Name: Blatt-Spray-Massenspektrometrie: Eine schnelle Ambient Ionisation Technik direkt Metaboliten von Pflanzengewebe bewerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Erfahren Sie Leaf-Spray-Massenspektrometrie zur direkten Analyse von Pflanzengeweben ohne aufwendige Probenaufbereitung. Diese Methode ermöglicht den Nachweis von Alkaloiden und Pestiziden.

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Diese Arbeit wurde von der NSF Plant Genome Research Program Grant IOS-1238812 und Postdoctoral Fellowship in Biologie IOS-1400818 finanziert. Die Arbeit wurde auch durch eine Monsanto Graduate Student Fellowship, Katherine A. Sammons finanziert. Die Fulbright-afrikanische Forscher Scholars Program (2017-2018) ist dankte für Fördermittel zu Nokwanda P. Makunga. Wir schätzen die Spende einer Nanospray Quelle von Jessica Prenni und der Proteomik und Metabolomik-Anlage an der Colorado State University.

1. Änderungen an Nanospray Quelle für Leaf Sprühen MS
<ol><li>Verwenden Sie eine modifizierte Nanospray Quelle für Blatt Spray MS. Da keine fluidischen Komponenten für Blatt Spray MS notwendig sind, ändern Sie die Quelle durch das Entfernen der LC-Sonde aus der Quelle.</li>
	<li>Montieren Sie das Blatt MS spritzdraht, das die Spannung auf das pflanzliche Gewebe mit den entsprechenden Pin zum Einstecken in die Quelle angewendet wird. Löten Sie die Pin an einem Ende ein isolierter Draht; Löten Sie eine Klammer am anderen Ende des Drahtes. Hinweis: Die Klemme (Alligator-Clip-Typ) kann oder haben keine Zähne. Für kleine Gewebe wird eine Klammer ohne Zähne bevorzugt. Ein optionale Flex-Arm mit einer Klammer kann die Nanospray Quelle, bei der Positionierung der Pflanzengewebe hinzugefügt werden. Beachten Sie, dass dieses Protokoll konkret beschreibt wie Blatt-Spray MS auf einem Hybrid Quadrupol Ionenfallen Masse Analysator MS System durchführen (siehe die Tabelle der Materialien); jedoch können andere MS-Systeme geändert werden, um diese Technik6durchführen. Kupplung Blatt-Spray kann MS mit einer tragbaren Massenspektrometer in Echtzeit chemische Analyse vor Ort ohne die Notwendigkeit, das Pflanzenmaterial zu den Labor-19,-20transport durchgeführt werden.</li>
	<li>Positionieren Sie eine antistatische Matte auf dem Boden unterhalb der Quelle, die elektrische Entladung zu reduzieren, die von der Quelle bei hohen Spannungen auftreten.</li>
</ol>2. Vorbereitung des MS System für Blatt-Spray-MS
<ol><li>Wenn das System vor kurzem verwendet wurde, lassen Sie es kühl auf der Haut und entfernen alternative Quelle und der Sweep-Kegel. Befestigen Sie die Nanospray Blatt Spray MS Quelle.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Melodie-Datei mit den entsprechenden Ionisation Parametern wie folgt festgelegt: Mantel, Hilfs- und Sweep-Gas auf 0; die Spray-Spannung, 2 bis 5 kV; die Kapillare Temperatur auf 150-250 ° C; und die S-Objektiv HF-Pegel bis 50. Speichern Sie die Melodie-Datei mit der gewünschten Parameter8,13. Optimieren Sie die Spannung und Temperatur für die besten Ionisation des Gewebes und widerrufen von Interesse. Hinweis: Gute Ausgangspunkte sind 4 kV und 200 ° C.</li>
	<li>Machen Sie eine Methode-Datei einschließlich der Blatt-Spray MS-Melodie-Datei mit: positive und negative vollständige MS; eine Auflösung von 70.000; ein AGC-Ziel von 1 x 106; ein Maximum von 200 ms; und den gewünschten Scan-Bereich m/Z. Alternativ können Sie nur 1 Polarität.</li>
</ol>3. Vorbereitung des Instruments, Lösungsmittel und pflanzliches Gewebe
Hinweis: Immer Handschuhe tragen, und verwenden Sie Pflanzengewebe, die bearbeitet wurden nicht mit bloßen Händen. Andernfalls werden die Verunreinigung Ionen wie Polyethylenglykol Spektren dominieren.
<ol><li>Bringen Sie das Pflanzengewebe für die Analyse in den gleichen Raum wie das MS-System ermöglicht eine schnelle Auswahl.</li>
	<li>Für pflanzliches Gewebe, das nicht natürlich Spitze, eine Rasierklinge auf einen Objektträger zu verwenden, um einen konischen Punkt (Abbildung 2) geschnitten. Bestimmen die Menge des Gewebes benötigt für die Analyse anhand der Instrument-Empfindlichkeit, Gewebetyp und widerrufen von Interesse (z. B., eine junge S. Tortuosum Blatt d. h. ~ 5 mm in der Länge).<ol>
<li>Geschnittenen S. Tortuosum fährt um 10 Wochen nach dem Keimen in dünne Streifen, die jeweils mit einem konischen Ende um einen Punkt zu bilden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie Zange, um sanft das Pflanzengewebe am Ende auszuwählen, die geklemmt werden. Halten Sie das Gewebe mit der Pinzette, sorgfältig auf die Klemme übertragen. Vorsicht: Berühren Sie die Instrument-Quelle nicht, wenn die Spannung auf.</li>
	<li>Anpassen der flexible Arm und den Draht mit der Klemme, das Gewebe im Einklang mit dem MS-Einlass zu positionieren, so dass der Abstand zwischen der Pflanzengewebe und dem Ion-Einlass der MS 5-10 mm für die triple Quadrupol (z.B.TSQ) und linearen Falle Quadrupol (LTQ) und 10 -50 mm für die Ionenfalle Masse Analysator (z.B. Orbitrap)8.<ol>
<li>Stecken Sie das gegenüberliegende Ende des Drahtes in die Quelle. Wenn die ersten Versuche eine niedrige Signalintensität produzieren, bewegen das Pflanzengewebe näher mit dem Ion-Einlass (siehe die Diskussion zur Optimierung).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laden Sie die Datei Methode; Benennen Sie die Datei und legen Sie den Speicherort der Datei. Schalten auf dem MS-System durch klicken, spielen und klicken Sie auf starten , um Erfassung von Daten zu beginnen.</li>
	<li>Wenden Sie ein Lösungsmittel (z.B. Methanol) mit einem Pipettieren mit einer Gel-laden-Spitze, um den Abstand zwischen den Händen und die Hochspannung zum Schutz des Anwenders zu maximieren. Hinweis: Das Lösungsmittel Volumen benötigt, hängt von der Größe, Trockenheit und Textur des Gewebes, in der Regel ~ 2-20 µL. S. Tortuosum Blätter nicht Lösungsmittel hinzugefügt werden benötigen. Auftragen Sie die Lösungsmittel vorsichtig und berühren Sie die Instrument-Quelle nicht, wenn die Spannung auf. Verwenden Sie LC-MS Grade Lösungsmittel und Glaswaren, die Säure gewaschen wurde und ist frei von Reinigungsmitteln. In einigen Geweben kann ein Signal ohne Zugabe eines Lösungsmittels aufgrund der natürlichen Wassergehalt von Pflanzengewebe beobachtet werden. Jedoch wird eine höhere Signalintensität und reduzierten S/N in der Regel durch die Anwendung eines Lösungsmittels des Gewebes erreicht.</li>
	<li>Daten zu erwerben, solange das Signal anhält oder bis die angemessene Spektren gesammelt haben, in der Regel 30-60 s. Bei Bedarf wenden Sie zusätzliche Lösungsmittel um eine hohe Signalintensität für einen längeren Zeitraum hinweg beizubehalten. Die Datenerfassung zu stoppen und Anhalten der MS-System.</li>
	<li>Entfernen Sie das Gewebe zu und waschen Sie die Klammer mit 100 % Methanol und einem fusselfreien Tuch. Reinigen Sie den MS Ion Einlass nach ca. 1-2 h des Erwerbs Blatt Spray MS nach Vorgaben des Herstellers. Reinigen Sie auch den MS Ion Einlass zwischen Analysen der verschiedenen Gewebetypen.</li>
</ol>4. Data Quality Assessment
<ol><li>Öffnen Sie die Datendatei und Sichtprüfung der Basis Peak mass Chronogramm. Überprüfen Sie, dass die Signalintensität ~1.0 X 107 bis 5,0 x 108. Wenn das Signal niedriger ist, verschieben Sie das Gewebe näher mit dem Ion-Einlass. Wenn höher, das vordere Ende des MS System verschmutzt wird, so bewegen Sie das Gewebe weiter von den Ionen-Einlass.</li>
	<li>Basierend auf das Vorhandensein oder Fehlen der Ionen des Interesses an der Massenspektren produziert, die Parameter verändert. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>(5) Tandem Mass Fragmentierung
<ol><li>Entscheiden Sie, was Ionen sind von Interesse für die Tandem-Massen-Fragmentierung (MS/MS); ein Massenspektren Signal, dass > 1,0 x 105 ist ausreichend für die Auswahl von Ionen für MS/MS.</li>
	<li>Machen Sie eine neue Methode-Datei mit einer Aufnahmeliste m/Z , auf 4 Dezimalstellen. Klicken Sie auf globale Listen und Aufnahme. Wählen Sie unter Eigenschaften von PRM, die Fragmentierung Energie [z.B.normalisierte Aufprallenergie (NCE) von 30-50 ist eine gute Auswahl zu] und andere MS/MS-Parameter.<ol>
<li>MS/MS-Daten für Mesembrine Alkaloide erhalten, fragment der folgenden Ionen, 276.1583 m/Z, 290.1742 m/Z, und 292.1897 m/Zbei NCE 35. Hinweis: MS/MS-Datenerfassung kann unmittelbar nach der MS oder zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden. Das gleiche Gewebe kann oft nach einer vollen MS eingespannten bleiben und kann wiederverwendet werden, um MS/MS-Daten zu erfassen. Wenn jedoch eine Neulackierung kein ausreichendes Signal zur Verfügung stellt, nutzen Sie ein neues Gewebe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die MS/MS-Methode-Datei und eine benannte Datei zu laden. Schalten Sie die MS-System, und starten Sie Datenerfassung, Lösungsmittel hinzufügen, wenn nötig. Wenn ausreichende Spektren gesammelt wurden, in der Regel nach 30-60 s, stoppen Sie den Erwerb.</li>
	<li>Zersplitterung in viele unterschiedliche Energien zu sammeln, bei der Zuweisung von Fragment-Ionen. Hinweis: Da Blatt Spray MS eine chromatographische Trennung fehlt, die Fragmentierung Spektren sind wahrscheinlich viele Ionen enthalten, und Fragmentierung bei verschiedenen Energien helfen Klarheit zu bringen.</li>
</ol>(6) vermeintlichen Identifikationen durch genaue Masse und Tandem Mass Fragmentierung
<ol><li>Machen Sie vermeintliche Identifikationen durch Verweis auf präzise massenmessungen von öffentlich zugänglichen Metabolit Datenbanken wie z. B. Metlin21, menschliche Metabolom Datenbank22, Masse Bank23, Lipid-Karten24, National Institute of Standards und Technologie MS suchen25, Respekt für sekundäre Pflanzenstoffe26oder festzulegenden27.</li>
	<li>Da diese Datenbanken nicht erschöpfend sind, führen Sie eine zusätzliche Literaturrecherche auf die Pflanzenarten, die chemisch charakterisiert wie nötig.</li>
	<li>Spiel Fragmentierung Ionen aus Blatt Sprühen MS/MS, zu den oben genannten Datenbanken Wenn MS/MS-Informationen verfügbar sind, oder der Literatur. Alternativ können Sie eine manuelle Interpretation der MS/MS-Fragment-Ionen oder eine Fragmentierung eines authentischen Standards durch die Direkteinspritzung oder LC-MS/MS durchgeführt.</li>
</ol>7. die Datenanalyse
<ol><li>Konvertieren Sie die raw-Dateien von MS in MzXML Dateien mit dem MsConvert-Tool von Proteowizard28.</li>
	<li>Verwenden Sie die XCMS-Software-Paket in R für Peak Picking implementiert. Verwenden Sie eine direkte Infusion Verarbeitungsmethode für das Blatt-Spray MS-Analyse. Hinweis: Gut kommentierte für die Datenverarbeitung verwendeten Skripte finden Sie auf https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.</li>
	<li>Um semi-quantitative Messungen, Buchhaltung für die experimentelle Variabilität, Normalisieren Sie die Intensität der einzelnen Metaboliten durch die gesamte Ionenstrom (TIC) als MS Signalintensität variieren kann, teilweise durch leichte Abweichungen bei der Positionierung der Blatt-spray das Blatt in die Quelle und die Unterschiede in Blattform und Größe.</li>
	<li>Alternativ können Sie Hersteller bereitgestellten Software für die Datenanalyse oder MZmine2 (bei http://mzmine.github.io/ gefunden werden)29.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls stützt sich auf die Optimierung der verschiedenen Schritte für die Pflanzenarten, Gewebetyp und Ziel widerrufen von Interesse. Im Protokoll beschriebenen Parameter bieten einen guten Ausgangspunkt dar. Die folgenden experimentellen Entscheidungen müssen hergestellt und getestet werden: ob zu verwenden (1) Schnitt oder ungeschnitten Gewebe und Lösungsmittel (2) keine Lösungsmittel, (3) welche Lösungsmittel zu verwenden und in welchem Volumen (4) was die Entfernung von Gewebe au...

Pflanzen enthalten eine Vielzahl von kleinen Molekülen mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften. MS ist eine leistungsfähige Technik für Pflanzenstoffe zu analysieren, da es elementare Kompositionen eine hohe Sensitivität und Spezifität für die Detektion und Identifizierung von Metaboliten1verschaffen kann. Am häufigsten wird MS auf Lösungsmittel extrahierte Proben durchgeführt, die durch Chromatographie vor MS Analysis1getrennt sind. Jedoch der Flüssigchromatographie (LC) langen Analysenzeiten benötigt und ist oft verbunden mit einem umfangreichen Probe Vorbereitung1. Im Gegensatz dazu ist direkte chemische Analyse von intakten Gewebe, die Chromatographie umgeht eine sehr schnelle Technik, minimales Beispiel Vorbereitung2erfordern. In Fällen wo chromatographische Schritte verzichtet werden können, kann somit eine direkte chemische Analyse sehr vorteilhaft sein.
Typische LC-MS für natürliche Produkte und Metabolomics-Forschung stützt sich auf langwierige Bulk Extraktionen von getrockneten oder gefrorenen Pflanzenmaterial, enthält mehrere Gewebe und Zelle Arten3. Alternativ kann direkte chemische Analyse, wie die MS-Detektion von Metaboliten von Pflanzengewebe, Zelltypen zu isolieren und Vorbereitung Artefakte4vermeiden. Blatt-Spray MS, auch bezeichnet als Gewebe-Spray5,6, ist eine direkte ambient Ionisation MS-Technik, die im wesentlichen keine Probe Vorbereitung5,7erfordert. Blatt-Spray, die MS auf Papier Spray MS, eine ambient Ionisation Technik mit Merkmalen der Elektrospray-Ionisation verwandt ist, die für die Erkennung von Analyten ermöglicht, die auf Papier7abgelegt werden. Trotz des Namens Blatt Spray MS ist für verschiedene Arten von Pflanzengewebe, nicht nur Blätter und wurde auf Obst, Samen, Wurzeln, floral Gewebe und Knollen unter anderem6,8,9, demonstriert 10,11,12. Die Technik erleichtert die Ionisierung der endogenen Phytochemicals direkt aus pflanzlichen Stoffen in das Massenspektrometer für Erkennung8. Blatt-Spray MS bieten auch Informationen über die räumliche Verteilung der Chemikalien in verschiedenen Gewebetypen in Pflanzen13. Wenn Blatt Spray MS mit solvent-Extraktion und LC-MS verglichen wird, deuten die Ergebnisse Blatt-Spray, die MS für die schnelle Erkennung von Oberfläche Metaboliten von einzigartigen Zelltypen wie Trichome13ermöglicht. Abbildung 1 zeigt den Blatt Spray MS Versuchsaufbau. Direkte Elektrospray-Ionisation tritt nach nur geringfügigen Quelle Änderungen. Liegt eine hohe Spannung auf das pflanzliche Gewebe über eine Metallklammer, produzieren einen Spray von hoch geladenen Tröpfchen bilden einen Taylor-Kegel, der trägt die Ionen mit dem Ion-Einlass der MS. Electrospray Ionisierung tritt aus der natürlichen Flüssigkeit der Pflanze oder vom Lösungsmittel appl IED auf der Pflanzenoberfläche. Eine Spitze auf das Gewebe der Elektrospray erleichtert und kann natürlich vorkommende oder geschaffene durch Schneiden.
Blatt-Spray MS ist eine schnelle Methode für die semi-quantitative und qualitative Analyse der intakten Pflanzengewebe, die Dienstprogramm für vielfältige Anwendungen gefunden haben. Zum Beispiel wurde die Technik zur endogene Verbindungen, verwandte Arten zu unterscheiden und auch zu Änderungen in der gleichen Spezies, die unter verschiedenen Bedingungen gewachsen bewerten zu erkennen. Frühere Studien haben hierbei gezeigt, durch die Messung der Metaboliten in Beautyberry (Callicarpa L.) 12 und amerikanischer Ginseng (Panax Quinquefolium L.) 6. im zweiten Beispiel, ginsenoside, Aminosäuren und Oligosaccharide konnte nach Benetzung rohes Ginseng Gewebe nachgewiesen werden. Wilde und kultivierte amerikanischer Ginseng wurden von Knolle Scheiben6differenziert. Ginseng Knolle Integrität blieb nachfolgenden Blatt Spray MS, die für eine anschließende morphologische und mikroskopische Prüfung6erlaubt. Darüber hinaus können auch exogene Verbindungen auf Pflanzenproben nachgewiesen werden. Eine Reihe von Pestiziden (Acetamiprid, Diphenylamine, Imazalil, Linuron und Thiabendazol) wurden auf Schale und Fruchtfleisch von Obst und Gemüse9gefunden. Während diese Studien und viele andere das Dienstprogramm Blatt Spray MS für verschiedene spezifische Zwecke gezeigt haben, hat ein detailliertes Protokoll bisher nicht gemeldet.
Die Protokollbeschreibung wird hier nicht auf die Optimierung der Methode für eine bestimmte Gewebe oder zusammengesetzte konzentrieren. Vielmehr wird die Erkennung von Mesembrine Alkaloide von Sceletium Tortuosum (L.) N.E.Br. (Mittagsblumengewächsen) als Beispiel verwendet, um notwendigen Optimierungsmaßnahmen besprechen, die getroffen werden sollten, wenn Sie ein Blatt Spray MS Experiment für eine Art Gewebe, einrichten oder zum ersten Mal widerrufen. S. Tortuosum ist eine saftige endemisch in der semi-ariden Karroo-Region in Südafrika. Eine traditionelle Medizin der San und Khoi Khoi Völker, es diente für Appetit und Durst Unterdrückung sowie die psychotropen und analgetische Effekte14,15. Derzeit sind standardisierte Extrakte für die Behandlung von neuropsychiatrischen und neuropsychologischen Störungen16,17verwendet. Die primäre Verbindungen des Interesses enthalten das Alkaloid Mesembrine und seine Derivate, von die viele auch in verwandten Sceletium Arten15gefunden werden. Wilde und kultivierte Populationen von S. Tortuosum haben Variable Konzentrationen der Mesembrine Alkaloide, damit eine Qualitätskontrolle Herausforderung18präsentieren. Eine Methode für die schnelle Erkennung von Mesembrine Alkaloide, wie Blatt-Spray MS, kann bei der Überwachung der Sceletium Produkte hilfreich sein. Denn bisher es keine detaillierte visuelle experimentelles Protokoll für das Blatt-Spray MS Technik gab, wir zeigen die Methode am Beispiel von S. Tortuosumund Folgendes beschrieben: die Änderung einer Nanospray-Quelle, die Auswahl und Vorbereitung von Pflanzengewebe, die Erfassung der Daten, die Interpretation der Ergebnisse und die Optimierung der MS-Parameter.

<table><tbody><tr><td>Conn Pin</td><td>Digi-Key Elctronics</td><td>WM2563CT-ND</td><td>Pin wird in die Thermo Scientific Quelle eingesetzt, um Spannung zu liefern</td></tr><tr><td>kleine Klemme</td><td>Digi-Key Elctronics</td><td>314-1018-ND</td><td>CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A</td></tr><tr><td>große Klemme</td><td>Digi-Key Elctronics</td><td>290-1951-ND</td><td>KROKODILKLEMME SCHMAL NICKEL 5A</td></tr><tr><td>Schrumpfschlauch</td><td>Digi-Key Elctronics</td><td>Q2Z1-KIT-ND</td><td>zu Abdeckung Lötstellen</td></tr><tr><td>NSI-Quelle Nanospray Ionenquelle</td><td>Thermo scientific</td><td>NA</td><td>Eine andere Marke funktioniert, wenn Sie kein Thermo-Instrument</td></tr><tr><td>verwenden Q Exactive- Hybrid-Quadrupol Orbitrap</td><td>Thermo scientific</td><td>NA</td><td>Eine andere Marke funktioniert, wenn Sie kein Thermo-Instrument verwenden</td></tr><tr><td>Tune Software</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>Eine andere Marke funktioniert, wenn Sie kein Thermo-Instrument verwenden</td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>Thermowissenschaftliche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pflanze von Interesse - S. tortousum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

blatt-spray-massenspektrometrie: eine schnelle ambient ionisation technik direkt metaboliten von pflanzengewebe bewerten

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Pflanzen produzieren Tausende von kleinen Molekülen, die in ihren chemischen Eigenschaften unterschiedlich sind. Massenspektrometrie (MS) ist eine leistungsfähige Technik für Pflanze Metaboliten zu analysieren, denn es Molmassen mit hoher Sensitivität und Spezifität bietet. Blatt-Spray MS ist eine ambient Ionisation Technik wo Pflanzengewebe für direkte chemische Analyse über Elektrospray, Beseitigung von Chromatographie aus dem Prozess verwendet. Dieser Ansatz zur Probenahme Metaboliten ermöglicht eine Vielzahl von chemischen Klassen gleichzeitig von intakten Pflanzengewebe, Minimierung der Menge der Probenvorbereitung erforderlich erkannt werden. Bei Verwendung mit einem hochauflösenden, genaue Masse MS erleichtert Blatt Spray MS den Schnellnachweis von Metaboliten von Interesse. Es ist auch möglich, tandem mass Fragmentierung Datensammlung mit dieser Technik um eine zusammengesetzte Identifizierung zu erleichtern. Die Kombination aus präzise massenmessungen und Fragmentierung ist vorteilhaft bei der Bestätigung zusammengesetzte Identitäten. Das Blatt-Spray MS Technik erfordert nur geringfügige Änderungen Nanospray Ionisierung Quelle und ist ein nützliches Werkzeug zum Ausbau der Fähigkeiten eines Massenspektrometers. Hier wird frisches Blattgewebe aus Sceletium Tortuosum (Mittagsblumengewächsen), eine traditionelle Heilpflanze aus Südafrika, analysiert; zahlreiche Mesembrine Alkaloide werden mit Blatt-Spray MS erkannt.

Bei 10 Wochen nach dem Keimen, frisch gesammelten Gewächshaus gewachsen S. Tortuosum Blätter wurden von Blatt Spray MS analysiert. Die experimentelle Workflow zum Nachweis von Metaboliten von S. Tortuosum verlässt mit Blatt-Spray, die MS in Abbildung 2dargestellt ist. Ein Blatt wurde ausgewählt, schneiden Sie in einen dünnen Streifen mit einem konischen Ende um einen Punkt zu bilden und mit dem Blatt-Spray MS Draht Clamp Vorrichtung eingespa...

Blatt-Spray-Massenspektrometrie ist eine direkte chemische Analyse-Technik, die minimiert die Probenvorbereitung und beseitigt Chromatographie, so dass für die schnelle Erkennung von kleinen Molekülen von Pflanzengewebe.

Blatt-Spray-Massenspektrometrie: Eine schnelle Ambient Ionisation Technik direkt Metaboliten von Pflanzengewebe bewerten

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Leaf Spray MS ist eine schnelle Methode zur qualitativen und semiquantitativen Analyse von intaktem Pflanzengewebe, die eine Vielzahl von Anwendungen hat. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass pflanzliches Gewebe direkt analysiert werden kann, ohne dass eine Probenvorbereitung erforderlich ist. Diese Methode bietet zwar gute Einblicke in die Mesembrinalkaloide aus Sceletium, kann aber auch für die Analyse verschiedener anderer Pflanzenarten und exogener Chemikalien wie Pestizide verwendet werden.Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können eine Herausforderung darstellen, da es notwendig ist, das Protokoll für jede Pflanzenart, jeden Gewebetyp und jede Verbindung von Interesse zu optimieren. Verwenden Sie eine modifizierte Nano-Sprühquelle für Blattspray MS.As keine fluidischen Komponenten für Blattsprüh-MS erforderlich sind, modifizieren Sie die Quelle, indem Sie die Flüssigkeitschromatographiesonde von der Quelle entfernen. Der Blattsprüh-Massenspektrometrie-Draht, der eine Spannung an das Pflanzengewebe anlegt, hat an einem Ende einen Stift, der mit dem Draht verlötet wurde, und eine Klemme, die am anderen Ende gelötet wurde.Wenn das System kürzlich in Betrieb war, lassen Sie es abkühlen, bevor Sie eine alternative Quelle im Sweep-Konus entfernen. Befestigen Sie dann das Nanospray Leaf Spray MS-Quelle. Erstellen Sie abschließend eine Tune-Datei und eine Methodendatei, wie im Textprotokoll beschrieben.Tragen Sie immer Handschuhe und verwenden Sie kein Pflanzengewebe, das mit bloßen Händen angefasst wurde. Andernfalls dominieren Verunreinigungsionen wie Polyethylenglykol die Spektren. Bringen Sie das Pflanzengewebe für die Analyse in den gleichen Raum wie das Massenspektrometriesystem, um eine schnelle Probenahme zu ermöglichen.Bei Pflanzengewebe, das keine von Natur aus spitze Spitze hat, verwende eine Rasierklinge auf einem Objektträger, um eine spitz zulaufende Spitze zu schneiden. Schneiden Sie die Blätter von Sceletium tortuosum 10 Wochen nach der Keimung in dünne Streifen mit jeweils einem spitz zulaufenden Ende, um eine Spitze zu bilden. Wählen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Pflanzengewebe am Ende aus, das eingespannt werden soll.Halten Sie das Gewebe mit einer Pinzette fest und übertragen Sie es vorsichtig in die Klemme. Stellen Sie den flexiblen Arm und den Draht mit der Klemme ein, um das Gewebe in einer Linie mit dem MS-Einlass zu positionieren. Im Text finden Sie den optimalen Abstand vom Ioneneintritt für jedes spezifische Massenspektrometer.Erzeugen die ersten Versuche eine geringe Signalintensität, kann das Pflanzengewebe näher an den Ioneneingang gerückt werden. Laden Sie die Methodendatei. Benennen Sie die Datendatei und legen Sie den Speicherort der Datei fest.Schalten Sie dann das MS-System ein, indem Sie auf Play und dann auf Start klicken, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Tragen Sie ein Lösungsmittel mit einer Pipette mit einer Gelladespitze auf, um den Abstand zwischen der Hochspannung und den Händen des Benutzers zum Schutz zu maximieren. Erfassen Sie Daten, solange das Signal anhält oder bis die entsprechenden Spektren erfasst wurden, in der Regel 30 bis 60 Sekunden.Stoppen Sie die Datenerfassung und pausieren Sie das MS-System. Entfernen Sie nach der Aufnahme das Taschentuch und waschen Sie die Klemme mit 100%Methanol in einem fusselfreien Tuch. Öffnen Sie die Datendatei, und überprüfen Sie das Chronogramm der Basis-Spitzenmasse visuell.Überprüfen Sie, ob die Signalintensität etwa 10 Millionen bis 500 Millionen beträgt. Erstellen Sie eine neue Methodendatei mit einer Einschlussliste von M über Z bis zu vier Dezimalstellen. Klicken Sie auf globale Listen und Inklusion.Wählen Sie unter Eigenschaften von PRM die Fragmentierungsenergie und andere Tandem-MS-Parameter aus. Um die Tandem-MS-Daten für Mesembrinalkaloide zu erhalten, fragmentieren Sie die Ionen bei 276,1583 M über Z, 290,1742 M über Z und 292,1897 M über Z bei einer normierten Kollisionsenergie von 35. Laden Sie als Nächstes die Tandem-MS-Methodendatei und eine benannte Datendatei.Schalten Sie das MS-System ein und beginnen Sie mit der Datenerfassung, indem Sie bei Bedarf ein Lösungsmittel hinzufügen. Wenn ausreichende Spektren gesammelt wurden, in der Regel nach 30 bis 60 Sekunden, stoppen Sie die Erfassung. Führen Sie die Datenanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben.Repräsentative Ergebnisse der metabolischen Profilierung von Sceletium tortuosum mittels Blattspray-MS und positiver Ionisation sind mit einem Ausschnitt von 260 bis 295 M über Z.In dieser Studie wurden insgesamt neun Mesembrinalkaloide durch Blattspray-MS nachgewiesen und puditive Identifizierungen vorgenommen. Das Massenchronogramm der Blattspray-MS stellt ein erfolgreiches Blattspray-MS-Experiment dar, bei dem ein stabiles Signal über die gesamte Dauer der Aufnahme aufrechterhalten wurde. Für jeden Peak ist die obere Zahl die Zeit in Minuten und die untere die M über Z. Tandem-Massenspektren wurden in positiver Ionisation aus einem Sceletium tortuosum geschnittenen Blatt mit Blattspray MS gesammelt. Die öffentliche Identifizierung der Alkaloide erfolgte durch genaue Massen- und Massenfragmentierung für Mesembrin M und Mesembrenon M Isomere, Mesembrin und Mesembrin M Dihydro.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Blattspray MS zum Nachweis von Pflanzenmetaboliten verwenden können. Das Blattspray MS wird verwendet, um sowohl endogene Verbindungen als auch exogene Verbindungen wie Pestizide nachzuweisen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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