Detectar a localização Subcellular da proteína por marcação de proteína de fluorescência verde e 4' 6-Diamidino-2-phenylindole de coloração em Caenorhabditis elegans
30 de julho de 2018
Este protocolo demonstra como controlar uma translocação nuclear da proteína sob estresse de calor, usando uma fluorescência verde (GFP) de proteína proteína da fusão como um marcador e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração. O DAPI protocolo de coloração é rápido e preserva os sinais de Localização subcellular GFP e proteína.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de C.elegans, como biologia celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida e eficiente para obter sinais de coloração nuclear, GFP e alterações de localização subcelular simultaneamente. Para começar, gere uma matriz extracromossômica alinhada com uma construção translacional de genes-alvo.
Alternativamente, obtenha essas linhagens no Caenorhabditis Genetic Center, que é um recurso público para a pesquisa de C. elegans. Ou, de um laboratório de pesquisa publicado anteriormente. Depois de expor os vermes à radiação gama para integrar as linhas extracromossômicas ao genoma, selecione as linhas expressas de forma estável para que cada animal expresse uma proteína marcadora, como uma GFP ou rolo.
Para remover as mutações geradas durante a radiação, ultrapasse as linhas pelo menos duas vezes. Use a linha transgênica resultante para detectar alterações no padrão de expressão de proteínas sob estresse. Em seguida, depois de preparar as placas de minhoca NGM de acordo com o protocolo de texto, listre um clone OP50 e cultive a bactéria em caldo LB líquido durante a noite.
Semeie as placas NGM com cultura OP50 líquida e incube as placas em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite para cultivar o gramado de bactérias como fonte de alimento para os vermes. Resfrie as placas em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos antes de usar. Cultive a linha transgênica a 20 graus Celsius sem fome, por pelo menos duas gerações antes do ensaio de estresse térmico.
Escolha de oito a dez adultos jovens e grávidos para uma nova placa de minhoca. Em seguida, deixe-os botar ovos por cerca de três a cinco horas e remova todos os adultos dos pratos. Para sincronizar os vermes, deixe os ovos eclodirem e crescerem as larvas por aproximadamente 48 horas até o quarto estágio larval, ou L4.
Isso pode ser identificado pela vulva, que é uma estrutura em meia-lua. Em seguida, estresse térmico dos vermes incubando as placas com as larvas L4 a 35 graus Celsius por duas a cinco horas. Inclua um termômetro em uma incubadora para medir com precisão a temperatura.
Pipete 10 microlitros de M9 no centro de uma lâmina de vidro. Em seguida, pegue vermes com choque térmico e transfira-os para a gota do buffer. Como alternativa, use M9 para lavar as minhocas da placa.
Em seguida, centrifugue a amostra a 1000 vezes a gravidade à temperatura ambiente por um minuto. Descarte o sobrenadante e adicione as minhocas à lâmina de vidro. Sob um microscópio de dissecação, use um tecido mole para drenar o excesso de líquido.
Em seguida, ainda sob o microscópio, adicione 10 microlitros de álcool a 95% nos vermes e continue a observá-los. Imediatamente após a secagem do etanol, repita a adição de etanol mais duas vezes. É fundamental para o processo de evaporação do etanol dos animais sob o microscópio de dissecação.
Assim que o etanol sair dos animais, prossiga imediatamente para a próxima etapa. Adicione 10 microlitros de DAPI aos vermes. Aplique imediatamente uma lamínula e sele a lâmina com gel de esmalte transparente.
Depois de permitir que o esmalte endureça por aproximadamente 10 minutos, veja os animais sob um microscópio de fluorescência. Para fixar animais com acetona, use M9 para lavar a placa de choque térmico e centrifugue a amostra a 1000 vezes a gravidade à temperatura ambiente por um minuto. Rejeitar o sobrenadante e utilizar um mililitro de água destilada para lavar o sedimento.
Após remover o sobrenadante, adicione 400 microlitros de acetona a 30% e incube a amostra por 15 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo a 1000 vezes a gravidade à temperatura ambiente por um minuto. Após descartar o sobrenadante, use 500 microlitros de água destilada para lavar os animais duas vezes.
Adicione 200 microlitros de DAPI ao pellet, ou quatro vezes a quantidade do volume total dos vermes ao tubo, e incube a amostra por 15 minutos. Centrifugar a amostra e rejeitar o sobrenadante. Em seguida, use 500 microlitros de água destilada para lavar o pellet duas vezes antes de montar e fazer a imagem como antes.
Para realizar imagens, ligue a fonte de luz UV e o microscópio de fluorescência. Em seguida, ligue o computador conectado ao microscópio. Carregue a lâmina no microscópio de fluorescência.
Use uma lente objetiva de 10X para localizar os vermes. Em seguida, aumente a potência de ampliação para 400X e concentre-se na amostra. Em seguida, abra o software fornecido com o microscópio.
Clique em Aquisição, depois clique em Câmera e selecione a câmera conectada ao microscópio. Na mesma Aquisição, clique em Aquisição Multidimensional. Isso abre uma nova janela de navegação de Aquisição Multidimensional.
Clique no botão multicanal e todos os canais disponíveis aparecerão. Escolha azul, verde e DIC para observar a amostra. Na janela de navegação Multidimensional Acquisition, deixe os canais DAPI azul, GFP verde e DIC cinza ativados e clique com o botão direito do mouse em outros canais, como Rodamina vermelha e Campo claro branco, para fechá-los.
Para medir o tempo de exposição de cada canal, clique com o botão esquerdo do mouse no canal DAPI azul para selecioná-lo e clique em medir"para tirar uma imagem ao vivo com um tempo de exposição automatizado. No lado esquerdo da janela de imagem ao vivo, ajuste manualmente o tempo de exposição, se desejar, e clique em OK. Configure os tempos de exposição para os canais GFP e DIC de maneira semelhante. Na janela de navegação Aquisição Multidimensional, clique em Iniciar"para coletar automaticamente três imagens nos três canais diferentes, em ordem, com os tempos de exposição definidos.
Para salvar o arquivo, no menu principal, clique em Arquivo, Salvar como.Insira o nome do arquivo e a pasta. Salve o arquivo como o formato de arquivo padrão para preservar as informações detalhadas de geração de imagens para referência futura. Para exportar o arquivo em outros formatos, em Arquivo, clique em Exportar.
Defina o nome do arquivo e a pasta. Marque Criar uma pasta de projeto"para organizar melhor os dados. Depois de escolher um tipo de arquivo desejado no menu suspenso, clique em Iniciar"para exportar.
Existem dois homólogos de proteína de canal intracelular de cloreto em C. elegans, exl-1 e exc-4. Um estudo recente mostrou que o exl-1 regula o gerenciamento do estresse animal. Aqui, uma construção translacional exl-1 GFP foi integrada a um genoma animal e foram criadas linhas transgênicas, que expressam de forma estável o exl-1 fluorescente verde.
Sob estresse térmico, exl-1 GFP se acumula no núcleo na região intestinal à medida que um forte sinal de GFP se sobrepõe ao núcleo. Para confirmar a localização subcelular de exl-1, a coloração DAPI foi realizada em animais fixados em etanol e acetona. Ambos os métodos mostram núcleos claros no corpo do animal e os sinais GFP e DAPI sobrepostos confirmam que a GFP exl-1 realmente se acumulou nos núcleos da região intestinal.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se for executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma fixação rápida para preservar o sinal GFP e a translocação nuclear de proteínas sob estresse em C. elegans.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra como acompanhar a translocação nuclear de uma proteína sob estresse térmico utilizando uma proteína de fusão GFP como marcador e coloração com DAPI. O método é rápido e eficiente, permitindo a observação simultânea de alterações na coloração nuclear e na localização subcelular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Neurociência
- Genética
Contexto
- Compreender a localização proteica é fundamental na biologia celular.
- O estresse térmico pode afetar a translocação e a localização de proteínas.
- As proteínas de fusão GFP são marcadores valiosos para rastrear proteínas.
- A coloração com DAPI fornece um método para visualizar núcleos.
Objetivo do Estudo
- Acompanhar a translocação nuclear de proteínas sob estresse térmico.
- Utilizar GFP como marcador para a localização proteica.
- Demonstrar um protocolo rápido para coloração com DAPI.
Métodos Utilizados
- Geração de arranjos extracromossômicos com construtos traducionais.
- Exposição de C.elegans à radiação gama para integração.
- Seleção de linhagens com expressão estável por meio de proteínas marcadoras.
- Observação simultânea da localização nuclear e subcelular.
Resultados Principais
- Rastreamento bem-sucedido da translocação nuclear sob estresse térmico.
- Visualização eficiente da coloração GFP e DAPI.
- Comprovou a eficácia do protocolo em C.elegans.
- Forneceram insights sobre a dinâmica da localização proteica.
Conclusões
- O protocolo é uma ferramenta valiosa para o estudo da dinâmica proteica.
- Métodos rápidos e eficientes aprimoram a pesquisa em biologia celular.
- Aplicações futuras podem estender-se a outras condições de estresse.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o rastreamento rápido e sem anticorpos de alterações na localização subcelular de proteínas em resposta ao estresse, apoiando a validação precoce de alvos em fluxos de descoberta. Ao combinar marcação com GFP com coloração nuclear por DAPI, fornece confirmação quantitativa e visual de eventos de translocação—como o acúmulo nuclear sob estresse térmico—que podem orientar a desmistificação mecanicista de hipóteses terapêuticas. A compatibilidade do método com microscópios de fluorescência padrão torna-o acessível para preparação de triagem em alto rendimento e uso em equipes multifuncionais em ambientes de P&D biofarmacêutica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a observação direta da translocação de proteínas induzida por estresse, apoiando a validação funcional de alvos e a investigação de vias.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de anticorpos ou marcadores radioativos, reduzindo o tempo e o custo de desenvolvimento do ensaio.
- Valor Preditivo: Confirma alterações na localização subcelular que podem indicar o mecanismo de ação ou a modulação da resposta ao estresse.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera linhagens transgênicas estáveis que expressam proteínas marcadas com GFP para plataformas de triagem consistentes e reprodutíveis.
- Saída Quantitativa: Permite a medição simultânea do sinal de GFP e da coloração nuclear com DAPI para análise de co-localização.
- Escalabilidade: Compatível com microscopia de fluorescência convencional, permitindo adaptação a formatos de múltiplas poças para triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Acompanha a localização de EXL-1, uma proteína da família CLIC com homólogos em mamíferos (por exemplo, CLIC4), apoiando a avaliação translacional de alvos.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Confirma a translocação nuclear sob estresse térmico, mas não sob estresse oxidativo, ajudando a definir o comportamento específico do alvo conforme a condição.
- Continuidade Pré-clínica: Fornece um sistema reutilizável para avaliar a dinâmica proteica sob diferentes condições de estresse antes da validação in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos iniciais, particularmente para proteínas responsivas ao estresse. Ele auxilia na tomada precoce de decisões de continuidade ou descontinuação ao validar o engajamento com o alvo e a dinâmica subcelular antes das campanhas de triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses terapêuticas por meio da visualização de alterações na localização proteica sob condições definidas de estresse.
- Triagem: Prepara sistemas celulares validados para triagem de bibliotecas de compostos com leituras integradas de localização.
- Análises: Gera dados de co-localização (sobreposição de GFP/DAPI) como saída quantitativa para avaliar os efeitos de compostos no tráfego proteico.
- Pesquisa Translacional: Relaciona achados em C. elegans com sistemas de mamíferos por meio de proteínas CLIC conservadas, apoiando a validação cruzada de espécies de alvos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho modular e reutilizável para rastrear a dinâmica subcelular de qualquer proteína marcada com GFP sob estresse ou exposição a compostos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer evidência direta e visual da translocação proteica em contextos de células vivas.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de fixação e de imagem entre equipes, melhorando a reprodutibilidade e reduzindo a variabilidade.
- Valor Estratégico: Acelera os prazos de validação de alvos, permitindo uma triagem mais rápida do portfólio e reduzindo investimentos em alvos falsos positivos.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao confirmar o comportamento do alvo em modelos de estresse relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de C. elegans, geração de linhagens transgênicas e microscopia de fluorescência.
- Depende do acesso a microscópio de fluorescência com conjuntos de filtros para FITC e DAPI e óptica Nomarski.
- Necessita padronização do tempo de fixação (etanol/acetona) e coloração para preservar o sinal de GFP e garantir marcação nuclear consistente com DAPI.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir otimização da força do promotor, eficiência da marcação e paradigmas de estresse.
- Limitação prática: mais adequado para proteínas com translocação detectável; pode não resolver eventos rápidos ou transitórios de transporte sem imagem em tempo real.
