Name: Viver a imagem latente da pilha do TGF-β/Smad3 sinalização Pathway In Vitro e In Vivo usando um sistema de repórter de adenovírus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprenda a rastrear em tempo real a sinalização TGF-β/Smad3 em células MDA-MB-231 usando um sistema de adenovírus repórter. Este método não invasivo permite monitorar dinâmicas de sinalização celular em modelos in vitro e in vivo para pesquisa oncológica.

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Este trabalho foi financiado por doações da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) para H-JZ. TMBW é um destinatário de um prêmio de pós-graduação de Austrália do governo australiano e a bolsa de Top-Up Ann Henderson do Australian Rotary Health em parceira com o Rotary de Templestowe e jante por uma cura.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Melbourne Comitê de ética Animal.
Note: The sequence, construction and generation protocol for the adenoviral vectors pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP and pAd-CAGA12-Luc/Td-Tom have been previously described11,12, 13. Todos os vetores estão disponíveis comercialmente.
1. vírus Titer determinação usando 50% Dose infecciosa de cultura de tecidos (TCID50)
<ol><li>Prepare-se 1 x 106 células HEK293A em 10 mL de DMEM + 10% FBS mídia.</li>
	<li>Sementes de 100 µ l de suspensão de células em cada poço de uma placa de cultura de células 96 poços fundo plano.</li>
	<li>Prepare-se 1 mL de uma diluição de 1: 100 de estoque de vírus no meio completo. Adicione 11 µ l de vírus diluídos a cada poço da coluna 1.</li>
	<li>Realizar diluições em série 10 vezes diretamente na placa de 96 bem misturando 11 µ l de vírus diluído com 100 µ l de suspensão de células até uma diluição final de 1 x1012 é alcançado. Embora as células são não-aderente, nesta fase, o número de células transferidos entre poços permanece constante.</li>
	<li>Pipete 11 µ l de cada diluição em cada coluna, começando com a maior diluição de 104. Pontas de pipetas substitua cada diluição limite cruzado de partículas virais.</li>
	<li>Adicione 11 µ l de mídia livre de vírus completa a coluna 12 como controlo negativo.</li>
	<li>Incube a placa por 7-10 dias a 37 ° C, com 10% de CO2.</li>
	<li>Usando um microscópio, marca o número de poços em cada coluna mostrando sinais de efeito citopático ou citotóxico. Considere um bem positivo se houver qualquer sinal de infecção.</li>
	<li>Calcule a fração de poços positivos para cada diluição, usando o método estatístico (1938) de Reed e Muench14.</li>
	<li>Calcular a distância proporcional (PD) usando: (A-50)/(A-B), onde A é a resposta de percentagem acima ou igual a 50% e B é a resposta percentual inferior a 50%.</li>
	<li>Calcular TCID50 usando: 10X-PD, onde X é a diluição dando uma resposta maior que 50%.</li>
	<li>Calcular o título viral de usando o seguinte: 0,69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL</li>
</ol>2. adenovírus MOI determinação
<ol><li>Semente 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 células com 500 μL de DMEM meios de cultura contendo 5% FBS em cada poço de um 12 bem placa (confluência de célula de 35%, 6 poços no total).</li>
	<li>Calcular os volumes de estoque Ad-CMV-Td-Tom exigido para 0, 250, 500, 2500 e 5000 MOI usando fórmula a seguir: MOI = (volume [μL] x PFU/μL) / número de células. Para Ad-CMV-Td-Tom com um título de 1 x 1010 (PFU/mL), os volumes de infecção pelo vírus MOIs necessários são 0, 3.75, 7.5, 37,5 e 75 µ l, respectivamente.</li>
	<li>Infectar as células com os volumes calculados de Ad-CMV-Td-Tom na seção 2.2 pipetando diretamente ações virais nos poços com mistura completa.</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.</li>
	<li>Remova a mídia dos poços e corrigir imediatamente as células com 500 μL de formol a 10% por 5 min.</li>
	<li>Aspirar o formol de poços e lavar os poços com 500 µ l de PBS uma vez.</li>
	<li>Mancha o núcleo da célula com 500 μL de solução de Hoechst por 5 min.</li>
	<li>Remover a solução de Hoechst e lavar os poços com 500 µ l de PBS 3 vezes.</li>
	<li>Imagem da proteína Td-tomate e núcleo celular sinal usando 200 ampliação de X em um microscópio de fluorescência. Excitar a proteína Td-tomate em 554 nm e o corante Hoechst em 352 nm.</li>
	<li>Analise imagens usando o ImageJ para determinar o trabalho de que moi necessários para 100% de infecção de Td-tomate15.</li>
</ol>3. dual-adenovírus transdução em células únicas ao vivo
<ol><li>Semente 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 células com 500 μL de DMEM meios de cultura contendo 5% FBS em cada poço de um 12 bem placa (confluência de célula de 35%, 2 poços no total).</li>
	<li>Infect cells with 75 μL of Ad-CMV-GFP (titer = 5 x 109 PFU/mL) and 7.5 μL of Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL) to obtain a 2,500 MOI, which can achieve 100% infection positivity.</li>
	<li>Trate as células com ou sem 0.25 μL de TGF-β por alvéolo (10 mg/mL em estoque, 5 ng / µ l como a concentração final) imediatamente após a infecção do vírus adenoide.</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.</li>
	<li>Imagem ao vivo as células com o microscópio de fluorescência de contraste de fase. Excitar a GFP a 470 nm e proteína Td-tomate em 554 nm.</li>
	<li>Consertar as células e manchar o núcleo celular, conforme descrito em etapas 1.6 - 1.9.</li>
	<li>Imagem da proteína Td-tomate e Hoechst mancham usando um microscópio de fluorescência. Excitar o corante Hoechst em 352 nm.</li>
	<li>Usando o ImageJ, calcule que a porcentagem de GFP e tomate-Td positivo células15.</li>
</ol>4. ao vivo única célula sinalização na cicatrização de feridas ensaio
<ol><li>Sementes de 4-5 x 105 MDA-MB-231 células com 1 mL de DMEM meios de cultura contendo 5% FBS em cada poço de um 6 placa bem (confluência de célula de 50%, 2 poços no total).</li>
	<li>Infect the cells with 22.5 μL of Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500).</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.</li>
	<li>Risque duas linhas cruzadas sobre a camada de células de cada poço usando uma ponta de pipeta P200.</li>
	<li>Remover a velha mídia de poços e substituir com 2 mL de fresco 5% a FBS mídia com ou sem 0,5 μL de TGF-β por alvéolo (10 mg/mL em estoque, 5 ng/μL, concentração final).</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 5 min e leve as imagens das áreas selecionadas ferida usando 100 ampliação de X em um microscópio de contraste de fase.</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.</li>
	<li>Com imagens do encerramento da ferida para as mesmas áreas como antes.</li>
	<li>Corrigir as células, manchar o núcleo da célula, conforme descrito em etapas 1.6 - 1.9 e visualizar o sinal Td-tomate na área ferida e área não-ferida usando 200 ampliação de X em um microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Quantificar a porcentagem de células positivas Td-tomate na área de não-ferida usando o ImageJ software15e ferida.</li>
</ol>5. in Vitro Luciferase ensaio
<ol><li>Preparar uma suspensão de células de 3-5 x 104 MDA-MB-231 células em 1 mL de mídia DMEM contendo 5% FBS.</li>
	<li>Infect cell suspension with 2.5 μL of Ad-CAGA12-Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500).</li>
	<li>Semente as células infectadas em 96 uma placa bem no 3.000 células/100 µ l/poço.</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.</li>
	<li>Remover a velha mídia de poços e substituir com 100 µ l de frescos 5% FBS meios de comunicação com ou sem 0,1 μL de TGF-β por alvéolo (1 mg/mL em estoque, 1 ng / µ l como a concentração final) e na presença ou ausência de 0.17 μL de inibidor de TGF-β por alvéolo (7 mg/mL em estoque 12 ng/μL, concentração final) (uma romance proteína de armadilha ligante TGF-β, Chen et al, trabalho não publicado).</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora a 37 ° C, com 10% de CO2 por 24 h.</li>
	<li>Descongelar o substrato de sistema de ensaio de luciferase e preparar 1 x celular cultura reagente de Lise em água bidestilada (DDW).</li>
	<li>Remova a mídia de 96 poços e lyse poços com 50 μL de 1 x celular cultura lise no gelo usando um agitador orbital com agitação suave durante 30 min.</li>
	<li>Transferir 30 μL de lisado de cada poço em um prato de luciferase opaco e deixar a placa aquecer a temperatura ambiente.</li>
	<li>O luminómetro, crie um novo protocolo. Selecione para 1 injector com medições antes e após a injeção. Definir medidas antes da injeção em 1 s para tanto atraso na medição e o Tempo de integração. Para depois da medição da injeção, definir o Volume da injeção a 40 µ l, com um atraso na medição de 1 s após a injeção e 5 s Tempo de integração. Confirme as configurações selecionando Okey.</li>
	<li>Colocar o tubo injector DDW e clique no botão de 1 Injector sob as configurações Prime para limpar o tubo injetor antes do uso. Em seguida, remova o tubo injector da DDW e coloque no ar, seguido de mais dois primos do injector 1 para lavar toda a solução do tubo. Coloca o tubo injector em substrato de Firefly e novo Prime duas vezes para preparar o substrato.</li>
	<li>Coloque a placa de luciferase opaco com as amostras para o luminómetro e selecione as opções do software. Destaque os poços de interesse e clique em aplicar. Pressione Iniciar para medir o sinal do luciferase.</li>
	<li>Uma vez concluídas as medições, remova e lave a placa com água. Recupere qualquer substrato restante no tubo injector, colocando o tubo de ar e injetor Prime 1 volta no tubo de substrato de vaga-lume. Colocar o tubo injector DDW e realizar mais dois primos para limpar o tubo injetor de qualquer substrato restante.</li>
</ol>6. célula preparação para viver sinalização Imaging In Vivo
<ol><li>48 h antes da implantação do tumor, 2-3 x 106 MDA-MB-231 células de sementes em frascos de2 175 cm (10 frascos no total). Cultura de células em 20 mL de mídia DMEM contendo 5% FBS a 37 ° C, 10% CO2.</li>
	<li>24 h later, add 300 μL of Ad-CAGA12-Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500) into each flask. Manter as células em cultura para outro 24h.</li>
	<li>No dia da implantação, remova a mídia velha e lavar as células de adenovírus infectado uma vez com 20 mL de PBS, pH 7,4. Adicionar 2 mL de 0,05% do trypsin-EDTA para o frasco e agitar o frasco ligeiramente para permitir que a tripsina cobrir toda a superfície do balão. Coloque o frasco em para a incubadora 37 ° C, 10% de CO2 por 3 min.</li>
	<li>Saciar a tripsina, adicionando 8 mL de mídia contendo FBS DMEM balões. Transferi todas as suspensões celulares em um frasco de reagente de vidro.</li>
	<li>Contar o número de células usando um hemocytometer e transferir a 4,8 x 107 células em dois tubos de centrífuga de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugar as células a 400 x g durante 5 min à RT para remover tripsina e ressuspender as células em 720 mL de mídia de FBS-DMEM fresca.</li>
	<li>Transferir as suspensões celulares em um tubo estéril 5 mL e adicionar 160 μL Matrigel (suspensão total matrigel 10%).</li>
	<li>Manter as células no gelo até a implantação.</li>
</ol>7. ortotópico implantação
<ol><li>Pesa 12 ratos SCID e aleatoriamente, alocar os ratos em grupos controle e tratamento (6 ratos/grupo).</li>
	<li>Execute a implantação em um bio-armário estéril para manter um ambiente estéril. Anestesiar o mouse utilizando isoflurano 2,5-4,5%, com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min. Coloque o mouse sobre uma almofada de calor e dispensar uma gota de lubrificante pomada em ambos os olhos para evitar danos da córnea. Corrigi o mouse para a almofada do calor em uma posição supina enquanto mantendo a anestesia, colocando o focinho em um cone de nariz ligado para o isoflurano.</li>
	<li>Confirme o sucesso da anestesia pela falta de reação aos pés pitada. Reduza o isoflurano para uma dose de manutenção de 1,5-2,5% 1 L/min de oxigênio para o lembrete de implantação.</li>
	<li>Limpe a pele do mamilo quarta em ambos os lados da linha mediana usando o cotonete embebido em etanol a 80%.</li>
	<li>Encontrar 4th do tecido mamário através da palpação e aperte a gordura almofada para expor ainda mais o tecido.</li>
	<li>Misture a suspensão de células bem pipetando para cima e para baixo. Delicadamente, Aspire 50 µ l de mistura de célula em uma seringa de insulina de 27G e injetar do tecido mamário em ambos os lados do rato.</li>
	<li>Confirme uma injeção bem sucedida pela sensação de inchaço da almofada gorda. Liberar a gordura almofada delicadamente e coloque o mouse volta para a jaula.</li>
	<li>Deixe as gaiolas na rampa pelo menos 30 min permitir que os ratos ganhar consciência e em seguida, coloque as gaiolas de volta na sala de espera de 3 dias de calor.</li>
</ol>8. IVIS Imaging
<ol><li>Abra o software de Imagem de viver .</li>
	<li>Inicialize o sistema IVIS clicando no botão Inicializar IVIS sistema no painel de controle. Espere até que o sinal de temperatura fica verde.</li>
	<li>Selecione o modo de imagem Luminescent no painel de controle.</li>
	<li>Ligue o isoflurano anestesia para a câmara e o sistema IVIS.</li>
	<li>Anestesiar os ratos usando 2,5-4,5% de isoflurano com oxigênio de 1 L/min. Uma vez anestesiado, conjunto isoflurano de 1,5-2,5% para manutenção. Injete 150 mg/kg de peso corporal de D-luciferina em ratos pela injeção intraperitoneal (i.p.).</li>
	<li>Transfira imediatamente ratos no sistema IVIS, colocá-los na plataforma de imagem com temperatura controlada e seu nariz para dentro do cone de nariz.</li>
	<li>Clique no botão Configuração de sequência no painel de controle e selecione Médio Binning.</li>
	<li>Configurar o tempo de exposição da imagem latente da seguinte forma: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s e 120 s. início de imagem aproximadamente 3 min após a injeção de luciferina e continuar a imagem até que o sinal começa a cair (normalmente isto levará cerca de 20 min).</li>
	<li>Remover os ratos de IVIS mantendo isoflurano anestésico através de um cone de nariz e tratar os ratos com 50 µ l PBS ou 50 µ l TGF-β sinalização inibidor (50 μg/tumor) através da injeção intra-tumor.</li>
	<li>Ponha os ratos na gaiola e deixá-los sobre a almofada do calor pelo menos 30 min. Em seguida, coloque a gaiola de volta na sala de espera.</li>
	<li>Repita IVIS procedimento de imagem, como descrito acima no dia seguinte ao tratamento.</li>
</ol>9. análise de dados
<ol><li>Abrir arquivos salvo em software de Imagem de viver .</li>
	<li>Encontrar as informações de imagem usando o modo de exibição | Informações da imagem.</li>
	<li>Selecione fotos tiradas em um ponto de tempo semelhante com o mesmo tempo de exposição. Carregar fotos como um grupo.</li>
	<li>Desmarque a caixa Individual em Ajustar a imagem para normalizar a intensidade.</li>
	<li>Selecione o modo de fóton para analisar a intensidade. Quantificar a intensidade do sinal, selecionando o botão de Região de interesse (ROI) em Ferramentas de ROI.</li>
	<li>Arraste o círculo ROI para a região que contém o sinal bioluminescente e clique no botão de medida para adquirir a intensidade do sinal.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores relatam que não há conflitos de interesse.

Nós desenvolvemos uma técnica para permitir a imagem em tempo real de TGF-β/Smad3 sinalização em células únicas ao vivo. Usando este método novo, anteriormente identificamos uma subpopulação de células com atividade transcricional TGF-β/Smad3 dinâmica que estava associada com invasão reforçada e migração8. Esse método melhora na tradicionais ensaios para sinalização do TGF-β, tais como borrões ocidentais de fosforilação Smad3 e TGF-β direcionados a expressão gênica, capturando a heterogeneidade de...

Fator de crescimento transformante β (TGF-β) é uma citocina essencial envolvida no desenvolvimento humano que sinaliza através uma heterodimérica complexa consistindo de tipo II e tipo I receptores1. Vinculação ao tipo do receptor II resultados no recrutamento e na fosforilação do tipo do receptor, que por sua vez, fosforila a jusante Smad2/3 proteínas2,3. Estas ativado Smad2/3 proteínas se ligam a Smad4, formando um complexo que translocates para o núcleo e regula a transcrição de gene4. Sob condições homeostáticas TGF-β/Smad sinalização é fortemente regulamentada; no entanto, em muitas doenças, a via de sinalização é desregulamentada e frequentemente overexpressed levando a progressão da doença5,6,7. Estudos recentes têm demonstrado que a resposta celular ao TGF-β é heterogênea e subpopulações de células ativas de TGF-β/Smad são responsáveis por uma função biológica em uma maneira tempo-dependente8,9. Análise de celular comuns de sinalização do TGF-β/Smad envolve o uso de ensaios de ponto de extremidade fixo que fornecem apenas um instantâneo da atividade celular e muitas vezes dosar a média de efeito de TGF-β/Smad10. Esses métodos, no entanto, podem não representar fielmente os comportamentos moleculares de TGF-β/Smad sinalização no estado fisiológico durante a progressão da doença. Análise baseada em imagem de captura células vivas a dinâmica dos processos celulares e biológicos com ambos uma compreensão espacial e temporal.
Nosso objetivo foi desenvolver um método sensível de alto rendimento para a imagem latente de célula viva de TGF-β/Smad sinalização utilizando reagentes baseados em adenovírus. Aqui, estamos infectados a linha de celular de câncer de mama humano MDA-MB-231 com um adenovírus expressando a sequência de ligação CAGA de Smad3 do motivo e a luciferase (Luc) ou gene repórter de Td-tomate (Td-Tom). Adenovírus repórter sistemas fornecem um método rápido e barato para introdução de plasmídeo que pode resultar em uma taxa de 100% de infecção em linhas de células de câncer. Sistemas de adenovírus repórter também foram aplicados com sucesso ao linhas celulares que são difíceis de transfect com plasmídeo convencional11. Neste protocolo, descreveremos um processo não-invasivo e pode ser reproduzido para alcançar a imagem de célula viva da via de sinalização TGFβ/Smad tanto in vivo e in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S</td><td>Calor inativado antes do uso</td></tr><tr><td>TGF-&beta humano recombinante; 1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>Alíquota em DDW para fazer concentração final a 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>Diluir em PBS para fazer concentração final a 1 &mu; L/mL</td></tr><tr><td>Luciferase Reporter Assay Kit</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>Diluir 5x em PBS antes de usar</td></tr><tr><td>Luminômetro</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia de fluorescência de contraste de fase</td><td>OLYMPUS</td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Luciferina</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In Vivo Sistema de imagem</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Diltue a 0,05% (1x) em PBS</td></tr><tr><td>Lise de Cultura de Células 5x Reagente</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Diluir a 1x em DDW</td></tr><tr><td>10% Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293A</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>Centro de Recursos Animais</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Chem-supply</td><td>EA043-10L-P</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Night Time</td><td>Allergan</td><td>1750D</td><td>Pomada Lubrificante para os Olhos</td></tr><tr><td><forte>Solução</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Composição</forte></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4,2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0,12 M)</td></tr> <tr><td>FBS-DMEM&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5% de FBS inativado por calor; 10 &mu; g/mL de penicilina; 100 &mu; g/ml de estreptomicina</td></tr></tbody></table>

viver a imagem latente da pilha do tgf-β/smad3 sinalização pathway in vitro e in vivo usando um sistema de repórter de adenovírus

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Transformar o fator de crescimento β (TGF-β) sinalização regula muitas funções importantes, necessárias para a homeostase celular e é comumente encontrada overexpressed em muitas doenças, incluindo câncer. TGF-β está fortemente implicada na metástase durante a progressão de câncer estágio atrasado, ativando um subconjunto de células tumorais migratórias e invasivo. Métodos atuais para análise da via de sinalização focar em modelos de ponto de extremidade, que muitas vezes tentam medir sinalização post-hoc de evento biológico e não refletem a natureza progressiva da doença. Aqui, demonstramos um romance adenovírus repórter sistema específico para a via de sinalização do TGF-β/Smad3 que pode detectar a ativação transcricional de células vivas. Utilizing an Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, we can achieve a 100% infection rate of MDA-MB-231 cells within 24 h in vitro. O uso de um repórter fluorescente permite para a imagem latente de células únicas ao vivo em tempo real com a identificação directa das células transcricionalmente ativas. Estimulação de células infectadas com TGF-β exibe apenas um subconjunto de células que são transcricionalmente ativo e envolvido em funções biológicas específicas. Esta abordagem permite alta especificidade e sensibilidade em um nível de célula única para melhorar a compreensão das funções biológicas relacionadas com o TGF-β sinalização em vitro. Smad3 transcriptional activity can also be reported in vivo in real-time through the application of an Ad-CAGA12-Luc reporter. Ad-CAGA12-Luc can be measured in the same manner as traditional stably transfected luciferase cell lines. Smad3 atividade transcricional de células implantados no vivo pode ser analisada através de imagens de IVIS convencional e monitorada ao vivo durante a progressão do tumor, proporcionando uma visão única a dinâmica da via de sinalização do TGF-β. Nosso protocolo descreve um sistema de entrega de repórter vantajoso permitindo rápida de imagem de alta produtividade de vias de sinalização de célula viva tanto in vitro e in vivo. Esse método pode ser expandido para uma gama de imagem com base em ensaios e presentes como uma abordagem sensível e reprodutível para biologia básica e desenvolvimento terapêutico.

Viver a única célula de imagem em vitro
Para avaliar com precisão a ativação de TGF-β/Smad sinalização em células únicas usando reagentes adenovírus com base, é importante determinar primeiro a multiplicidade ideal de infecção (MOI) para cada linha de celular. O MOI ideal é determinado quando 100% das células são positivas para infecção adenovírus com nenhum efeito citopático ou citotóxica presente. Para determinar isso, u...

Aqui, apresentamos um protocolo para a imagem latente de célula viva de TGF-β/Smad3 sinalização atividade usando um sistema de repórter de adenovírus. Este sistema controla a atividade transcricional em tempo real e pode ser aplicado para as duas células únicas em vitro e em animais vivosmodelos.

Viver a imagem latente da pilha do TGF-β/Smad3 sinalização Pathway In Vitro e In Vivo usando um sistema de repórter de adenovírus

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Este método pode responder a perguntas-chave no campo da sinalização celular, rastreando de forma não invasiva a sinalização celular em tempo real. A principal vantagem dessa técnica é que os sistemas de adenovírus fornecem um método rápido e fácil para detecção de sinalização celular que pode atingir uma taxa de infecção de 100% em linhagens de células cancerígenas. As implicações dessa técnica se estendem ao desenvolvimento terapêutico para cânceres e podem ser expandidas para outras vias de sinalização.Embora esse método possa fornecer informações sobre os modelos de câncer de mama, ele também pode ser aplicado a outros tipos de câncer, como cérebro, osso e pulmão. No dia da infecção por adenovírus, semeie os poços de uma placa de 12 poços com aproximadamente 1,25 vezes 10 para o quinto MDA-MB-231 células em 500 microlitros de meio para uma confluência de 35% Infecte células em todos os poços com 75 microlitros de adenovírus-CMV-GFP e 7,5 microlitros de adenovírus CAGA12-Td-Tomato para obter um MOI de 2.500 que pode atingir 100% de positividade da infecção. Em seguida, adicione TGF-beta ao tratamento imediatamente após a infecção por adenovírus.Incube a 37 graus Celsius com 10% de dióxido de carbono por 24 horas. No dia seguinte, faça a imagem das células vivas com um microscópio de fluorescência de contraste de fase. Em seguida, depois de fixar as células e corar os núcleos com o corante Hoechst, faça a imagem da proteína TD-Tomato e da coloração Hoechst usando um microscópio de fluorescência.Depois de obter imagens de todos os poços, calcule a porcentagem de células positivas para GFP e Td-Tomato usando ImageJ. Para o ensaio de cicatrização de feridas, comece semeando os poços de uma placa de seis poços com aproximadamente 4,5 vezes 10 para a quinta célula MDA-MB-231 em um mililitro de meio para 50% de confluência no dia da infecção. Infecte as células com 22,5 microlitros de adenovírus CAGA12-Td-Tomate e, em seguida, coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius com 10% de dióxido de carbono por 24 horas.Após 24 horas, use uma ponta de pipeta P200 para riscar duas linhas cruzadas na camada de células de cada poço. Remova o meio dos poços e trate com TGF-beta como mostrado anteriormente, depois coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius com 10% de dióxido de carbono por cinco minutos. Após cinco minutos de incubação, tire imagens de áreas selecionadas da ferida usando ampliação de 100X em um microscópio de contraste de fase antes de retornar a placa à incubadora.24 horas depois, tire imagens de contraste de fase das mesmas áreas para avaliar o fechamento da ferida. Depois de fixar as células e corar os núcleos, visualize o sinal Td-Tomato na área da ferida e na área não enrolada usando ampliação de 200X em um microscópio de fluorescência. 48 horas antes da implantação do tumor, semeie aproximadamente 2,5 vezes 10 para a sexta célula MDA-MB-231 em 10 frascos de 175 centímetros quadrados.Após 24 horas em cultura, adicione 300 microlitros de adenovírus CAGA12-luciferase em cada frasco antes de retornar as células à incubadora por mais 24 horas. No dia da implantação, remova a mídia antiga e lave as células infectadas com adenovírus uma vez com 20 mililitros de PBS. Adicione dois mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA no frasco e agite levemente o frasco para permitir que a tripsina cubra toda a superfície do frasco.Incube a 37 graus Celsius por três minutos e, em seguida, extinga a tripsina adicionando oito mililitros de meio DMEM contendo FBS nos frascos. Transfira todas as suspensões celulares para um frasco de reagente de vidro. Conte o número de células usando um hemocitômetro.Depois disso, transfira 4,8 vezes 10 para as sete células em tubos de centrífuga de 250 mililitros e centrifugue as células a 400 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Após a centrifugação, ressuspender as células em 720 microlitros de meio fresco e transferir a suspensão para um tubo de cinco mililitros. Em seguida, adicione meio contendo 10% de Matrigel para diluir a suspensão celular para três vezes 10 elevado às sextas células por 50 microlitros.Transfira a suspensão celular para um tubo estéril de cinco mililitros e mantenha no gelo até a implantação. Pese 12 camundongos SCID e aloque aleatoriamente os camundongos igualmente entre os grupos de controle e tratamento. Depois de anestesiar o camundongo, dispense uma gota de pomada lubrificante para os olhos em ambos os olhos para evitar danos à córnea, em seguida, fixe o camundongo a uma almofada térmica em um biogabinete estéril e mantenha a anestesia colocando o focinho em um nariz conectado ao isoflurano.Confirme o sucesso da anestesia pela falta de reação a um beliscão do dedo do pé. Reduza o isoflurano para uma dose de manutenção pelo restante do implante. Em seguida, use um cotonete embebido em etanol a 80% para limpar a pele de cada quarto mamilo até a linha média.Encontre a quarta almofada de gordura mamária através da palpação e aperte a almofada de gordura para expor ainda mais o tecido e, em seguida, misture a suspensão celular pipetando para cima e para baixo. Aspire suavemente 50 microlitros de mistura de células em uma seringa de insulina de calibre 27 e injete na almofada de gordura mamária. Confirme uma injeção bem-sucedida e solte suavemente a almofada de gordura.Coloque o mouse de volta na gaiola inicial. Depois que os camundongos recuperarem a consciência, retorne a gaiola à sala de espera por três dias antes de prosseguir para a imagem do IVIS. As células vivas MDA-MB-231 apresentaram níveis variados de expressão de Td-Tomato apesar de 100% de infecção, conforme mostrado pela expressão de GFP, o que indica ativação heterogênea da transcrição de Smad3 dependente de TGF-beta entre as células.A análise de células fixas mostrou novamente 100% de expressão de GFP, enquanto apenas cerca de 26% das células exibiram atividade transcricional detectável de TGF-beta / Smad3 24 horas após a estimulação de TGF-beta sem TGF-beta em comparação com o tratamento com 0% de positividade. No ensaio de cicatrização de feridas, as células MDA-MB-231 infectadas com adenovírus CAGA12-Td-Tomato exibiram comportamento de migração normal e as células tratadas com TGF-beta mostraram maior fechamento da ferida. Notavelmente, cerca de 62% das células na área da ferida apresentaram atividade transcricional Smad3 dependente de TGF-beta positiva, que é significativamente maior do que a observada na área não ferida após o tratamento com TGF-beta.O reagente adenovírus CAGA12-luciferase foi testado em um modelo animal de implante ortotópico de tumor de mama. Tanto o grupo controle quanto o grupo tratado com inibidor beta de TGF demonstraram atividade repórter CAGA12-luciferase semelhante antes do tratamento. No entanto, para o grupo controle, o sinal da luciferase não mudou após o tratamento com PBS, enquanto os camundongos tratados com o inibidor de TGF-beta apresentaram redução de sinal em torno de três vezes.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de uma hora se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que volumes excessivamente altos de adenovírus podem ter efeitos citotóxicos e citopáticos que podem afetar a precisão de seus resultados. Seguindo este procedimento, este sistema pode ser expandido para analisar várias vias de sinalização simultaneamente, a fim de responder a perguntas adicionais relacionadas à diafonia de sinalização celular.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da sinalização de células cancerígenas explorarem o comportamento de progressão tumoral em modelos de câncer de mama.

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Research

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Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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Descrevemos um método para experimentos de depleção-resgate que preserva a integridade celular e a homeostase proteica. A adenofecção permite análises funcionais de proteínas dentro de processos biológicos que dependem de dinâmicas baseadas em actina finamente ajustadas, como divisão celular mitótica e miogênese, no nível de célula única.

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Visualização e Quantificação de TGFβ/BMP/SMAD Sinalizando em diferentes condições de estresse da tesoura de fluidos usando o ensaio de proximidade-ligação-assay

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Viver a imagem latente da pilha do TGF-β/Smad3 sinalização Pathway In Vitro e In Vivo usando um sistema de repórter de adenovírus (Vídeo) | JoVE Journal

Viver a imagem latente da pilha do TGF-β/Smad3 sinalização Pathway In Vitro e In Vivo usando um sistema de repórter de adenovírus

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