Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do splicing alternativo de pré-mRNA. Especificamente, ele fornece um sistema de ensaio robusto e sensível para examinar padrões alternativos de emenda in situ em fatias de tecido. Com este método, o splicing alternativo pode ser analisado simultaneamente em muitos subtipos que estão contidos em estruturas biológicas complexas, como o cérebro de um camundongo.

A principal vantagem dessa técnica é que ela usa sondas de junção de exon antiestáticas de choque em hibridização in situ de mRNA para produzir sinais de hibridização específicos da isoforma. A tecnologia de amplificação de sinal de construção aumenta a sensibilidade da detecção para fornecer sinais de hibridização robustos. Os sinais detectados foram a inclusão de éxons escapando de sondas específicas que são usadas para calcular a porcentagem de emenda nos sinais vitais em diferentes áreas anatômicas do cérebro de um camundongo.

Neste estudo, o éxon 23a da NF1 é usado como exemplo para ilustrar o uso do sistema de ensaio. No entanto, o sistema pode ser adaptado para padrões de expressão de análise de muitos éxons alternativos. Para iniciar a parafinização da seção D do cérebro do camundongo, encha dois pratos de lavagem com 250 mililitros de xileno.

E outros dois com 250 mililitros de etanol 100% dentro de uma hotte. Insira as lâminas de tecido em um escorredor de lavagem. Em seguida, coloque o rack de lavagem em um prato contendo xileno e incube por cinco minutos enquanto move o rack para cima e para baixo pelo menos três vezes e repita com o segundo prato de xileno.

Em seguida, coloque o rack em um recipiente contendo etanol e incube por dois minutos com os mesmos movimentos para cima e para baixo e repita com o segundo prato de etanol. Para secar as lâminas, mova a prateleira da segunda placa de etanol e coloque-a dentro de uma incubadora a 60 graus Celsius por cinco minutos. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar uma barreira de 0,75 polegada por 0,75 polegada ao redor da seção de tecido e seque ao ar por três minutos em temperatura ambiente.

Ligue o forno de hibridização e ajuste a temperatura para 40 graus Celsius. Depois de umedecer completamente o papel umidificador com água destilada, coloque-o em uma bandeja de controle de umidade. Em seguida, insira a bandeja de controle de umidade no forno de hibridização.

Depois de colocar as lâminas secas em uma bancada, cubra completamente as seções de tecido em cada lâmina com cinco a oito gotas de solução de peróxido de hidrogênio. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Bata as lâminas em um papel absorvente, uma de cada vez, para remover a solução de peróxido de hidrogênio e insira as lâminas em um escorredor de lavagem.

Mergulhe o rack em uma travessa contendo água enquanto o move para cima e para baixo de três a cinco vezes para lavar as lâminas. Encha um copo de vidro de um litro colocado em uma placa quente com 700 mililitros de tratamento de remoção de alvo 1X e cubra-o com papel alumínio. Insira um termômetro na tampa de alumínio e ligue a placa de aquecimento, colocada em temperatura alta por 10 a 15 minutos.

Quando a temperatura do reagente de recuperação atingir 98 graus Celsius, coloque a placa de aquecimento em temperatura baixa para manter uma condição de ebulição suave. Em seguida, remova cuidadosamente o papel alumínio e coloque o rack dentro do copo. Cobrir o copo com papel alumínio e incubar durante 15 minutos.

Use uma pinça para transferir a prateleira do copo para uma travessa contendo 200 mililitros de água destilada e incube por 15 segundos. Após 15 segundos, coloque a grelha em uma assadeira contendo 100% de etanol e incube por três minutos. Retire a grelha do prato e seque a 60 graus Celsius por 10 minutos.

Depois de colocar as lâminas em um suporte para manchas, cubra as seções de tecido com cinco gotas de protease 3 por lâmina. Coloque cuidadosamente o rack na bandeja de controle de umidade e insira a bandeja no forno de hibridização e incube a 40 graus Celsius por 30 minutos. Depois de remover o rack da bandeja, bata nas lâminas para remover o excesso de líquido e insira-as em um rack de lavagem.

Coloque o rack em uma travessa contendo água destilada e mova o rack para cima e para baixo de três a cinco vezes para lavar as lâminas. Para se preparar para a hibridização in situ, incube as sondas e os reagentes AMP em temperatura ambiente por 30 minutos. Insira a bandeja de controle de umidade no forno de hibridização e ajuste a 40 graus Celsius.

Para hibridização de sonda, remova as lâminas do rack de lavagem e bata nelas para remover o excesso de líquido. Coloque as lâminas em um suporte para manchas. Use um lápis para rotular as lâminas com o nome da sonda.

Coloque três lâminas de tecido cerebral cortadas adjacentemente para serem hibridizadas com três sondas diferentes de mitose de fibra neural tipo um juntas. Como existem sondas específicas de isoforma muito diferentes, uso seções de tecido cortadas adjacentes. É fundamental que essas seções sejam tratadas exatamente da mesma forma nas etapas de hibridização, amplificação e detecção de sinal para garantir a precisão da emenda percentual no cálculo.

Cubra as seções de tecido com quatro gotas de sonda por seção, uma lâmina de cada vez para evitar o ressecamento das seções. Em seguida, coloque o suporte para manchas na bandeja de controle de umidade e insira-o no forno a 40 graus Celsius por duas horas. Em seguida, coloque um rack de lavagem em uma travessa cheia de 200 mililitros de tampão de lavagem 1X.

Em seguida, bata em cada slide, um de cada vez, em uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. E insira imediatamente cada lâmina no escorredor de lavagem. Incube em temperatura ambiente por dois minutos em um prato cheio de tampão de lavagem fresco enquanto move o rack para cima e para baixo três a cinco vezes e depois repita a lavagem em um novo prato.

Para amplificação de sinal, bata em cada lâmina para remover o excesso de tampão de lavagem e coloque-as em um suporte para manchas. Cubra a seção de tecido em cada lâmina com quatro gotas de reagente AMP zero. Em seguida, coloque a grelha na bandeja de controle de umidade, insira a bandeja no forno e incube a 40 graus Celsius por 30 minutos.

Lave a lâmina duas vezes com tampão de lavagem, como feito anteriormente neste experimento. Repita a etapa de amplificação de sinal com reagentes AMP de um a seis, conforme descrito no protocolo de texto, e lave as lâminas após cada etapa. Para detecção de sinal, remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas batendo e coloque-as em um suporte para manchas.

Em seguida, misture dois microlitros de vermelho rápido B com 120 microlitros de vermelho rápido A em um tubo de microcentrífuga. Adicione a solução às seções de tecido em cada lâmina para cobri-las totalmente. Coloque o suporte para manchas na bandeja de controle de umidade, cubra a bandeja e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, remova a solução e insira as lâminas em um escorredor de lavagem. Coloque a grelha em uma travessa contendo água da torneira para lavar as lâminas e repita a lavagem. Após a segunda lavagem, bata em um papel absorvente para remover o excesso de água.

Em seguida, coloque o rack em um prato contendo 50% de solução de coloração de hematoxilina. Mova o rack para cima e para baixo várias vezes. E incube por dois minutos em temperatura ambiente.

Transfira a grelha para uma travessa contendo água da torneira. Mova o rack para cima e para baixo cinco vezes e repita a lavagem até que as lâminas fiquem claras, enquanto as seções de tecido permanecem roxas. Em seguida, transfira o rack para um prato contendo 0,02% de água com amônia.

Mova o rack para cima e para baixo duas a quatro vezes até que as seções fiquem azuis. Lave as lâminas com água da torneira três a cinco vezes no prato de coloração. Em seguida, coloque o rack dentro de uma incubadora e incube por 15 minutos a 60 graus Celsius para secar as lâminas.

Quando estiver completamente seco, adicione uma gota de meio de montagem em cada lâmina para cobrir a fatia. Em seguida, coloque cuidadosamente uma lamínula de 24 por 50 milímetros sobre as seções de tecido em cada lâmina. Após secar as lâminas ao ar por 30 minutos em temperatura ambiente, prossiga com a coleta de dados.

Para calcular a porcentagem emendada ou o valor PSI para o éxon 23a, o número de células e pontos em três sub-regiões do córtex e do hipocampo CA3 são contados. O ensaio de hibridização in situ de RNA é realizado em seções cerebrais de camundongos CD1 do tipo selvagem usando três sondas específicas de NF1 diferentes. Pontos pontilhados vermelhos observados nas seções do córtex e do hipocampo indicam sinais positivos por NF1 total, específico de inclusão e sondas específicas de salto.

Os sinais ISH das três sondas são então contados e usados para calcular o PSI. O ensaio de hibridização in situ de RNA é realizado no córtex de camundongos C57 pretos 6J selvagens e camundongos C57 pretos 6J mutantes nos quais o éxon 23a está incluído em todos os tipos de células. Pontos pontilhados vermelhos observados no córtex de camundongos C57 pretos 6J do tipo selvagem, indicam sinais positivos por NF1 total, inclusão específica e sondas específicas de salto.

Em camundongos mutantes C57 pretos 6J, sinais semelhantes são obtidos por sondas NF1 total e específicas de inclusão. No entanto, nenhum sinal é detectado quando o salto de sonda específica é usado, indicando que duas sondas direcionadas à inclusão ou salto de exon são altamente específicas. Como a rotulagem multicolorida nas mesmas lâminas de tecido ainda não está disponível para este procedimento, diferentes sondas são usadas nas diferentes lâminas de tecido.

Para obter os valores percentuais precisos de emenda, é importante usar lâminas cortadas adjacentes e tratar as lâminas exatamente da mesma maneira durante todo este procedimento. Complementando este procedimento estão as medidas como imuno-histoquímica, que podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais sobre a localização e função de isoformas de splicing diferencialmente expressas.