto para um prato de lavagem contendo 100% de etanol fresco e deixe descansar por 3 min. remover slides e secá-las em uma incubadora de 60 ° C por 10 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aplicar a Protease III<ol>
<li>Coloque os slides na prateleira a mancha (Figura 1, direito). Adicione 5 gotas de Protease III para cobrir o tecido. Cuidadosamente coloque a grelha na bandeja de controle de umidade (Figura 1, à esquerda) e insira a bandeja do forno de hibridização de 40 ° C. Incube durante 30 min.</li>
			<li>Retire as lâminas e volte a colocar o tabuleiro no forno. Toque os slides para remover o excesso de líquido, um slide de cada vez. Inserir o slide em um rack de lavagem e o rack em um prato de lavar roupa cheio de dH2O. Move o rack de cima e para baixo para lavar os slides para 3 - 5 vezes.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ISH ensaio
<ol><li>
Preparar materiais
	<ol>
<li>Pré-aquecer 50 x tampão de lavagem em uma incubadora de 40 ° C por 20 min. Mix 2,94 L de dH2O e 60 mL de 50 x tampão de lavagem tornar 1x tampão de lavagem.</li>
		<li>Prepare a solução de coloração de hematoxilina 50% adicionando-se 100 mL de hematoxilina de Gill, eu a 100 mL de dH2água de amônia de 0,02% (p/v) Prepare O. adicionando 1,43 mL de 1 N de hidróxido de amônio a 250 mL de dH2O. Mix bem em um recipiente.</li>
		<li>Colocar as sondas e AMP 0 – 6 reagentes RT 30 min antes de usar. Manter a bandeja de controle de umidade em forno de hibridização a 40 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimento ISH Nota: Para examinar a expressão da Nf1 isoformas de emenda e calcular a porcentagem emendada em valor (PSI) para exon 23a, três diferentes sondas ISH que destino exon 23a-incluído isoform, exon 23a-excluídos isoform ou ambas as isoformas são usados (Figura 2 ). As sondas são usadas na Adjacent corte cortes histologicos. Para garantir a precisão do cálculo, é fundamental que os três cortes histologicos são tratados exatamente o mesmo nas etapas de deteção de hibridização e amplificação de sinal.<ol>
<li>Teste de hibridização.<ol>
<li>Retire o cesto de lavagem os slides e toque o líquido em excesso das lâminas de. Coloque os slides no rack mancha.</li>
			<li>Use um lápis para rotular as lâminas com o nome de sonda. Coloca os três slides de tecido de cérebro Adjacent corte para ser hibridizado com três diferentes sondas de Nf1 (Figura 2) juntos. Realize as etapas subsequentes na mesma ordem dos slides.</li>
			<li>Adicione 4 gotas de sonda para cobrir o tecido. Fazer um slide de cada vez para evitar que as seções de secar. Coloque o Carré de mancha na bandeja do controle de umidade e inseri-lo no forno 40 ° C por 2 h.</li>
			<li>Lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem. Para cada lavagem, encher o prato de coloração com 200 mL de tampão de lavagem 1x e coloque um rack de lavagem nele. Toque o excesso de líquido em um slide de um papel toalha por vez e rapidamente, inseri-lo dentro do rack de lavagem. Mover as lâminas acima e para baixo no prato para 3 a 5 vezes por 2 min em RT</li>
			<li>Para a segunda lavagem, use o tampão de lavagem fresca.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplificação de sinal.<ol>
<li>Toque o tampão de lavagem em excesso das lâminas de... e colocá-los na prateleira de mancha. Adicione 4 gotas de AMP 0 para cobrir o tecido. Coloque o Carré de mancha na bandeja do controle de umidade e inseri-lo no forno por 30 min a 40 ° C.</li>
			<li>Lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem como descrito acima.</li>
			<li>Repita este passo com AMP 1 – 6, seguindo a ordem e a condição da tabela 2. Lave as lâminas duas vezes depois de cada passo de hibridização.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Detecção do sinal<ol>
<li>Toque o tampão de lavagem em excesso das lâminas de... e colocá-los em rack de mancha. Adicionar 2 µ l de Fast Red B a 120 µ l de Fast Red (proporção de 1: 60) em um tubo de microcentrifugadora. Misture bem e adicione para cobrir totalmente a seção de tecido. Nota: O volume total de vermelho A / B mix baseia-se no número e tamanho das secções de tecido. Para uma área de 0,75 '' x 0,75 '', 120 µ l é suficiente para uma seção. Use a mistura dentro de 5 min e evitar a exposição da mistura à luz solar direta ou luz UV.</li>
			<li>Feche a bandeja e incubar durante 10 minutos a RT. Remove a solução para um contentor de resíduos e imediatamente inserir os slides em um rack de lavar e coloque o Carré em um prato de lavagem cheio de água da torneira. Lave novamente com água fresca da torneira.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Counterstaining dos slides
	<ol>
<li>Retire o cesto de lavagem da água da torneira e rapidamente toque em papel absorvente para remover a água extra. Colocar o cesto em uma hematoxilina de 50%, solução de coloração e imediatamente tirar a grade acima e para baixo várias vezes. Incubar por 2 min em RT.</li>
		<li>Transferi o porta-lâminas volta para o prato de água da torneira. Lave 3 – 5 vezes movendo o rack acima e para baixo e trocando a água fresca da torneira até os slides tornam-se claras, enquanto os tecidos do cérebro permanecem roxos.</li>
		<li>Mova o cesto para um prato contendo água de amônia de 0,02%. Tirar a grade acima e para baixo 2 – 3 vezes até que os tecidos ficam azuis. Lave os slides 3 a 5 vezes com água fresca da torneira em um prato de coloração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem das amostras
	<ol>
<li>Mover o porta-lâminas do prato coloração para uma incubadora de 60 ° C e incubar durante pelo menos 15 min, até que as lâminas estejam completamente secas.</li>
		<li>Coloque 40 µ l de meio de montagem no slide e cuidadosamente coloque uma lamínula 24 x 50 mm sobre a seção de tecido. Ar secos slides durante 30 min à RT</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. análise e coleta de dados
Nota: Use um scanner de slides para digitalizar as imagens na ampliação de X 40.
<ol><li>
Controles positivos e negativos
	<ol>
<li>Para cada experimento, incluem controles positivos e negativos (Figura 3). Como um bom controle positivo, o sinal deve ser visível como punctate pontos na ampliação de 20-40 X.</li>
		<li>Uso do Mouse (Mm) - PPIB - 1ZZ como controle positivo. Esta sonda alveja um gene de limpeza comum PPIB. Para controle negativo, um ponto para cada 20 células exibindo coloração por campo de microscópio X 20 de fundo é aceitável.</li>
		<li>Use a sonda DapB-1ZZ como controlo negativo. Esta sonda dapB o gene bacteriano como alvo. Estas sondas de controle têm sido utilizadas em muitos ensaios ISH19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detecção do sinal e a análise de como os padrões de expressão de Nf1 exon 23a
	<ol>
<li>Como os sinais de hibridação são indicados como pontos punctate, conte os pontos manualmente. O número de pontos está correlacionado com o nível de transcrições que é detectado por uma ponta de prova específica. Observe que o número de pontos também pode ser analisado pelo software ImageJ ou SpotStudio.</li>
		<li>Use três sondas para cruzar a exon 23a-contendo, exon 23a-faltando isoformas ou transcrições de Nf1 totais (Figura 2). Como as três sondas não podem ser usadas simultaneamente, use três seções do tecido cerebral adjacente para cruzar para cada sonda.<ol>
<li>Para calcular o % emendados em (PSI) para exon 23a, conte o número de células e pontos em várias regiões do cérebro. Para cada região de interesse, conte mais de 400 células de várias sub-regiões, conforme indicado na Figura 4.</li>
			<li>Colete dados de sub-regiões mesmas para cada uma das três sondas. Calcular o PSI como o número de pontos por celular com a sonda de inclusão exon 23a / (número de pontos por celular com a sonda de inclusão exon 23a + número de ponto por célula com o exon23a saltando de sonda) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A presente comunicação relata o uso de BaseScope RNA ISH para examinar como os padrões de expressão nas seções de cérebro de rato. Está demonstrado que essa junção exon de anti-sentido-exon sondas menor do que 50 nucleótidos podem direcionar exon inclusão e saltando isoformas robusta e especificamente. Além disso, os sinais resultantes podem ser usados para calcular PSI de um exon alternativo.
Algumas variações foram testadas no procedimento. Por exemplo, seções de tecido congelado geradas sec...

Splicing alternativa (AS) é um processo comum que ocorre durante a maturação de pre-mRNA. Neste processo, um exon diferencialmente pode ser incluído no mRNA maduro. Assim, AS, através de um gene pode gerar muitos mRNAs esse código para produtos diferentes da proteína. Estima-se que os 92 – 94% dos genes humanos sofrem alternativas emenda1,2. Alternativa anormal, padrões de emenda resultou de mutações genéticas têm sido associadas a um grande número de doenças, incluindo câncer,3,4, distrofia miotônica e esclerose lateral amiotrófica. Assim, é crucial investigar e entender melhor os mecanismos reguladores splicing alternativos na tentativa de encontrar novos tratamentos de doenças humanas.
COMO muitas vezes é regulada de forma de tipo específico de célula. É importante determinar o padrão de expressão de AS de um gene específico em um determinado sistema biológico. No entanto, isso se torna complicado quando um órgão complexo que contém muitos tipos diferentes de células, tais como o cérebro ou no coração, é estudado. Neste caso, a escolha ideal do sistema de ensaio é RNA em situ hibridação (ISH) usando tecido seções para que o padrão de expressão de AS de um gene específico pode ser detectado em muitos tipos de células simultaneamente. Com efeito, sondas específicas do exon têm sido utilizadas para avaliar os níveis de expressão de uma alternativa exon5,6,7. No entanto, essa abordagem não é adequada para análise do padrão pelas seguintes razões. Em primeiro lugar, convencionais métodos ISH geralmente usam sondas mais de 300 bp, enquanto o tamanho médio dos vertebrados exões internos (não primeiro ou último exon) é 170 nucleotídeos8,9. Em segundo lugar, quando uma sonda exon-específico é usada para examinar o padrão de emenda de um exon alternativo interno, a única isoforma de mRNA detectada pela sonda é aquele que contém o exon, enquanto a isoforma de mRNA sem o exon não pode ser detectado. Assim, o cálculo por cento emendados em valor (PSI) para o exon alternativo é complicado. Além disso, ISH fluorescente convencional muitas vezes combina ISH com imunocoloração, que reduz a eficiência de deteção e robustez. Por exemplo, em um estudo que investigou a induzida por estresse, Emendando isoform comutação da acetilcolinesterase (AChE) mRNA, Digoxigenina foi incorporada a sonda ISH e detectado usando anticorpo anti-Digoxigenina. Alternativamente, biotina-rotulado sonda foi detectada por um fosfatase alcalina/estreptavidina conjugado e um substrato para a fosfatase alcalina10. Nenhum método usa qualquer estratégia de amplificação para aumentar a sensibilidade da deteção. Como resultado, é difícil detectar as transcrições de mRNA que são expressos em níveis baixos. Assim, é necessário um sistema de ensaio ISH mais simples e mais robusto para analisar como expressão padrões em situ.
BaseScope foi recentemente desenvolvido com base na plataforma de RNAscope, uma bem estabelecida e amplamente utilizado o sistema de ensaio ISH. Ambos os sistemas de ensaio utilizam uma tecnologia de amplificação de destino específico que aumenta a sensibilidade da deteção11,12. O que distingue um do outro é o comprimento da sequência de destino, que é tão curto quanto 50 nucleótidos para BaseScope e 300 – 1.000 nucleotídeos para RNAscope. Assim, é possível a concepção sondas junções exon-exon para detectar alternativa específica do mRNA isoformas de destino. No estudo atual, foi estabelecido um procedimento para examinar como testes padrões da expressão de neurofibromatose tipo 1 (Nf1) exon 23a, um exon alternativo extensivamente estudado no mesmo laboratório13,14,15 , 16 , 17, nas seções de cérebro de rato. Os resultados demonstram que o BaseScope é um sistema ideal para estudar os padrões de expressão de Nf1 exon 23a in situ. Como este sistema de ensaio pode ser adaptado para analisar como padrões de expressão de muitos exões alternativos, representa uma nova ferramenta poderosa nos estudos de AS.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de Controle de Umidade (com tampa)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td> Advanced <td>Cell</td><td>Diagnostics 310017</td><td></td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de Propósito Geral Imperial III</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de Lâminas</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de pré-tratamento</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td> Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td> Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Diagnóstico Avançado de Células</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Diagnóstico Avançado de Células</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Diagnóstico Avançado</td><td>de Células 2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Diagnóstico Avançado de Células</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Diagnóstico Avançado de Células</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Rápido RED-A</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Rápido RED-B</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Tampão de Lavagem</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de Controle Negativo - Mouse DapB-1ZZ</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de Controle Positivo - Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Controle slide-mouse 3T3 pellet celular</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Outros suprimentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidifying Paper</td> Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Washing</td> Rack <td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Washing Dishes American</td><td>Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de Vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Vidro, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol (EtOH)</td> <td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>solução de formalde</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Montagem Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>173942</td><td></td> <td>Científica Fisher</td></tr></tbody></table>

análise quantitativa de alternativo pre-mrna emendar nas seções de cérebro de rato usando o rna in situ da hibridação do ensaio

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Splicing alternativa (AS) ocorre em mais de 90% dos genes humanos. O padrão de expressão de um exon alternativamente emendado frequentemente é regulado de forma de tipo específico de célula. COMO expressão de padrões normalmente são analisados por RT-PCR e RNA-seq usar amostras do RNA isolado de uma população de células. Em situ exame de como os padrões de expressão para uma particular estrutura biológica pode ser realizada por RNA em situ da hibridação (ISH) usando sondas específicas do exon. No entanto, este uso particular do ISH tem sido limitado porque exões alternativos geralmente são muito curtos para projetar sondas específicas do exon. Neste relatório, o uso de BaseScope, uma tecnologia desenvolvida recentemente que emprega oligonucleotides antisentidos curtos no RNA ISH, é descrito para analisar como padrões de expressão nas seções de cérebro de rato. Exon 23a de neurofibromatose tipo 1 (Nf1) é usado como um exemplo para ilustrar que curto exon-exon junction sondas exibem sinais de hibridização robusto com alta especificidade na análise de RNA ISH em seções de cérebro de rato. Mais importante, sinais detectados com sondas de inclusão e saltando-específicas do exon podem ser usados para confiantemente, calcular a porcentagem emendada em valores de Nf1 exon 23a expressão em diferentes áreas anatômicas de um cérebro de rato. O protocolo experimental e o método de cálculo para análise são apresentados. Os resultados indicam que o BaseScope oferece uma nova ferramenta poderosa para avaliar como expressão padrões em situ.

BaseScope ISH foi realizado utilizando três estirpes de rato: CD1 selvagem tipo ratos, C57BL/6J selvagem tipo ratos e ratos mutantes de Nf123aIN/23aIN em background C57BL/6J, em qual exon 23a está incluído em todos os tipos de células como resultado de engenharia local da tala mutações de14,15.
Como primeiro passo, o sistema de ensaio ISH foi testado...

É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do splicing alternativo de pré-mRNA. Especificamente, ele fornece um sistema de ensaio robusto e sensível para examinar padrões alternativos de emenda in situ em fatias de tecido. Com este método, o splicing alternativo pode ser analisado simultaneamente em muitos subtipos que estão contidos em estruturas biológicas complexas, como o cérebro de um camundongo.A principal vantagem dessa técnica é que ela usa sondas de junção de exon antiestáticas de choque em hibridização in situ de mRNA para produzir sinais de hibridização específicos da isoforma. A tecnologia de amplificação de sinal de construção aumenta a sensibilidade da detecção para fornecer sinais de hibridização robustos. Os sinais detectados foram a inclusão de éxons escapando de sondas específicas que são usadas para calcular a porcentagem de emenda nos sinais vitais em diferentes áreas anatômicas do cérebro de um camundongo.Neste estudo, o éxon 23a da NF1 é usado como exemplo para ilustrar o uso do sistema de ensaio. No entanto, o sistema pode ser adaptado para padrões de expressão de análise de muitos éxons alternativos. Para iniciar a parafinização da seção D do cérebro do camundongo, encha dois pratos de lavagem com 250 mililitros de xileno.E outros dois com 250 mililitros de etanol 100% dentro de uma hotte. Insira as lâminas de tecido em um escorredor de lavagem. Em seguida, coloque o rack de lavagem em um prato contendo xileno e incube por cinco minutos enquanto move o rack para cima e para baixo pelo menos três vezes e repita com o segundo prato de xileno.Em seguida, coloque o rack em um recipiente contendo etanol e incube por dois minutos com os mesmos movimentos para cima e para baixo e repita com o segundo prato de etanol. Para secar as lâminas, mova a prateleira da segunda placa de etanol e coloque-a dentro de uma incubadora a 60 graus Celsius por cinco minutos. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar uma barreira de 0,75 polegada por 0,75 polegada ao redor da seção de tecido e seque ao ar por três minutos em temperatura ambiente.Ligue o forno de hibridização e ajuste a temperatura para 40 graus Celsius. Depois de umedecer completamente o papel umidificador com água destilada, coloque-o em uma bandeja de controle de umidade. Em seguida, insira a bandeja de controle de umidade no forno de hibridização.Depois de colocar as lâminas secas em uma bancada, cubra completamente as seções de tecido em cada lâmina com cinco a oito gotas de solução de peróxido de hidrogênio. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Bata as lâminas em um papel absorvente, uma de cada vez, para remover a solução de peróxido de hidrogênio e insira as lâminas em um escorredor de lavagem.Mergulhe o rack em uma travessa contendo água enquanto o move para cima e para baixo de três a cinco vezes para lavar as lâminas. Encha um copo de vidro de um litro colocado em uma placa quente com 700 mililitros de tratamento de remoção de alvo 1X e cubra-o com papel alumínio. Insira um termômetro na tampa de alumínio e ligue a placa de aquecimento, colocada em temperatura alta por 10 a 15 minutos.Quando a temperatura do reagente de recuperação atingir 98 graus Celsius, coloque a placa de aquecimento em temperatura baixa para manter uma condição de ebulição suave. Em seguida, remova cuidadosamente o papel alumínio e coloque o rack dentro do copo. Cobrir o copo com papel alumínio e incubar durante 15 minutos.Use uma pinça para transferir a prateleira do copo para uma travessa contendo 200 mililitros de água destilada e incube por 15 segundos. Após 15 segundos, coloque a grelha em uma assadeira contendo 100% de etanol e incube por três minutos. Retire a grelha do prato e seque a 60 graus Celsius por 10 minutos.Depois de colocar as lâminas em um suporte para manchas, cubra as seções de tecido com cinco gotas de protease 3 por lâmina. Coloque cuidadosamente o rack na bandeja de controle de umidade e insira a bandeja no forno de hibridização e incube a 40 graus Celsius por 30 minutos. Depois de remover o rack da bandeja, bata nas lâminas para remover o excesso de líquido e insira-as em um rack de lavagem.Coloque o rack em uma travessa contendo água destilada e mova o rack para cima e para baixo de três a cinco vezes para lavar as lâminas. Para se preparar para a hibridização in situ, incube as sondas e os reagentes AMP em temperatura ambiente por 30 minutos. Insira a bandeja de controle de umidade no forno de hibridização e ajuste a 40 graus Celsius.Para hibridização de sonda, remova as lâminas do rack de lavagem e bata nelas para remover o excesso de líquido. Coloque as lâminas em um suporte para manchas. Use um lápis para rotular as lâminas com o nome da sonda.Coloque três lâminas de tecido cerebral cortadas adjacentemente para serem hibridizadas com três sondas diferentes de mitose de fibra neural tipo um juntas. Como existem sondas específicas de isoforma muito diferentes, uso seções de tecido cortadas adjacentes. É fundamental que essas seções sejam tratadas exatamente da mesma forma nas etapas de hibridização, amplificação e detecção de sinal para garantir a precisão da emenda percentual no cálculo.Cubra as seções de tecido com quatro gotas de sonda por seção, uma lâmina de cada vez para evitar o ressecamento das seções. Em seguida, coloque o suporte para manchas na bandeja de controle de umidade e insira-o no forno a 40 graus Celsius por duas horas. Em seguida, coloque um rack de lavagem em uma travessa cheia de 200 mililitros de tampão de lavagem 1X.Em seguida, bata em cada slide, um de cada vez, em uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. E insira imediatamente cada lâmina no escorredor de lavagem. Incube em temperatura ambiente por dois minutos em um prato cheio de tampão de lavagem fresco enquanto move o rack para cima e para baixo três a cinco vezes e depois repita a lavagem em um novo prato.Para amplificação de sinal, bata em cada lâmina para remover o excesso de tampão de lavagem e coloque-as em um suporte para manchas. Cubra a seção de tecido em cada lâmina com quatro gotas de reagente AMP zero. Em seguida, coloque a grelha na bandeja de controle de umidade, insira a bandeja no forno e incube a 40 graus Celsius por 30 minutos.Lave a lâmina duas vezes com tampão de lavagem, como feito anteriormente neste experimento. Repita a etapa de amplificação de sinal com reagentes AMP de um a seis, conforme descrito no protocolo de texto, e lave as lâminas após cada etapa. Para detecção de sinal, remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas batendo e coloque-as em um suporte para manchas.Em seguida, misture dois microlitros de vermelho rápido B com 120 microlitros de vermelho rápido A em um tubo de microcentrífuga. Adicione a solução às seções de tecido em cada lâmina para cobri-las totalmente. Coloque o suporte para manchas na bandeja de controle de umidade, cubra a bandeja e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, remova a solução e insira as lâminas em um escorredor de lavagem. Coloque a grelha em uma travessa contendo água da torneira para lavar as lâminas e repita a lavagem. Após a segunda lavagem, bata em um papel absorvente para remover o excesso de água.Em seguida, coloque o rack em um prato contendo 50% de solução de coloração de hematoxilina. Mova o rack para cima e para baixo várias vezes. E incube por dois minutos em temperatura ambiente.Transfira a grelha para uma travessa contendo água da torneira. Mova o rack para cima e para baixo cinco vezes e repita a lavagem até que as lâminas fiquem claras, enquanto as seções de tecido permanecem roxas. Em seguida, transfira o rack para um prato contendo 0,02% de água com amônia.Mova o rack para cima e para baixo duas a quatro vezes até que as seções fiquem azuis. Lave as lâminas com água da torneira três a cinco vezes no prato de coloração. Em seguida, coloque o rack dentro de uma incubadora e incube por 15 minutos a 60 graus Celsius para secar as lâminas.Quando estiver completamente seco, adicione uma gota de meio de montagem em cada lâmina para cobrir a fatia. Em seguida, coloque cuidadosamente uma lamínula de 24 por 50 milímetros sobre as seções de tecido em cada lâmina. Após secar as lâminas ao ar por 30 minutos em temperatura ambiente, prossiga com a coleta de dados.Para calcular a porcentagem emendada ou o valor PSI para o éxon 23a, o número de células e pontos em três sub-regiões do córtex e do hipocampo CA3 são contados. O ensaio de hibridização in situ de RNA é realizado em seções cerebrais de camundongos CD1 do tipo selvagem usando três sondas específicas de NF1 diferentes. Pontos pontilhados vermelhos observados nas seções do córtex e do hipocampo indicam sinais positivos por NF1 total, específico de inclusão e sondas específicas de salto.Os sinais ISH das três sondas são então contados e usados para calcular o PSI. O ensaio de hibridização in situ de RNA é realizado no córtex de camundongos C57 pretos 6J selvagens e camundongos C57 pretos 6J mutantes nos quais o éxon 23a está incluído em todos os tipos de células. Pontos pontilhados vermelhos observados no córtex de camundongos C57 pretos 6J do tipo selvagem, indicam sinais positivos por NF1 total, inclusão específica e sondas específicas de salto.Em camundongos mutantes C57 pretos 6J, sinais semelhantes são obtidos por sondas NF1 total e específicas de inclusão. No entanto, nenhum sinal é detectado quando o salto de sonda específica é usado, indicando que duas sondas direcionadas à inclusão ou salto de exon são altamente específicas. Como a rotulagem multicolorida nas mesmas lâminas de tecido ainda não está disponível para este procedimento, diferentes sondas são usadas nas diferentes lâminas de tecido.Para obter os valores percentuais precisos de emenda, é importante usar lâminas cortadas adjacentes e tratar as lâminas exatamente da mesma maneira durante todo este procedimento. Complementando este procedimento estão as medidas como imuno-histoquímica, que podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais sobre a localização e função de isoformas de splicing diferencialmente expressas.

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Research

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Genetics

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A regulação alternativa do splicing demonstrou contribuir para a transição epitelial-mesenquimal (EMT), um programa celular essencial em vários processos fisiológicos e patológicos. Aqui descrevemos um método utilizando um modelo EMT induzível para a detecção de splicing alternativo durante EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

A hibridização in situ (ISH) de RNA permite a visualização de RNAs em células e tecidos. Aqui, mostramos como a combinação de RNAscope ISH com imuno-histoquímica ou corantes histológicos pode ser usada com sucesso para detectar mRNAs localizados em axônios em seções de cérebros de camundongos e humanos.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Aqui nós descrevemos um protocolo teve como objetivo investigar o impacto do splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de modelos parentais e resistentes in vitro através de RNA-seq e estabeleceu um método baseado qRT-PCR para validar genes candidatos.

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

O splicing alternativo (AS) e a poliadenilação alternativa (APA) expandem a diversidade de isoformas de transcritos e seus produtos. Aqui, descrevemos protocolos de bioinformática para analisar ensaios de RNA-seq em massa e sequenciamento final de 3' para detectar e visualizar AS e APA variando entre condições experimentais.

Identificação de Splicing Alternativo e Poliadenilação em Dados de RNA-seq

Estabelecemos um ensaio de hibridização in situ Duplex para mapear as isoformas do receptor de insulina IR-A e IR-B no plexo coróide murino, superando as limitações dos métodos tradicionais. Essa abordagem de alta resolução revela a expressão específica da isoforma, oferecendo novos insights sobre a sinalização da insulina cerebral e possíveis terapias direcionadas à isoforma para distúrbios neurológicos.

Visualização precisa dos receptores de insulina A e B no cérebro murino com um ensaio de hibridização in situ de RNA

Este protocolo fornece um pipeline computacional simplificado para quantificar transcritos de intensificadores nascentes. Ao integrar a acessibilidade da cromatina, a característica da cromatina e os dados transcricionais, ele permite a detecção precisa e a análise específica da atividade do intensificador em regiões intragênicas complexas, mantendo-se acessível a pesquisadores sem treinamento extensivo em bioinformática.

Um pipeline computacional para quantificação de RNA intensificador intergênico/intragênico em células-tronco embrionárias de camundongo

Aprenda a analisar padrões de splicing alternativo de pré-mRNA em seções de cérebro de camundongo usando hibridização in situ com sondas de junção de exons. Este método sensível permite detectar isoformas específicas com amplificação de sinal.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

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