Name: Amostragem e tratamento prévio de esmalte do dente carbonato de carbono estável e análise de isótopos de oxigênio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda amostragem sequencial de esmalte dental para análise de isótopos estáveis de carbono e oxigênio em arqueologia e paleontologia. Este método não destrutivo reconstrói dietas e ambientes passados.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer a sociedade Max Planck para o financiamento desta pesquisa, bem como a recente configuração acima de um laboratório de isótopos estáveis no departamento de arqueologia, Instituto Max Planck para a ciência da história humana.

O seguinte protocolo segue as diretrizes do laboratório de espectrometria de massa de isótopo luz no Instituto Max Planck para a ciência da história humana. Permissões de ética adequado dos comitês nacionais e internacionais devem ser procuradas para análises envolvendo ameaçadas modernos ou históricos de espécimes da fauna e para a utilização de material arqueológico e da fauna de interesse para as partes interessadas contemporâneas . Neste trabalho, as amostras utilizadas foram encontrados fósseis e arqueológicos. Não há seres humanos vivos foram utilizados neste estudo e éticas, institucionais e governamentais permissões tem sido adquiridas para qualquer análise destrutiva.
1. volume de amostragem
Nota: Para os seres humanos e animais, o método básico de granel dente esmalte amostragem é a aplicação de uma broca para a borda bucal do dente.
<ol><li>Limpe a superfície externa do dente (~0.1 mm) usando um tiro blaster de alumínio ou por abrasão suave usando a instalação de broca. Use uma broca Hand-Held com uma limpo com ponta de diamante broca (veja abaixo), da mesmo forma, ligada através de um mandril para a afinação de broca. Certifique-se de que a abrasão gentil e até mesmo é executada como uma ranhura paralela ao eixo de crescimento inteira (Figura 1 e Figura 2).</li>
	<li>Tente, sempre que possível, ao aplicar o método para a mesma porção de dente para cada ser humano ou animal amostrado. Nota: Na pesquisa da paleodietary humana, terceiros molares são geralmente favorecidos como representante de tarde juvenil/adulto dieta enquanto primeiros molares são evitados devido à desmama efeitos23. O dente preferencial para cada táxon e o período de vida representada, irá variar com as amostras disponíveis e pergunta sob estudo.</li>
	<li>Broca em um local bem ventilado, enquanto usava uma máscara para evitar a inalação do pó de esmalte do dente. Use óculos de protecção para proteger os olhos. Esteja ciente de que a quantidade de pó de amostra perfurado irá variar dependendo do equipamento utilizado para análise, protocolo de pré-tratamento e tamanho do dente. Perfurar a baixa velocidade para evitar o aquecimento da amostra. Nota: Aproximadamente, 4-8 mg de pó de amostra é uma meta apropriada para múltiplas análises usando um sistema de preparação e introdução de gás on-line para espectrometria de massa de razão isotópica e testes LGMA. Esteja ciente de que a velocidade da broca escolhida dependerá a fragilidade da amostra e exigirá algum nível de tentativa e erro. Em geral, uma broca Hand-Held, duas de cinco barras de força são suficientes. Perfurar o pó de dente sobre um pedaço de papel alumínio limpo ou papel de pesagem.</li>
	<li>Recolher o pó resultante do esmalte e transferi-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que tem sido tarado num equilíbrio adequadamente exato antes da perfuração. Etiquete cada tubo com a designação de amostra (Figura 3). Registre o peso de números e esmalte de amostra em um caderno de laboratório, bem como um banco de dados eletrônico.</li>
	<li>Antes de perfurar cada dente novo, limpe os bocados de broca utilizada primeiro usando 0,5 M de HCl em um tecido robusto. Em seguida, lave o bocado de broca com um solvente orgânico (tais como acetona, metanol ou etanol) usando um tecido robusto.</li>
	<li>Seguindo uma perfuração sentado, limpe a área de trabalho completamente usando um dedicado aspirador, ou uma vassoura e. Limpe o espaço de amostragem com metanol. Vácuo ou pulverizar levemente a broca com ar comprimido para remover poeira e amostra em pó entre as amostras.</li>
</ol>2. sequencial amostragem
Nota: Amostragem sequencial pode ser abordada em uma variedade de formas e dependerá do táxon ser amostrado, o tamanho do dente, bem como a resolução temporal desejada.
<ol><li>Limpe a superfície do dente sendo amostrado removendo uma muito fina camada (~0.1 mm) do esmalte do dente exterior.</li>
	<li>As amostras ao longo da superfície bucal perpendicular ao eixo de crescimento do dente, fugindo da junção de raiz de esmalte para o topo da coroa da broca. Broca faixas horizontais perpendiculares ao eixo de crescimento, com cada amostra, resultando em um sulco de largura de 1-2 mm em toda a camada de esmalte (Figura 1 e Figura 4). Tome cuidado para evitar perfuração através do esmalte em dentina como ele iria contaminar a amostra e a medida resultante. Nota: O número de amostras colhidas irá variar dependendo da resolução desejada, mas c. 10 representa uma meta apropriada para estudar as mudanças sazonais em δ13C e valores de18O δ para um hypsodont do tamanho de gado domesticado.</li>
	<li>Escolha a broca adequada para cada amostra, como a largura da linha de amostragem é determinada pelo diâmetro da broca.</li>
	<li>Usar uma configuração de equipamento para dentes mais delicados que requerem um maior número de amostras elementares (Figura 2) (EG., dentes humanos), bem como para perfuração mais estável. Configure o suporte de equipamento que mantém a broca firmemente, com a broca a apontar para baixo. Nota: Enquanto quatro amostras podem ser facilmente obtidas um molar humano permanente usando uma abordagem à mão24, amostragem mais refinada requer um equipamento ou CO2 abordagem de ablação do laser que não serão discutidos aqui14. Outra abordagem comum é usar um semi-automático microsampling25.</li>
	<li>Segure o dente ou anexar a uma pinça. Pressione o esmalte do dente contra a broca e aplique pressão. As amostras são perfuradas incrementalmente ao longo da superfície bucal partir do ápice (superfície oclusal) para a base da coroa no local da junção esmalte-raiz (ERJ). Replica a mesma amostra estratégia várias vezes cada consecutivos linha paralela à linha de amostra anterior de perfuração de perfuração. Use uma broca de diamante cilíndrico pequeno para dentes delicados, tais como molares de ovelha, com um diâmetro de 1 mm (Figura 1).</li>
	<li>Medir a distância de cada linha de amostragem do ERJ usando pinças e gravar essa distância para comparação.</li>
	<li>Siga as etapas 1.3-1.6 acima. Nota: Se dentes pequenos, delicados estão sendo analisados e métodos de verificação de pré-tratamento e LGMA não são aplicados, amostras tão pequenas quanto 1-4 mg irão produzir resultados fiáveis em uma afinação de preparação e introdução de gás on-line para análise de carbonato. Modificado sistemas automatizados-periférico podem facilitar o uso de pesos de amostra ainda mais baixos, mas são inevitavelmente limitados pela proporção de carbonato na esmalte estudados (4 a 5% em peso)26,27. Os investigadores devem consultar o laboratório onde as amostras são vai ser medido para determinar a quantidade de amostra necessária.</li>
</ol>3. método de Fourier reflectância Total infravermelho transformar do espectrometria/atenuada
<ol><li>Para o método de reflectância Total atenuada, estabelecer um fundo de câmara de amostra, ou sob vácuo ou em condições atmosféricas normais.</li>
	<li>Coloque aproximadamente 1 mg de esmalte do dente sobre o cristal de diamante na câmara de amostra usando uma espátula. Baixe e fixe o post da amostra até que haja uma conexão firme entre o post, a amostra e a placa de diamante. Feche a câmara de amostra, com ou sem um vácuo a ser criada, dependendo da configuração ou disponibilidade.</li>
	<li>Medir os espectros FTIR da amostra 64 vezes para o número de onda variando entre 400 e 4.000 cm-1. O número desejado de repetições irá variar com base nos objetivos do estudo, embora a análise de três repetições, idealmente com alíquotas diferentes sendo tomadas e depois voltou para o tubo de microcentrifugadora habitação a amostra, irá garantir resultados robustos.</li>
	<li>Limpe a espátula com metanol entre cada alíquota e entre cada amostra.</li>
	<li>Realize uma correção de linha de base usando o software disponível. O software automaticamente subtrai o fundo de câmara de amostra do perfil de FTIR resultante. Para garantir melhor reprodutibilidade, só esmalte espectros com uma absorvância mínimo de 0,06 para a maior banda de fosfato em ~cm 1035-1 devem ter em conta.</li>
	<li>Monitore a presença da calcita de carbonato secundário contaminante comum em todas as amostras, verificando para um pico em 711 cm-1.</li>
	<li>Após a análise, cuidadosamente retornar as amostras de seus tubos microcentrifuga usando um dispositivo de aspiração ou espátula e levar para a próxima etapa do pré-tratamento ou análise.</li>
	<li>Exportar os dados brutos do comprimento de onda e intensidade, como um arquivo. csv (ou similar) e usar para calcular os índices de interesse (índices comumente usados incluem A-site índice de fosfato, B-site índice de fosfato, fosfato, índice de cristalinidade, água-Amida no índice de fosfato, e CO3/PO4 índice17,18,19) (tabela 1).</li>
	<li>Comparar o FTIR resultados de amostras as fóssil ou arqueológicas para crescendo datasets do esmalte do dente da fauna moderna agora disponível na literatura19,20 para determinar a natureza e a extensão da alteração LGMA para o esmalte amostrado.</li>
</ol>4. pré-tratamento ácido acético simples (0,1 M)
<ol><li>Pese o pó de esmalte para cada amostra em um tubo de microcentrifugadora usando um equilíbrio conforme apropriado. Rotule o tubo adequadamente. Esmalte pó deve ser terreno no mesmo grau, com partículas de um tamanho similar. Nota: Muitos pesquisadores utilizam um agente oxidante, tais como o descorante diluído (NaClO) ou 30% peróxido de hidrogênio (H2O2) para remover os produtos orgânicos de uma amostra e isto deve ser adicionado neste ponto. Não só podem estes reagentes alteram o carbono estável e valores de isótopos de oxigênio de uma amostra, porém, espectros de amostras de colágeno ósseo em um sistema de preparação e introdução de gás on-line demonstram que o ácido fosfórico 100% utilizado em carbonato medição não reage com amostras orgânicas (Figura 5), sugerindo que este passo é desnecessário.</li>
	<li>Adicione 0,1 mL de 0,1 M de ácido acético (por 1 mg de esmalte) para cada amostra com uma pipeta. Evite tocar as amostras com a pipeta. Se a amostra e a pipeta entram em contato, use uma pipeta de nova para a próxima amostra para evitar a contaminação cruzada.</li>
	<li>Agitar, por meio de agitação ou um agitador eletrônico (Figura 3) e depois deixar as amostras durante 10 min. do pó de esmalte não deve ser deixado em ácido acético por um período prolongado de tempo ao (> 4 h).</li>
	<li>Coloca as amostras em microcentrifuga por 2 min a 13.700 x g. Nota: Uma alternativa de baixo custo é a utilização de uma mini centrífuga para 4 min a 3.500 x g, que detém menos de amostras, mas é menos demorado ao lidar com conjuntos de amostra grande.</li>
	<li>Quando o programa microcentrifuga para, substitua o ácido acético com 2 mL de água ultrapura, usando uma pipeta limpa, então microcentrifuga as amostras por 2 min a 13.700 x g.</li>
	<li>Mudar a água ultrapura mais duas vezes, como antes e testar a neutralidade. Remova o fluido restante usando uma pipeta (sem perturbar o sobrenadante). Nota: Um total de três lavagens com água ultrapura é o procedimento padrão para obter a neutralidade. A amostra deve ser lavada até neutralidade é alcançada.</li>
	<li>Cortar folhas de Parafilm (1 cm x 1 cm) e coloque sobre cada tubo de microcentrifugadora. Faça um pequeno furo no centro usando um objeto afiado, de modo que a amostra seca adequadamente.</li>
	<li>Coloque os tubos em um congelamento mais seco para remover qualquer fluido remanescente. Nota: Se um congelamento mais seco não é disponível, gentil o forno de secagem (40 ° C) também é uma possibilidade e não deve ter quaisquer efeitos adversos sobre o carbono estável e dados de isótopos de oxigênio.</li>
	<li>Uma vez seco, remova o Parafilm e feche as tampas microcentrifuga. Certifique-se que a rotulagem do tubo está correto e re-escrever se necessário. Nota: Esta é a fase final antes do armazenamento para a pesagem de fora, que em laboratórios com fundos limitados pode ser o último estágio antes da distribuição das amostras para análise em outro lugar.</li>
</ol>5. pesagem e medição de amostras e padrões
<ol><li>Usando uma espátula, pese cerca de 2 mg de pó de esmalte sobre um disco de estanho em um equilíbrio sensível a 0,001 mg (Figura 6). Então cuidadosamente transferi a amostra para um frasco de vidro borosilicato resistente a ácido fosfórico. Essa quantidade de esmalte é necessária para produzir resultados fiáveis devido a proporção relativamente pequena de carbonato no esmalte do dente.</li>
	<li>Limpar a espátula entre amostras usando metanol e usar um disco limpo ou pesando navio para cada amostra.</li>
	<li>Pese 0,2 mg de uma norma internacional, tais como a AIEA NBS18, AIEA 603, AIEA CO8 ou Merck CaCO3. Uma norma interna feita de esmalte homogeneizado de um dente grande pode ser usada como bem20. Para uma execução completa de 76 amostras e padrões, 61 amostras de uso e 15 normas, que devem ser uniformemente distribuídas por toda a corrida. Vários estudos têm relatado números adequados de normas e detalhes em pesquisa arqueológica20,28. Nota: O repetido tratamento prévio e análise de um esmalte no padrão de casa, através de um número de pistas de amostras arqueológicas, também é susceptível de fornecer uma medida adequada de precisão para as amostras estudadas20.</li>
	<li>Aperte as tampas especialmente projetados, acessíveis para a agulha até o septo é apertado mas não sugado para dentro do frasco. Não aperte a tampa como a pressão sobre o septo ficará muito forte e, finalmente, pode resultar em uma agulha quebrada durante a análise. Colocar os frascos em uma ordem listada dentro de um bloco de aquecimento a 70 ° C. A ordem e os pesos das amostras devem ser registados confiantemente de entrada para o software de computador.</li>
	<li>Medir as amostras seguindo três etapas: 1) nivelado encha as amostras com hélio puro, 2) Adicionar o ácido fosfórico, 3) medir a amostra.<ol>
<li>Lave as amostras com hélio puro (grau 5.0) com um fluxo de 100 mL/min para 5 min retirar o ar ambiente.</li>
		<li>Adicionar 4-5 gotas de ácido fosfórico (99%, densidade 1,85 g/mL) para a amostra contendo carbonato. Começa a reação entre a amostra e H3PO4 . Durante a reação, o CO2 é liberado que carrega o valor isotópico do íon carbonato CO32 - da amostra.</li>
		<li>Espere 1h por amostra, até que seja atingido o equilíbrio de CO2 . Depois de 1 h, as amostras devem ser medidas para obter resultados fiáveis. Durante a aquisição, uma mistura de amostra de gás e ele passa para o dispositivo. Uma fase de secagem Remove água de mistura de gases a amostra.</li>
		<li>Medir a amostra, iniciando com três picos de CO2 , gás de referência com uma composição isotópica conhecida. Pico de intensidade deve ser 4000 mV para coincidir com a intensidade dos picos de amostra (entre 4000 a 8000 mV). Os três picos de gás de referência devem ser 20 s longa e 30 s separados. Siga com a definição do intervalo de medição da amostra. Medir a amostra 10 vezes para 5 s cada e 55 s separados. Certifique-se de que a altura do pico diminui ao longo do tempo, indicando o transporte adequado da mistura de amostra/hélio (Figura 5). Nota: Durante a medição, o software calcula a composição isotópica da amostra, comparando o valor conhecido isotópico, a altura do pico e a área do pico do gás de referência com a altura do pico e área dos picos das amostras. O cru 13C /12C e 18O /16O composição da amostra é calculada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalize as amostras após a medição. Nota: Isto é importante porque o gás de referência não sofrer o mesmo caminho de químico e físico, como a amostra de gás quando introduzidos pelo espectrômetro de massa. Portanto, é essencial que as amostras são calibradas Adicionalmente aos padrões internacionais (etapa 5.3) que sofrem o mesmo tratamento físico e químico dentro de um prazo que a amostra se20. Estas normas internacionais carbonato permitem a calibração de dois pontos de amostras para a balança de medição delta internacional e a avaliação da precisão e repetibilidade ao longo de um determinado prazo.</li>
</ol>

<ol><li>Balasse, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/oa.601">Reconstructing dietary and environmental history from enamel isotopic analysis: time resolution of intra-tooth sequential sampling.</a> International Journal of Osteoarchaeology. 12 (3), 155-165 (2002).</li>
<li>Balasse, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/oa.656">Potential biases in sampling design and interpretation of intra-tooth isotope analysis.</a> International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 3-10 (2003).</li>
<li>Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1475-4754.2008.00441.x">On isotopes and old bones.</a> Archaeometry. 50 (6), 925-950 (2008).</li>
<li>Clementz, M. T. <a target="_blank" href="https://www.mammalsociety.org/articles/new-insight-old-bones-stable-isotope-analysis-fossil-mammals">New insight from old bones: stable isotope analysis of fossil mammals.</a> Journal of Mammalogy. 93 (2), 368-380 (2012).</li>
<li>Loftus, E., Roberts, P., Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/0067270X.2016.1150083">An isotopic generation: four decades of stable isotope analysis in African archaeology.</a> Azania: Archaeological Research in Africa. 51 (1), 88-114 (2016).</li>
<li>Ventresca Miller, A. R., Makarewicz, C. <a target="_blank" href="https://www.taylorfrancis.com/books/e/9781351389921/chapters/10.4324%2F9781315143026-1">Isotopic approaches to pastoralism in prehistory: Diet, mobility, and isotopic reference sets.</a> Isotopic Investigations of Pastoralism in Prehistory. , 1-14 (2018).</li>
<li>Hollund, H. I., Ariese, F., Fernandes, R., Jans, M. M. E., Kars, H. <a target="_blank" href="https://research.vu.nl/en/publications/testing-an-alternative-high-throughput-tool-for-investigating-bon">Testing an alternative high-throughput tool for investigating bone diagenesis: FTIR in attenuated total reflection (ATR) mode.</a> Archaeometry. 55 (3), 507-532 (2013).</li>
<li>LeGeros, R. Z. <a target="_blank" href="https://www.karger.com/Book/Home/221958">Calcium phosphates in oral biology and medicine.</a> Monographs in oral sciences. 15, 109-111 (1991).</li>
<li>Lee-Thorp, J. L., Van Der Merwe, N. J. <a target="_blank" href="https://inis.iaea.org/search/search.aspx?orig_q=RN:19035123">Carbon isotope analysis of fossil bone apatite.</a> South African Journal of Science. 83 (11), 712-715 (1987).</li>
<li>Cerling, T. E., Harris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+isotope+fractionation+between+diet+and+bioapatite+in+ungulate+mammals+and+implications+for+ecological+and+paleoecological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Carbon isotope fractionation between diet and bioapatite in ungulate mammals and implications for ecological and paleoecological studies.</a> Oecologia. 120 (3), 347-363 (1999).</li>
<li>Koch, P. L. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470691854.ch5">Isotopic study of the biology of modern and fossil vertebrates.</a> Stable Isotopes in Ecology and Environmental Science. , 99-154 (2007).</li>
<li>Nelson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+SJ+%22Wheeler%27s+Dental+Anatomy%2C+Physiology+and+Occlusion-E-Book%22">Wheeler's Dental Anatomy, Physiology and Occlusion-E-Book</a>. , Elsevier Health Sciences. (2014).</li>
<li>Tsutaya, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/ase/124/3/124_161029/_article/-char/en">From cradle to grave: multi-isotopic investigations on the life history of a higher-status female from Edo-period Japan.</a> Anthropological Science. 124 (3), 185-197 (2016).</li>
<li>Sponheimer, M., Passey, B. H., De Ruiter, D. J., Guatelli-Steinberg, D., Cerling, T. E., Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+evidence+for+dietary+variability+in+the+early+hominin+Paranthropus+robustus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isotopic evidence for dietary variability in the early hominin Paranthropus robustus.</a> Science. 314 (5801), 980-982 (2006).</li>
<li>Lee-Thorp, J., Sponheimer, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278416503000357">Three case studies used to reassess the reliability of fossil bone and enamel isotope signals for paleodietary studies.</a> Journal of Anthropological Archaeology. 22 (3), 208-216 (2003).</li>
<li>Zazzo, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031018214002399">Bone and enamel carbonate diagenesis: a radiocarbon prospective.</a> Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology. 416, 168-178 (2014).</li>
<li>Sponheimer, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSponheimer%2C+M+%22Isotopic+paleoecology+of+the+Makapansgat+Limeworks+fauna+%28Australopithecus+africanus%2C+South+Africa%29%22">Isotopic paleoecology of the Makapansgat Limeworks fauna (Australopithecus africanus, South Africa)</a>. , (1999).</li>
<li>Sponheimer, M., Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030544039890293X">Alteration of enamel carbonate environments during fossilization.</a> Journal of Archaeological Science. 26 (2), 143-150 (1999).</li>
<li>Roche, D., Ségalen, L., Balan, E., Delattre, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0305440310000348">Preservation assessment of Miocene-Pliocene tooth enamel from Tugen Hills (Kenyan Rift Valley) through FTIR, chemical and stable-isotope analyses.</a> Journal of Archaeological Science. 37 (7), 1690-1699 (2010).</li>
<li>Roberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calling+all+archaeologists%3A+guidelines+for+terminology%2C+methodology%2C+data+handling%2C+and+reporting+when+undertaking+and+reviewing+stable+isotope+applications+in+archaeology%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Calling all archaeologists: guidelines for terminology, methodology, data handling, and reporting when undertaking and reviewing stable isotope applications in archaeology.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Snoeck, C., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009254115300528">Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 1-Impact on structure and chemical composition.</a> Chemical Geology. 417, 394-403 (2015).</li>
<li>Pellegrini, M., Snoeck, C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009254115300851">Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 2-Impact on carbon and oxygen isotope compositions.</a> Chemical Geology. 420, 88-96 (2016).</li>
<li>Wright, L. E., Schwarcz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+carbon+and+oxygen+isotopes+in+human+tooth+enamel%3A+identifying+breastfeeding+and+weaning+in+prehistory%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+physical+anthropology%22%5BJournal%5D)">Stable carbon and oxygen isotopes in human tooth enamel: identifying breastfeeding and weaning in prehistory.</a> American Journal of physical anthropology. 106 (1), 1-18 (1998).</li>
<li>Roberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruits+of+the+forest%3A+Human+stable+isotope+ecology+and+rainforest+adaptations+in+Late+Pleistocene+and+Holocene+%28%E2%88%BC+36+to+3+ka%29+Sri+Lanka%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+human+evolution%22%5BJournal%5D)">Fruits of the forest: Human stable isotope ecology and rainforest adaptations in Late Pleistocene and Holocene (∼ 36 to 3 ka) Sri Lanka.</a> Journal of human evolution. 106, 102-118 (2017).</li>
<li>Zazzo, A., Balasse, M., Patterson, W. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703705001808">High-resolution δ13C intratooth profiles in bovine enamel: Implications for mineralization pattern and isotopic attenuation.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 69 (14), 3631-3642 (2005).</li>
<li>Sydney-Zax, M., Mayer, I., Deutsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonate+content+in+developing+human+and+bovine+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Carbonate content in developing human and bovine enamel.</a> Journal of dental research. 70 (5), 913-916 (1991).</li>
<li>Rink, W. J., Schwarcz, H. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030544038570026X">Tests for diagenesis in tooth enamel: ESR dating signals and carbonate contents.</a> Journal of Archaeological Science. 22 (2), 251-255 (1995).</li>
<li>Szpak, P., Metcalfe, J. Z., Macdonald, R. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352409X16306824">Best practices for calibrating and reporting stable isotope measurements in archaeology.</a> Journal of Archaeological Science: Reports. 13, 609-616 (2017).</li>
<li>Wright, L. E., Schwarcz, H. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030544039890351X">Correspondence between stable carbon, oxygen and nitrogen isotopes in human tooth enamel and dentine: infant diets at Kaminaljuyu.</a> Journal of Archaeological Science. 26 (9), 1159-1170 (1999).</li>
<li>Schoeninger, M. J., Hallin, K., Reeser, H., Valley, J. W., Fournelle, J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/oa.653">Isotopic alteration of mammalian tooth enamel.</a> International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 11-19 (2003).</li>
</ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Os desafios da bem sucedida de amostragem (granel e incremental) da dentição depende do acesso ao conhecimento sobre técnicas de perfuração e preparação, juntamente com o investimento em equipamentos de custo relativamente baixo da amostra. Estes desafios são facilmente superáveis quando clara instruções estão disponíveis relativas à amostras e pré-tratamento de abordagens. Neste artigo, nós esperamos ter disseminado estes de forma clara e concisa para pesquisadores novos para esses métodos. Estudiosos aplicando esses mé...

Análises de isótopo carbono e oxigênio estáveis de carbonato de esmalte do dente tem sido usada para estudar o passado humano de ingestão, desmame e mobilidade, bem como dependência da fauna de vegetação, o movimento de animais e pecuária foddering. Esses aplicativos foram exaustivamente discutidos e revisados para uma variedade de condições ambientais, indicando os efeitos da aridez local, temperatura, fontes de água e vegetação composições1,2, 3,4,5,6. A diversidade de aplicações potenciais em arqueologia e paleontologia, bem como a boa preservação do carbonato de esmalte do dente, fêz um material atrativo para o isótopo estável de trabalho3. Métodos de amostragem, pré-tratamento e rastreio de diagénese são brevemente descritos em algumas das anteriores Publicações1,7. No entanto, completa manifestações verbais e visuais permanecem em grande parte indisponíveis, particularmente para pessoas fora de laboratórios de ciência arqueológica e entre grupos de laboratório com financiamento limitado, onde está a aumentar o interesse no uso desta técnica 5.
Esmalte do dente é principalmente composta de hidroxiapatita (bioapatite) cristalitos8 maior do que aqueles no osso, tornando-os mais resistentes para post-mortem LGMA iônico substituições e contaminação3. Estudos modernos têm demonstrado que medições de isótopos (δ13C) carbono estável do dente da fauna esmalte confiantemente registro animal dieta e comportamento9,10. O valor de isótopo (δ18O) oxigênio estável do esmalte do dente é determinado pela composição isotópica do oxigênio da água ingerida, que inclui a água na planta e alimentos de origem animal, água potável, respiração, bem como vários impactos ambientais sobre a água que pode levar a ainda mais o fracionamento isotópico (EG., aridez, temperatura, altitude, quantidade de precipitação, localização continental)11. Isso a tornou um método popular para reconstrução dietético e ambiental na pesquisa arqueológica, paleoecológica e paleontológica.
O período de formação do esmalte de dente é relativamente curto (anos) e difere dependendo do dente a ser amostrado. Para os seres humanos, primeiro molar esmalte mineralizes entre o nascimento e os 3 anos de idade, pré-molares mineralize entre 1,5 e 7 anos de idade, segundo molares mineralize entre 2,5 e 8 anos de idade e terceiros molares mineralize durante a adolescência, entre 7 e 16 anos,12 . Tendo em conta que formas de esmalte do dente incrementalmente ao longo de seu período de formação, pode ser amostrado em massa ao longo do eixo de crescimento inteira ou amostrado sequencialmente, a fim de investigar as mudanças na dieta e ambiente que ocorreram durante o período de formação13 . Mudanças dietéticas ordenadas cronologicamente dentro de um determinado dente são observável para seres humanos e outros animais1,14, fornecendo informações sobre inter-anual variação sazonal e dietética.
Enquanto o esmalte é geralmente resistente a diagénese, isotópicas modificações resultantes do ambiente enterro são possíveis e foram observadas15,16, fazendo verificações experimentais e pré-tratamento escolhas útil. Enquanto não é o método só está disponível, Fourier transform espectroscopia de infravermelho (FTIR), particularmente no modo de transmissão atenuadas, surgiu como uma forma rápida, barata e relativamente acessível método para avaliar grafismos alteração no esmalte do dente, particularmente em contextos paleontológica17,18,19,20. No entanto, detalhada de protocolos e padrões de gravação permanecem relativamente inacessíveis para muitas pessoas, fora os campos da ciência geoquímica ou material.
Tempos de reação e os produtos químicos empregados por pesquisadores no pré-tratamento do esmalte do dente também variam consideravelmente na literatura, muitas vezes com limitada consideração sobre o que esta variabilidade pode fazer ao carbono estável e valores de isótopos de oxigênio da amostra21 ,22. Aqui, nós relatamos uma abordagem que usa diluir o ácido acético (0,1 M) para o pré-tratamento das amostras de pó de esmalte. No entanto, dado que as diferenças nas medições isotópicas resultantes de pré-tratamento são relativamente menores para o esmalte do dente, é melhor para os pesquisadores a seguir os protocolos para conjuntos de dados com os quais desejam comparar seus dados para11. Além disso, onde pequenas amostras sequenciais são tomadas, particularmente em amostras do Holoceno, sem pré-tratamento pode ser escolhido (sequência de testes-piloto LGMA) para evitar o desperdício de amostra.
Embora os métodos que nós relatamos aqui não são de modo novos, para o nosso conhecimento, esta é a primeira vez que uma completa documentação escrita e visual de granel e amostragem sequencial, pré-tratamento escolhas e métodos de seleção LGMA (sob a forma de FTIR) para dente esmalte se tornaram amplamente disponíveis para um público variado e acadêmico. Enquanto esperamos que nossos esforços fará com que esta abordagem mais facilmente acessível a um número maior de indivíduos e laboratórios, pesquisadores que deseja aplicar e publicar esta técnica devem estar cientes do mínimo relatórios padrões, considerações LGMA, e requisitos de apresentação visualizadosm em outro lugar20, bem como o potenciais interpretativas complexidades que serão exclusivo para sua região de estudo, táxons analisadas e tempo de período5.

<table><tbody><tr><td>Dremel Micro</td><td>Dremel</td><td></td><td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro</td></tr><tr><td>Broca com ponta de diamante</td><td>Dremel</td><td></td><td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point</td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de&region=DE&gclid=EAIaIQ obChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1 wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE</td></tr><tr><td>Fórmula Linear de Metanol</td><td></td><td></td><td>:&nbsp; CH3OH</td></tr><tr>Fórmula Linear de<td>Ácido</td><td></td><td></td> Acético<td>:&nbsp; CH3CO2H</td></tr><tr><td>Configuração do equipamento Dremel (estação de trabalho)</td><td>Microcentrífuga Dremel</td><td></td><td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation</td></tr><tr><td></td><td>Minicentrífuga Thermo Scientific</td><td></td><td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401</td></tr><tr><td>Sprout</td><td></td><td></td><td>http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4</td></tr><tr><td>liofilizador</td><td>Zirbus Technology</td><td></td><td>http://www.zirbus.com</td></tr></tbody></table>

amostragem e tratamento prévio de esmalte do dente carbonato de carbono estável e análise de isótopos de oxigênio

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Análise de isótopo carbono e oxigênio estável de carbonato de esmalte do dente humano e animal foi aplicado em pesquisa de paleoambientais e paleodietary, paleoecológica, de períodos históricos recentes para mais de 10 milhões anos atrás. Granel abordagens fornecem uma amostra representativa para o período de mineralização do esmalte, enquanto amostras sequenciais dentro de um dente podem rastrear mudanças dietéticas e ambientais durante este período. Embora essas metodologias foram amplamente aplicadas e descritas em arqueologia, paleontologia e ecologia, há não orientações explícitas para ajudar na seleção de equipamentos de laboratório necessários e para descrever minuciosamente detalhado laboratório amostragem e protocolos. Neste artigo, Nós documentamos textualmente e visualmente, todo o processo de amostragem através de triagem de pré-tratamento e LGMA tornar a metodologia mais amplamente disponível para pesquisadores, considerando sua aplicação em uma variedade de configurações de laboratório.

Usando o procedimento de amostragem apresentado acima, amostras de esmalte incremental bioapatite estavam preparadas. A análise de bioapatite em esmalte depende da precisão da amostragem, se a granel ou incremental. Neste caso, optámos por apresentar os resultados das amostras arqueológicas (duas ovelhas) de diferentes zonas climáticas. Incrementais amostras foram analisadas a partir de segundo molares ovelhas e rotuladas, começando com o ERJ (Figura 4). Loca...

Análise de isótopo carbono e oxigênio estável de carbonato de esmalte do dente humano e animal tem sido usado como um proxy para cada dieta e reconstrução ambiental. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada e documentação visual de granel e sequencial do dente esmalte amostragem bem como pré-tratamento de amostras arqueológicas e paleontológicas.

Amostragem e tratamento prévio de esmalte do dente carbonato de carbono estável e análise de isótopos de oxigênio

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Este método pode responder a questões-chave em arqueologia, paleontologia e ecologia, como dietas de animais domesticados, estratégias de manejo de animais e mobilidade animal. A principal vantagem dessa técnica é que ela é relativamente não destrutiva e se concentra em um material razoavelmente resistente a mudanças químicas no ambiente de sepultamento. Indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não há recursos visuais disponíveis para a amostragem de restos paleontológicos e arqueológicos de humanos e animais.A demonstração visual desse método é crítica porque é difícil de aprender e a prática em materiais arqueológicos é limitada. Para iniciar a amostragem em massa, configure uma broca portátil conforme descrito no protocolo de texto, com uma broca limpa com ponta de diamante de formato uniforme, presa por meio de um mandril à configuração da broca. Usando a broca, limpe a superfície externa do dente por abrasão suave.Em seguida, tara um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro em uma balança apropriadamente precisa. Em seguida, coloque papel alumínio limpo ou papel de pesagem sob a broca para coletar o pó de esmalte. Use a broca para aplicar uma abrasão suave e uniforme, criando uma ranhura paralela a todo o eixo de crescimento.Esteja ciente de que a quantidade de pó de amostra perfurada varia de acordo com o equipamento usado para análise, o protocolo de pré-tratamento e o tamanho do dente. Colete o pó de esmalte resultante e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Registre o número da amostra e o peso do esmalte em um caderno de laboratório, bem como em um banco de dados eletrônico.Depois que cada dente for perfurado, limpe todas as brocas usadas usando ácido clorídrico 0,5 molar em um tecido robusto. Lave as brocas novamente com um solvente orgânico em um novo tecido robusto. Limpe a própria furadeira usando vácuo ou ar comprimido.Quando uma sessão de perfuração estiver concluída, limpe completamente o espaço de trabalho usando um aspirador de pó dedicado ou uma pá de lixo e escova. Limpe o espaço de amostragem com metanol. Limpe a furadeira usando o aspirador ou ar comprimido.Para amostragem sequencial, primeiro limpe a superfície do dente removendo uma camada muito fina de esmalte externo do dente. Escolha uma broca apropriada para a amostra, pois a largura da linha de amostragem é determinada pelo diâmetro da broca. Para começar a perfurar, pressione o esmalte do dente contra a broca e aplique pressão.Perfure ao longo da superfície vestibular perpendicular ao eixo de crescimento do dente, indo da junção esmalte-raiz até o topo da coroa. Certifique-se de perfurar do ápice até a base da coroa no local da junção esmalte-raiz, resultando em uma ranhura na camada de esmalte. Após a conclusão da perfuração, pese a amostra para garantir que haja pó de esmalte suficiente e registre o peso.Repita o processo de perfuração várias vezes por dente, com cada linha consecutiva paralela à linha de amostra anterior e com cerca de um a dois milímetros de distância. Depois disso, use paquímetros para medir a distância de cada linha de amostragem da junção esmalte-raiz. Registre cada distância para comparação.Para começar, use uma pipeta para adicionar ácido acético 0,1 molar a cada amostra a uma concentração de 0,1 mililitros por um miligrama de esmalte. Agitar as amostras agitando ou utilizando um agitador. Deixe as amostras agitadas repousarem durante 10 minutos.Centrifugar as amostras a 13 700 g durante dois minutos. Usando uma pipeta limpa, substitua o ácido acético por um mililitro de água ultrapura e agite agitando ou usando um agitador. Centrifugar novamente a 13 700 g durante dois minutos.Repita o processo de substituição da água ultrapura e centrifugação mais duas vezes. Teste as amostras quanto à neutralidade. Se a amostra não atingir a neutralidade, repita o processo de lavagem até que isso aconteça.Em seguida, use uma pipeta para remover o fluido restante sem perturbar o sobrenadante. Coloque um quadrado pré-cortado de um centímetro por um centímetro de Parafilm sobre cada tubo de microcentrífuga. Usando um objeto pontiagudo, faça um pequeno orifício no Parafilm para garantir que a amostra seque adequadamente e coloque os tubos em um freezer durante a noite.No dia seguinte, transfira as amostras para o liofilizador para remover qualquer fluido restante. Quando as amostras estiverem secas, remova o Parafilm e feche as tampas da microcentrífuga. Verifique a rotulagem do tubo e observe os tubos conforme necessário.Neste estudo, são preparadas amostras incrementais de bioapatita de esmalte. Cada local de amostra incremental é numerado e a distância entre cada local e a junção esmalte-raiz é medida. Diversos resultados de isótopos estáveis de carbono e oxigênio de duas ovelhas representativas confirmam que esses animais viviam em ambientes diferentes.A ovelha A é de uma pastagem tropical e mostra oxigênio incremental 18 em uma faixa estreita, entre 3,3 e 5,1 por mil. Isso sugere a ingestão de água de fontes com valores isotópicos semelhantes e a falta de fortes mudanças sazonais na precipitação. Em contraste, a ovelha B, que é de uma pastagem de estepe temperada seca, tem valores de oxigênio 18 com uma alta amplitude de variação, variando de 5,2 a 13,1 por mil de menos a menos de 5,2 a 13,1 negativos.Isso indica forte variação sazonal na precipitação. Valores estáveis de isótopos de carbono sugerem que a dieta da ovelha A consiste principalmente de plantas C4, enquanto a dieta da ovelha B consiste principalmente de vegetação C3. Os valores incrementais de oxigênio 18 e carbono 13 para um dente humano de um ambiente de floresta tropical são altamente restritos.Esses valores, que estão dentro de uma faixa de dois por mil, sugerem uma falta de variação nas estratégias de forrageamento ao longo do período de mineralização do esmalte. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de praticar a amostragem sequencial em dentes modernos antes de perfurar amostras antigas que não são substituíveis. A amostragem sequencial pode levar várias horas de prática antes que a proficiência seja alcançada.Para amostras antigas, é importante escolher dentes que possam suportar o processo de amostragem. É improvável que os dentes mal preservados ou sujeitos a desmoronar sejam úteis para amostragem sequencial detalhada. Após este procedimento, outros métodos, como a análise de isótopos de estrôncio, podem ser tentados para entender a mobilidade humana e animal.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de arqueologia e paleontologia explorarem estratégias de pastoreio e migração de animais em diversas regiões e períodos de tempo. Não se esqueça de que trabalhar com brocas e ácido acético pode ser extremamente perigoso, e precauções como googles, luvas e máscaras faciais devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

sampling-pretreatment-tooth-enamel-carbonate-for-stable-carbon-oxygen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um protocolo é descrito em que a biodegradação de CO2 mineralizado a partir de contaminantes orgânicos (derivados de matérias-primas de petróleo) é capturada, quantificada e analisada quanto ao teor de 14C. Um modelo é desenvolvido para determinar a extensão espacial da zona de captura de CO2. As medições espaciais e temporais permitem integrar as taxas de mineralização de contaminantes para prever a extensão e o tempo de remediação.

Medindo-carbono com base Contaminant Mineralização Usando Combinada CO<sub&gt; 2</sub&gt; fluxo e de radiocarbono Análises

Apresentamos o método do ácido benzeno policarboxílico (BPCA) para avaliação do carbono pirogênico (PyC) no meio ambiente. A abordagem específica do composto fornece informações simultâneas sobre as características, quantidade e composição isotópica (13C e 14C) do PyC.

Caracterização, quantificação e específicos do Composto isotópica Análise de Pirogênica carbono, usando Benzeno policarboxílicos Acids (BPCA)

Um protocolo para a produção paralela de carbonato de cálcio precipitado e material zeolítico a partir de escória de alto-forno via carbonatação mineral e conversão hidrotérmica alcalina, respectivamente, é apresentado. O desempenho do material zeolítico em relação à adsorção de níquel é testado.

Two-way Valorização da escória de alto forno: Síntese de Precipitado de Carbonato de Cálcio e zeolítico Heavy Metal adsorvente

Demonstramos o uso de vários métodos de microscopia que são úteis na observação da calcificação de um verme tubular, Hydroides elegans, bem como na localização e caracterização do primeiro material calcificado. A microscopia ao vivo e a microscopia eletrônica são usadas juntas para fornecer informações funcionais e materiais que são importantes no estudo da biomineralização.

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

Padrões espaciais de deposição e erosão do solo podem ser inferidos diferenças na elevação de terreno mapeado em incrementos de tempo apropriado. Tais mudanças na elevação estão relacionadas a alterações no solo perto da superfície de carbonatos. Métodos repetíveis para medições de campo e laboratório destes métodos de análise de dados e quantidades são descritos aqui.

Medição e mapeamento de padrões de erosão e deposição relacionadas às concentrações de carbonato de solo sob gestão agrícola

Descrevemos um protocolo para a precipitação e caracterização de cristais de carbonato de cálcio que se formam na presença de biopolímeros.

Formação de carbonato de cálcio na presença de aditivos Biopoliméricos

O método de verificação descrito aqui é adaptável para monitorar o sequestro de carbono inorgânico pedogênico em vários solos agrícolas alterados com rochas alcalinas contendo silicato de metais terrestres, como wollastonita, basalto e olivina. Esse tipo de validação é essencial para programas de crédito de carbono, que podem beneficiar agricultores que sequenciam carbono em seus campos.

Monitoramento do acúmulo de carbono inorgânico pedogênico devido ao intemperismo de minerais de silicato alterados em solos agrícolas.

Este protocolo é para o isolamento de grãos de quartzo por tamanho para datação por luminescência de sedimentos. Delineada são a limpeza física e as digestão química, por imersão sequencial em H 2 O2, HCl, HF e HCl novamente para isolar grãos de quartzo. A pureza do quartzo é quantificada com avaliação microscópica, espectroscopia Raman e razão de depleção de IR.

Isolamento de Grãos de Quartzo para Datação por Luminescência Opticamente Estimulada (OSL) de Sedimentos Quaternários para Pesquisa Paleoambiental

O protocolo apresenta uma série de protocolos de melhores práticas para a coleta de pó ósseo de oito locais de amostragem anatômica recomendados (locais específicos em um determinado elemento esquelético) em cinco elementos esqueléticos diferentes de indivíduos medievais (radiocarbono datado de um período de cerca de 1040-1400 CE, faixa calibrada de 2-sigma).

Protocolos Otimizados de Amostragem Óssea para a Recuperação de DNA Antigo de Vestígios Arqueológicos

Este protocolo descreve um método fácil de usar para examinar a oxidação do substrato rastreando a produção de 14CO2 in vitro.

Avaliação da oxidação do substrato de energia in vitro com 14armadilhas de CO2

Este protocolo visa preservar metabólitos celulares para espectrometria de massa de célula única (SCMS), combinando lavagem de solução salina volátil, têmpera rápida de nitrogênio líquido, liofilização e armazenamento de -8 °C. Isso demonstra que a extinção do nitrogênio líquido é essencial para manter os perfis de metabólitos, enquanto o armazenamento refrigerado prolongado deve ser minimizado para evitar alterações metabólicas.

Preparação de amostras para estudos metabolômicos de espectrometria de massa de célula única: lavagem, têmpera, secagem e armazenamento de células combinadas

Aprenda amostragem sequencial de esmalte dental para análise de isótopos estáveis de carbono e oxigênio em arqueologia e paleontologia. Este método não destrutivo reconstrói dietas e ambientes passados.

Amostragem e tratamento prévio de esmalte do dente carbonato de carbono estável e análise de isótopos de oxigênio

Explorar mais vídeos