Uma plataforma de Microphysiologic para gordura humana: imprensado tecido adiposo branco

Este método inovador nos permite, pela primeira vez, manter a gordura viva e saudável ex vivo por várias semanas consecutivas para o estudo da biologia adiposa. A principal vantagem dessa técnica é que o tecido permanece estável por mais de oito semanas na cultura enquanto recapitula o microambiente adiposo, incluindo as células de suporte estromal adiposas nativas circundantes. Comece semeando ASC em uma confluência de aproximadamente 80% em placas de cultura de tecidos.

Para cada poço de SWAT desejado, semeie um poço de cultura de tecidos convencional e um poço de tamanho correspondente em uma placa plástica de cultura de tecidos revestida com PNIPAAm. Manter o ASC em meio de cultura completo a 37 graus Celsius e 5%CO2 por seis a oito dias, trocando o meio a cada dois dias. Vinte e quatro horas antes da semeadura SWAT, enrole a borda do disco êmbolo de cada êmbolo para o aparelho de semeadura SWAT pelo menos duas vezes com fita adesiva para evitar vazamento da solução de gelatina.

Em um gabinete de biossegurança desinfetado com etanol, pulverize um rack de tubos cônicos de 15 mililitros contendo tubos cônicos de 15 mililitros vazios e sem tampa, bem como cada êmbolo envolto em fita com 70% de etanol, colocando cada êmbolo em um tubo vazio à medida que é desinfetado. Pulverize arruelas de metal de aproximadamente 6.3 gramas e coloque-as no rack junto com um par de pinças em gancho. Em seguida, feche o caixilho do gabinete e acenda a luz ultravioleta para facilitar a secagem e esterilização durante a noite dos materiais do aparelho de semeadura.

Quando as células atingirem 100% de confluência e demonstrarem um padrão estriado, adicione 0,75 gramas de gelatina em pó a 10 mililitros de HBSS. E equilibre o pH da solução com 100 microlitros de hidróxido de sódio. Adicione a gelatina a um banho-maria a 75 graus Celsius e agite o tubo vigorosamente a cada cinco minutos até que o pó se dissolva em solução.

Coe a solução homogênea de gelatina através de um filtro de seringa e aplique a gelatina nos êmbolos. As bordas gravadas dos êmbolos servirão como molde enquanto a gelatina se solidifica. Quando a gelatina solidificar, desembrulhe a fita e use a pinça em forma de gancho para remover a gelatina da borda externa do êmbolo, tomando cuidado para que a gelatina restante no centro do êmbolo esteja completamente nivelada, para maximizar o contato com a folha ASC.

Depois que a gelatina for removida de todos os êmbolos, aplique suavemente cada êmbolo em uma placa ASC revestida com PNIPAAm usando as arruelas de metal para pesar os êmbolos. Após uma incubação de 1,5 horas à temperatura ambiente, transfira as placas para um banho de água gelada por mais 1,5 horas para completar a dissociação da folha celular da superfície da placa revestida com PNIPAAm. Em seguida, limpe o fundo das placas revestidas com PNIPAAm para remover qualquer água não estéril.

Após o recebimento do tecido adiposo humano, adicione meio de cultura de células frias a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro por cultura a ser semeada. E lave grandes segmentos do tecido adiposo três vezes em PBS estéril, removendo o máximo de PBS possível entre as lavagens. Após a última lavagem, use uma pinça e uma navalha estéril para picar grosseiramente o tecido, removendo o máximo possível de vasculatura e fáscia até que a solução adquira consistência líquida espessa com o mínimo possível de segmentos individuais visíveis de tecido adiposo branco.

Uma vez alcançada uma consistência de tecido adequada, use uma ponta de micropipeta P1000 modificada para transferir o volume apropriado de tecido picado para cada tubo de 1,5 mililitro previamente preparado e misture brevemente o tecido picado com o meio dentro dos tubos. Em seguida, substitua o meio em cada cultura ASC por um volume de solução de tecido adiposo branco e transfira suavemente os êmbolos de gelatina para a mistura de tecido adiposo branco nas placas ASC de base. Examine as monocamadas nas placas revestidas com PNIPAAm ao microscópio para confirmar o descolamento celular e mova as placas para a superfície de um bloco de calor de 37 a 40 graus Celsius no gabinete de biossegurança.

Em seguida, adicione dois a três mililitros de meio de cultura aquecido para incubar as células e facilitar o derretimento da gelatina. Após 30 minutos, remova suavemente os êmbolos da superfície da placa, cubra as culturas com as tampas apropriadas e coloque as placas na incubadora de cultura de células. Quando a gelatina estiver completamente liquefeita, aspire e substitua o meio de cultura celular pelo volume apropriado de meio M199 livre de vermelho de fenol suplementado com insulina, dexametasona e antibióticos.

Ao longo de 7,5 semanas de cultura, os clusters SWAT permanecem presos no lugar na monocamada com apenas pequenas alterações morfológicas observadas em adipócitos individuais. A coloração clara de vermelho do Nilo de aglomerados de adipócitos uniloculares em duas semanas de cultura demonstra que as células são de fato adipócitos com membranas intactas, em vez de artefatos, cistos ou adipócitos mortos. A coloração com iodeto de propídio de SWAT de 53 dias de idade e a coloração Oil Red O de culturas SWAT de 51 dias confirmam que os adipócitos mantêm a viabilidade mesmo em momentos avançados.

A imunocitoquímica demonstra a expressão proteica esperada apropriada e a localização de marcadores de adipócitos maduros dentro do SWAT e a PCR quantitativa indica a expressão dos principais genes dos adipócitos no nível transcricional. A avaliação da função endócrina do manjericão indica secreção de leptina de manjericão das culturas SWAT detectadas por ELISA, e a liberação de glicerol também pode ser induzida em resposta à estimulação química. O xenotransplante de adipócitos cultivados com SWAT revela depósitos de gordura claramente visíveis e prontamente recuperados 10 dias após o transplante que se coram para marcadores de adipócitos humanos, mas não de camundongos.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de cinco horas se for executada corretamente. É importante lembrar de processar o tecido primário rapidamente para minimizar a morte celular. Após esse procedimento, outros métodos, como PCR quantitativo em tempo real, imunocoloração ou ensaios funcionais, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como os adipócitos respondem a vários medicamentos ou toxinas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a cultura SWAT como uma plataforma estável e confiável para sua pesquisa adiposa. Não se esqueça de que trabalhar com tecido humano primário pode ser perigoso e que precauções como usar o EPI adequado e manusear o tecido sob gabinetes de biossegurança devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.