Name: In Vitro Diferenciação de Mouse Granulócito-macrófago-colônia-estimulando Factor (GM-CSF)-produzindo pilhas de T Helper (THGM) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a diferenciar células T H GM de células T CD4+ naïve de camundongo para estudos de imunologia e doenças inflamatórias. Este método gera mais de 50% de células expressando GM-CSF.

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Este estudo foi suportado por subvenções provenientes da Universidade Nacional saúde sistema de Cingapura (T1-2014 Oct-12 e T1-2015 Sep-10).

Todos os mouses utilizados neste protocolo foram sobre o fundo genético C57BL/6 e alojados sob condições específicas isentos de agentes patogénicos, da Universidade Nacional de Cingapura. Todos os experimentos foram realizados utilizando protocolos aprovados pelo Comité de uso da Universidade Nacional de Cingapura e institucional Cuidado Animal.
1. reagente e preparação de Material
<ol><li>Prepare 500 mL de tampão fosfato salino (PBS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mM de ácido de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Nota: Mantenha o buffer no gelo durante todo o processo para obter melhores resultados.</li>
	<li>Prepare 50 mL de mídia RPMI completa contendo penicilina-estreptomicina RPMI 1640, 10% FBS e 1%. Use mídia RPMI completa contendo 50 µM β-Mercaptoetanol para a diferenciação de células THGM. Adicione o β-Mercaptoetanol em uma coifa.</li>
	<li>Prepare 7,5 mL de uma mistura de anticorpo anti-CD3e diluindo concentrado anti-CD3e estoque a 3 μg/mL de PBS. Revestimento de placas boas 48 adicionando 150 μL da mistura de anticorpo para cada poço e incubar a placa a 37 ° C, durante pelo menos 1 h, ou a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Esterilizar um par de tesouras e pinças e mantê-los em etanol a 70% entre as dissecções.</li>
</ol>2. preparação dos Splenocytes murino
<ol><li>Eutanásia o mouse (de 6 a 8 semanas de idade) usando um aprovado institucionalmente CO2 asfixia ou deslocamento cervical. Pulverize o mouse com 70% de etanol e montá-lo em um bloco de poliestireno em suas costas. Transferi o mouse para uma câmara de segurança biológica para prosseguir com as etapas a seguir.</li>
	<li>Segure a pele usando um par de pinças e cortar a pele abaixo da caixa torácica no lado esquerdo para cerca de 4 cm, usando um par de tesouras. Abra o saco peritoneal para expor o baço e usar Pinças esterilizadas para extrair o baço.</li>
	<li>Coloque um filtro de célula de 70 μm em um tubo de 50 mL e pre-molhe-o com 2 mL de tampão. Coloque os baços no filtro da célula (2 – 3 baços para filtro de uma célula) e macerá-los usando a extremidade de um êmbolo de seringa de 5 mL.</li>
	<li>Lave o filtro e tubo várias vezes com 1 a 2 mL de tampão de isolamento de célula até que todas as células são liberadas para dentro do tubo. Descartar o filtro célula e centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células com 5 mL de frio (4 ° C) de amónio-cloreto-potássio (ACK) lise tampão (150mm NH4Cl, 10mm KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,2-7,4) e misture-os suavemente por 2 min. adicionar 10 mL de mídia RPMI completa para neutralizar o ACK buffer e centrifugar imediatamente as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante após a centrifugação.</li>
</ol>3. isolamento de T CD4 + células usando Microbeads magnéticos CD4 e uma coluna de separação de células
<ol><li>Ressuspender as células em 5 mL de tampão de isolamento de célula. Filtre a suspensão de células usando um filtro de pré-separação (30 μm) para um novo tubo de 15mL para remover os detritos.</li>
	<li>Pegue 10 μL da suspensão celular e fazer uma diluição de 10 x adicionando 90 μL de tampão. Pegue 10 μL da suspensão celular diluídos e misturá-lo com 10 μL de trypan azul para a contagem de células. Conte as células em um hemocytometer para determinar o rendimento de células viáveis.</li>
	<li>Centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 90 μL de tampão por 107 células. Adicione 10 μL de microbeads magnéticos de CD4 por 107 células. Incube as celulas por 15 min a 4 ° C. Para obter melhores resultados, misture a suspensão de eritrócitos suavemente a cada 5 minutos durante a incubação.</li>
	<li>Enquanto as células estão incubando, coloca uma coluna de separação magnética depor. Pre-molhado a coluna com 2 mL de tampão.</li>
	<li>No final da incubação da célula/pérola, lavam-se as células com 5 mL de tampão e centrifugá-los a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1 mL de tampão, carregar a amostra para a coluna de separação de células e deixá-lo fluir. Use um tubo de centrífuga de 15 mL para coletar a fração de células CD4. Adicione 1 mL de tampão de lavar o reservatório antes de que está seco. Repita a etapa de lavagem 2 x.</li>
	<li>Remover a coluna da célula de separação do suporte magnético e colocá-lo em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Adicionar 2 mL de tampão de isolamento de célula para a coluna de separação de células e aplique o êmbolo com firmeza para forçar as células da coluna.</li>
	<li>Centrifugue a fração a 350 x g por 5 min a 4 ° C para obter células CD4 +. Desprezar o sobrenadante.</li>
</ol>4. purificação das células T CD4 + Naive (CD4+CD25–CD44EisCD62LOi) por diferenciação celular classificação e THGM fluorescência-ativado
<ol><li>Resuspenda o pellet de célula CD4 + a obtidos em 500 µ l de tampão. Misture as células com uma mistura de anticorpos fluorescentes-conjugados contendo CD4-PerCp (2,8 µ g/mL), CD44-APC (2,4 µ g/mL), CD25-PE (2 µ g/mL) e CD62L-FITC (10 µ g/mL) (tabela 1). Incube as células no gelo por 20 a 30 min, protegendo-os da luz. Nota: As concentrações dos anticorpos foram otimizadas previamente no laboratório. O número de anticorpos listados é para células de camundongos de 1 – 2.</li>
	<li>Após a incubação, as células com 5 mL de tampão de lavar e centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de tampão. Filtre as células novamente usando uma malha de nylon.</li>
	<li>Transfira a suspensão de células para um tubo de FACS para classificação de célula. Precoat os tubos de FACS coleção com 500 µ l de tampão.</li>
	<li>Obter um CD4+CD25–CD44EisCD62LOi população (ingênuo CD4+ T células) classificando os FACS. Portão em CD4+CD25– primeiras e em seguida, selecionadas CD44EisCD62LOi células a partir desta população.</li>
	<li>Recolher o ingênuo CD4+ T fracções de célula para um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células T CD4 + de ingênuo em uma concentração de 106 células/mL em mídia RPMI completa contendo 50 µM β-Mercaptoetanol.</li>
	<li>Aspire os anticorpos anti-CD3e usados para precoating na placa de 48. Células de 0,25 milhões de sementes (250 µ l) em cada poço com IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µ g/mL) e antirelato (10 µ g/mL) (tabela 1). Nota: As concentrações de anticorpos e citocinas foram otimizadas previamente no laboratório para uma diferenciação de células THGM.</li>
	<li>Incube as células a 37 ° C com 5% de CO2 por 3 dias. Não altere o meio durante a incubação.</li>
</ol>5. análise das células do rato THGM gerados In Vitro
<ol><li>Usando um microscópio, verifica a diferenciação celular 3 d após a diferenciação. As células da colheita e centrifugá-los a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Lavar as células 2 x com mídia RPMI completa. Nota: Células diferenciadas são maiores em tamanho do que as células T CD4 + de ingênuo.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1 mL de mídia RPMI completa. Leve 10 μL da suspensão de células e misture bem com 10 μL de trypan azul para determinar o número de células com um hemocytometer. Divida células diferenciadas em três poções para um restimulation e análise. Nota: Coloração de citocinas intracelulares e ensaios de ELISA exigem milhões de células ≥0.5 e qPCR análise requer ≥ 1 milhão células.</li>
	<li>
Para coloracao intracelular cytokine, reestimular as células com phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) e ionomycin (1 μg/mL) na presença de um inibidor de transporte de proteína (1 µ l/mL) por 4-6 h.
	<ol>
<li>As células da colheita e manchá-las com anticorpo anti-CD4 (conjugada com PerCP, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100; ou conjugado FITC, 0,5 mg/mL, diluição de 1: 100) por 30 min.</li>
		<li>Consertar as células com 200 μL de tampão de fixação de 20 – 60 min. Após a fixação, lavar as células 2 x com 1 mL de tampão de permeabilização.</li>
		<li>Executar a coloracao intracelular com anticorpos contra o GM-CSF (PE-conjugados, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100), IL-17A (conjugado FITC, 0,5 mg/mL, diluição de 1: 100; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100), IL-4 (APC-conjugados, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100) e o relato (APC-conjugados, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100) por 30 min no escuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para uma análise da expressão gênica de citocinas por células diferenciadas qPCR, ative as células com limite a placa anti-CD3e (3 μg/mL) (precoating a placa, conforme descrito na etapa 1.3). A 3 h após a estimulação, colhem as células para isolar o RNA total usando um reagente de extração de RNA de fenol para preparar cDNA para o qPCR. O programa usado para o qPCR e primeiras demão são listados nas tabelas 2 e 3, respectivamente.</li>
	<li>Para a análise da secreção de proteínas de citocinas por células diferenciadas, reestimular as células com limite a placa anti-CD3e (3 μg/mL) por 24 h (precoating a placa, conforme descrito na etapa 1.3). Recolher a sobrenadante para IL-17 e GM-CSF ELISA determinar as concentrações de cultura de células.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+T+cells%3A+fates%2C+functions%2C+and+faults%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li>
<li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+immune+responses%3A+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).</li>
<li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Immunology+meets...Immunology%3A+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH17+cells+in+development%3A+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li>
<li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells%2C+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li>
<li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encephalitogenicity+of+T%28H%2917+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17%2B+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li>
<li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+Neuroinflammation%3A+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui descrevemos um protocolo de uma diferenciação de THGM em vitro de células de rato naïve CD4 +, seguida de uma análise das células diferenciadas para validar o método. Digno de nota, tanto o baço e linfonodos pode ser usados para ingênuo purificação de células T CD4 + e THGM diferenciação. A expressão de citocinas, determinada pela coloração de citocinas intracelulares combinado com citometria de fluxo mostraram que cerca de 55% das células foram induzidas a se tornar células de GM-CSF-...

Células de CD4 + T auxiliar (TH) são componentes essenciais do sistema imunológico, tendo papéis cruciais na defesa do hospedeiro contra patógenos microbianos, na vigilância do câncer e em auto-imunidade1,2,3. Após a ativação do receptor (TCR) de células T, células T CD4 + de ingênuo podem ser diferenciadas em TH1, TH2, TH 17, ou regulamentar T (Treg) as células sob a influência de diferentes citocinas www.UniEthos.org.br2,4, 5. recentemente, um novo subconjunto de células TH , que produz predominantemente GM-CSF, foi identificado e nomeado THGM6. A diferenciação de células THGM é impulsionada por IL-7 através da ativação de um transdutor de sinal e um ativador de transcrição 5 (STAT5). Estas células expressam uma grande quantidade de GM-CSF, tendo uma baixa expressão de outros TH-célula assinatura citocinas como relato e IL-176. GM-CSF, verificou-se a desempenhar um papel crítico no desenvolvimento de CD4 + neuroinflammation mediada por células T7,8. Comparado ao relato - ou IL-17-expressando as células auto-reativas T, GM-CSF-expressando T células transferidos para o selvagem-tipo ratos (WT), causados um início de doença anterior e a maior severidade da doença. Além disso, as células T Csf2- / - não conseguiram induzir encefalomielite auto-imune experimental (EAE) depois enviaram transferidos para destinatários WT, Considerando que células T falta de relato ou IL-17A reteve a capacidade de mediar EAE7. Além disso, um bloqueio de GM-CSF, usando anticorpos neutralizantes amenizada EAE doença gravidade8. Além disso, uma deficiência de STAT5 em células T em camundongos resultou em uma geração THGM diminuída e, portanto, em uma resistência dos ratos a EAE desenvolvimento6. Estes resultados ressaltam a importância das células T GM-CSF-expressandoH na doença auto-imune MPTP. Assim, estabelecer um método para diferenciar as células T GM-CSF-expressandoH de células T CD4 + de ingênuo seria importante no estudo da patogênese de neuroinflammation auto-imune e respostas de imune mediada por células T. No entanto, um protocolo que eficientemente gera células THGM de murino naïve que CD4 + não foi estabelecida.
Aqui nós apresentamos um método que diferencia murino células THGM de células T CD4 + de ingênuo. Este protocolo descreve todo o processo, incluindo a extração do baço do mouse, a preparação de uma suspensão de célula única, a seleção positiva de CD4, a fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e a célula TH análise e diferenciação. As T auxiliar células diferenciadas são analisadas por citocinas intracelulares mancha combinada com citometria de fluxo para determinar a expressão de citocinas, a nível de célula única, por um PCR quantitativo em tempo real para determinar a expressão de citocinas no nível de mRNA, e por ELISA para avaliar a expressão de citocinas no nível de proteína. Esse método pode ser aplicado aos estudos de biologia de célula THGM sob várias condições, tais como a EAE, onde o GM-CSF desempenha um papel importante na patogênese.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0500-500</td><td></td></tr><tr>FBS <td>Capricórnio</td><td>Inativado por Calor</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>1ª Base</td><td>BUF-2040-10</td><td>Diluído para 1x PBS em água estéril</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>1ª Base</td><td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td><td></td></tr><tr><td>10x tampão</td> <td>ACKBiolegend</td><td>420301</td><td>diluído em água estéril</td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>SPL Life Sciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas CD4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>LS coluna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>suporte magnético</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+01T</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Sony SY3200 classificador de células</td><td>Sony</td><td>Sony SY3200 Classificador</td><td></td>de células</tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico de 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico de 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td> <td>FACSCorning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de células de 24 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0041-82</td><td></td></tr><tr><td>PE conjugado anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55)</td> <td>eBioscience</td><td>12-0251-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano / camundongo CD44 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD62L FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0621-85</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem melhorada por Neubauer</td><td>Marienfeld</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Solução Hyclone Trypan Blue</td><td>GE healthcare Life Sciences</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>microscópio</td><td>Nikon</td><td>Nikon Elipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Purificado&nbsp; anti-mouse CD3e&nbsp; anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>Hamster purificado anti-camundongo CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Rato Purificado&nbsp; IFN e gama anti-rato; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>16-7312-85</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IL-4 anti-camundongo purificado</td><td>Biolegend</td><td>504102</td><td></td></tr><tr><td>Proteína IL-7 de camundongo recombinante</td><td>R & D sistema</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>humano recombinante TGF-beta</td><td>R& D sistema</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PMA Merck Millipore</td><td>19-144</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de transporte de proteína GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2301KZ</td><td></td></tr><tr><td>Fixação Intracelular & Conjunto de buffer de permeabilização</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse GM-CSF PE</td><td>eBioscience</td><td>12-7331-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse IL-17A</td><td>Biolegend</td><td>506908</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse IFN-gama</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>GO Taq qPCR master mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td></td></tr><tr><td>mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td><td>invitrogen</td><td>88-7334-88</td><td></td></tr><tr><td>Rato IL-17A Invitrogen ELISA Uncouted</td><td></td><td>88-7371-22</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro diferenciação de mouse granulócito-macrófago-colônia-estimulando factor (gm-csf)-produzindo pilhas de t helper (thgm)

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

O fator de Granulócito-macrófago-colônia-estimulando (GM-CSF)-produzir células de T auxiliar (THGM) é um subconjunto de célula auxiliar de T recentemente identificado que predominantemente segrega GM-CSF, sem produzir o interferon (IFN)-γ ou interleucina (IL) -17 e encontra-se a desempenham um papel essencial no neuroinflammation auto-imune. Um método de isolamento de células T CD4 + de ingênua de uma suspensão de célula única de splenocytes e geração de células THGM de células T CD4 + de ingênuo seria uma técnica útil no estudo da imunidade mediada por células T e doenças auto-imunes. Aqui nós descrevemos um método que diferencia as células T CD4 + de ingênuo rato em células THGM promovidas pela IL-7. O resultado da diferenciação foi avaliado pela análise da expressão de citocinas, usando técnicas diferentes, incluindo citocinas intracelulares mancha combinada com citometria de fluxo, um quantitativo em tempo real cadeia da polimerase (PCR), e ensaios imunoenzimático (ELISA). Usando o protocolo de diferenciação THGM conforme descrito aqui, cerca de 55% das células expressa GM-CSF, com uma expressão mínima de IFNα ou IL-17. A expressão predominante de GM-CSF pelas células THGM foi confirmada pela análise da expressão de IFNα, GM-CSF e IL-17 a nível do mRNA e proteínas. Assim, este método pode ser usado para diferenciar ingênuo células T CD4 + THGM em vitro, células que serão úteis no estudo da biologia de pilha de THGM.

Naive células T CD4 +, isoladas de dois camundongos C57BL/6 machos de 8 semanas de idade foram divididas em três partes. Uma parte das células foi diferenciada em células THGM o protocolo descrito a seguir. Outra parte foi cultivado sob uma condição de THGM na presença de anticorpo anti-IL-4 (10 µ g/mL) para testar a influência de um bloqueio de IL-4 na diferenciação de THGM. A última parcela foi cultivada sob uma condição de diferenciação 17 TH...

Aqui, apresentamos um protocolo para diferenciar murino células auxiliares (THGM) T granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing de células T CD4 + de ingênuo, incluindo o isolamento de células T CD4 + de ingênuo, diferenciação de THGM, e análise de células THGM diferenciadas. Esse método pode ser aplicado aos estudos do regulamento e função das células THGM.

In Vitro Diferenciação de Mouse Granulócito-macrófago-colônia-estimulando Factor (GM-CSF)-produzindo pilhas de T Helper (THGM)

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células T CD4, como qual subconjunto de células T auxiliares é a principal fonte de GM-CSF na patogênese das doenças inflamatórias, como a esclerose múltipla. A principal vantagem desta técnica é que ela gera mais de 50% de células T expressas em GM-CSF a partir de células T CD4 virgens com nenhuma ou poucas células de expressão gama OI17 interferentes, o que fornece fonte celular essencial para a investigação da regressão e função do THGM, um novo subconjunto de células T auxiliares. Demonstrando o procedimento estará Yi Lu, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.Comece usando uma pinça para levantar a pele sobre o abdômen de um camundongo de seis a oito semanas de idade e fazendo uma incisão de cerca de quatro centímetros abaixo da caixa torácica no lado esquerdo do animal. Abra o saco peritoneal para expor o baço e use uma pinça estéril para transferir o baço para um filtro de 70 micrômetros pré-umedecido com dois mililitros de tampão de isolamento celular. Quando dois a três baços tiverem sido coletados, use a ponta de uma seringa de cinco mililitros para macerar o tecido do baço e enxágue o filtro várias vezes com um a dois mililitros de tampão de isolamento celular até que todas as células tenham sido lavadas no tubo.Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de lise de potássio de cloreto de amônio de quatro graus Celsius. Após dois minutos de mistura suave, pare a lise com 10 mililitros de meio RPMI completo e centrifugue imediatamente as células. Para isolar as células T CD4 positivas, ressuspenda o grânulo branco em cinco mililitros de tampão de isolamento celular e filtre a suspensão celular através de um filtro de 30 micrômetros em um novo tubo de 15 mililitros para remover quaisquer detritos.Após a contagem, ressuspenda as células em uma vez 10 elevado às sétimas células por 90 microlitros de concentração tampão e adicione 10 microlitros de esferas magnéticas conjugadas anti-CD4 por um vezes 10 às sétimas células para uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius com mistura a cada cinco minutos. Enquanto as células estão incubando, coloque uma coluna de separação em um suporte magnético e pré-umedeça a coluna com dois mililitros de tampão. Em seguida, lave as células com cinco mililitros de tampão e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão.Carregar a amostra na coluna e recolher a fracção CD4 negativa num tubo cónico de 15 mililitros. Quando todas as células tiverem passado pela coluna, lave o reservatório três vezes com um mililitro de tampão por lavagem antes de secar. Após a última lavagem, transferir a coluna para um novo tubo cónico de 15 ml e mergulhar a coluna com dois mililitros de tampão de isolamento celular para expelir a fracção positiva do cordão.Em seguida, colete as células CD4 positivas por centrifugação. Para a classificação celular ativada por fluorescência das células T virgens, ressuspenda o grânulo de células CD4 positivas classificadas por esferas em 500 microlitros de tampão e misture as células com um coquetel de anticorpos conjugado com fluorescência apropriado. Após 20 a 30 minutos em gelo protegido da luz, lave as células em cinco mililitros de tampão fresco e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão fresco.Filtre as células através de uma malha de nylon e transfira as células para um tubo FACS pré-revestido com 500 microlitros de tampão. Gate para selecionar as populações de células altas de ligantes CD4 positivos, CD25 negativos e CD44 baixo CD62. Em seguida, classifique as frações de células T CD4 CD25 negativas CD44 CD62 ligantes em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros e pulverize as células T CD4 positivas virgens isoladas por centrifugação.Para diferenciação de células T auxiliares do fator estimulador de colônias de macrófagos de granulócitos ou GM-CSF, ressuspenda as células T classificadas em uma concentração de uma vez 10 elevado à sexta células por mililitro em meio RPMI completo contendo 50 beta-mercaptoetanol micromolar e aspire o anticorpo épsilon anti-CD3 de cada poço de uma placa pré-revestida de 48 poços. Em seguida, semeie 2,5 vezes 10 até a quinta célula em cada poço junto com IL7, anti-CD28 e anti-IFN gama e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por três dias. No terceiro dia de cultura, use um microscópio para verificar a diferenciação celular e colher as células para centrifugação.Ressuspenda o pellet em meio RPMI completo fresco por duas lavagens, ressuspendendo as células em um mililitro de meio completo fresco após a segunda lavagem para contagem. Divida as células em três volumes iguais e reestimule a primeira alíquota de células com PMA e ionomicina na presença de um inibidor do transporte de proteínas por quatro a seis horas. No final da estimulação, colha as células para coloração com anticorpo anti-CD4.Após 30 minutos, fixar as células com 200 microlitros de tampão de fixação por 20 a 60 minutos, seguido de duas lavagens em um mililitro de tampão de permeabilização por lavagem. Em seguida, core para expressão de citocinas intracelulares por 30 minutos no escuro. Para análise quantitativa de PCR da expressão gênica de citocinas celulares diferenciadas, ative as células com épsilon anti-CD3 ligado à placa por três horas.Em seguida, use um reagente de extração de RNA de fenol para isolar o RNA total para permitir a preparação de cDNA para PCR quantitativo. Para avaliar a secreção da proteína citocina pelas células diferenciadas, reestimule as células com épsilon anti-CD3 ligado à placa por 24 horas e analise os sobrenadantes de cultura para IL17 e GM-CSF por ELISA. Cerca de 55% das células cultivadas sob condições de diferenciação de células T auxiliares GM-CSF expressaram GM-CSF, enquanto apenas cerca de 2% das células diferenciadas sob condições T auxiliares 17 expressaram essa citocina.Em comparação com as condições de diferenciação do T-helper 17 que resultam na produção de IL17 por cerca de 8% das células, as condições de diferenciação das células T auxiliares GM-CSF induziram a expressão de IL17 em apenas cerca de 1% das células. Notavelmente, apenas uma fração das células expressa IFN gama ou IL4 em qualquer condição de cultura. As células diferenciadas T auxiliares GM-CSF demonstram uma expressão significativamente maior de mRNA CSF2, mas uma expressão muito menor de IL17 em comparação com as células T helper 17.Isso se correlaciona com a expressão da proteína GM-CSF observada em sobrenadantes de cultura de células T auxiliares GM-CSF e T auxiliares 17, com três vezes a concentração da citocina detectada em culturas de células T auxiliares GM-CSF e nenhuma IL17 mensurável. As células T auxiliares GM-CSF também exibem uma expressão ligeiramente menor de Rorc, uma expressão mais alta de Stat5 e uma expressão ligeiramente menor de Stat3 do que as células T auxiliares 17, indicando que, embora a diferenciação de células T auxiliares GM-CSF e IL17 sejam governadas por diferentes fatores transcricionais, elas podem compartilhar algumas características comuns. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar todas as etapas no gabinete de segurança biológica para manter as células e os reagentes estéreis.Após este procedimento, outros métodos, como a análise do transcriptoma, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: quais são os genes importantes expressos pelas células THGM? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem como o GM-CSF derivado de células T contribui para a inflamação em roedores. Não se esqueça de que trabalhar com beta-mercaptoetanol e reagente de extração de RNA pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de capelas de exaustão devem sempre ser tomadas ao usar esses reagentes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o priming de monócitos primários em macrófagos. Os monócitos humanos primários podem ser isolados e diferenciados para um fenótipo pró-inflamatório semelhante ao M1 usando o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) ou para um fenótipo anti-inflamatório semelhante ao M2 usando o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF).

Cultura in vitro e diferenciação de monócitos primários em macrófagos

Este vídeo descreve um método in vitro para gerar macrófagos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). A geração de macrófagos a partir de iPSCs ocorre em três estágios: (i) agregação de iPSCs em suspensão para formar corpos embrióides tridimensionais (EBs) que se diferenciam em células mesodérmicas, (ii) formação de células precursoras de macrófagos a partir de EBs diferenciados e (iii) diferenciação das células precursoras de macrófagos em macrófagos maduros e...

Diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em macrófagos

Este vídeo demonstra a diferenciação in vitro do fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos ou células T auxiliares produtoras de GM-CSF (THGM). As células T virgens isoladas são estimuladas para diferenciação em THGM, o que é confirmado pela detecção de alta produção intracelular de GM-CSF e uma baixa expressão de outras citocinas específicas de células T auxiliares.

Uma técnica in vitro para diferenciar células T auxiliares produtoras de GM-CSF de células T virgens

As células-tronco embrionárias de camundongos podem ser diferenciadas em células T in vitro usando o sistema de co-cultura OP9-DL1. O sucesso neste procedimento requer atenção cuidadosa à manutenção do reagente/célula e às principais etapas sensíveis à técnica. Aqui, discutimos esses parâmetros críticos e fornecemos um protocolo detalhado para incentivar a adoção dessa tecnologia.

Derivação de células T In Vitro De Mouse Células-Tronco Embrionárias

Células da medula óssea cultivadas com fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) geram uma cultura heterogênea contendo macrófagos e células dendríticas (DCs). Este método destaca o uso da ligação de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar macrófagos das DCs na cultura GM-CSF. Os macrófagos nesta cultura têm muitas semelhanças com os macrófagos alveolares.

Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O protocolo utiliza a criopreservação de monócitos juntamente com sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos colhidos podem ser semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos.

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

Apresentam-se aqui detalhados protocolos para a linha de celular de 32G/G-CSF-R precursor mieloide murino de cultivo, realizando a infecções virais e realizar ensaios de proliferação e diferenciação. Esta linha de celular é adequada para estudar o desenvolvimento de células mieloides e o papel dos genes de interesse no crescimento de células mieloides e diferenciação neutrofílica.

Proliferação e diferenciação de murino Precursor mieloide 32G/G-CSF-R células

Neste artigo, nós fornecemos que um protocolo detalhado para a expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas. O método é baseado na transdução da medula óssea progenitores com construções retrovirais seguidas por diferenciação em macrófagos e dendríticas células em vitro.

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Este estudo descreve um método para isolar vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fatores estimulantes da colônia de granulocitos imunes de células-tronco embrionárias.

Isolamento de vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fator estimulante da colônia granulocito-macrófago de células-tronco embrionárias

Este protocolo descreve a geração robusta de macrófagos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e métodos para sua caracterização subseqüente. A expressão do marcador de superfície celular, a expressão genética e os ensaios funcionais são usados para avaliar o fenótipo e a função desses macrófagos derivados do iPSC.

Produção e Caracterização de Macrófagos Humanos de Células-Tronco Pluripotentes

Aprenda a diferenciar células T H GM de células T CD4+ naïve de camundongo para estudos de imunologia e doenças inflamatórias. Este método gera mais de 50% de células expressando GM-CSF.

In Vitro Diferenciação de Mouse Granulócito-macrófago-colônia-estimulando Factor (GM-CSF)-produzindo pilhas de T Helper (T_HGM)

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