Caracterização da ruptura de membrana de Plasma MLKL-mediada em Necroptosis

Esses métodos podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre o papel da pseudoquinase de linhagem mista quinase ou MLKL na necroptose, como translocação de membrana e permeabilização na ligação lipídica. A principal vantagem dessas técnicas é que elas implicam diretamente o MLKL como o executor da ruptura da membrana plasmática na necroptose. A imagem de células vivas revolucionou o campo da pesquisa de morte celular, especialmente para necroptose mediada por MLKL.

A ressonância magnética nuclear é uma técnica poderosa para monitorar a ligação lipídica a proteínas, conforme demonstrado aqui para MLKL. Comece plaqueando cinco vezes 10 elevado ao quarto MLKL knockout de fibroblastos embrionários de camundongo ou MEFs expressando o domínio executor de MLKL fundido a um de oligomerização e Vênus em um mililitro de DMEM suplementado em placas de 24 poços para sua incubação noturna em uma incubadora de cultura de células. Na manhã seguinte, trate as células com doxiciclina por 12 horas para induzir a expressão do transgene, seguido pela adição de DMEM padrão suplementado com dimerizador de proteína de ligação a FK506 e corante fluorescente verde impermeável à membrana para induzir necroptose.

Para monitorar a morte celular, coloque a placa em uma unidade de imagem apropriada alojada em uma incubadora de cultura de tecidos de mamíferos e abra o software do sistema de imagem. Selecione a guia Agendar Próximas Verificações e selecione a bandeja, o recipiente, os tipos de verificação e o padrão de verificação na guia Layout Físico. Selecione fluorescência rápida na guia Propriedades e clique na janela Linha do tempo e o número total de pontos de tempo e frequência de aquisição para adicionar o tempo de varredura.

Em seguida, clique em Aplicar para iniciar a aquisição da imagem. Para quantificar a necroptose, selecione o painel Tarefas e passe o cursor do mouse sobre o plano de fundo de várias imagens para definir a nova análise de contagem de objetos com limite de segmentação fixo acima do nível do plano de fundo. Em seguida, selecione Visualização para examinar os objetos fluorescentes na imagem atual e refinar os níveis de limite conforme necessário.

A seleção cuidadosa do limite pode ser realizada observando vários poços na placa e usando o recurso de visualização no software. Apenas esteja ciente de usar a mesma configuração de limite para todos os poços na placa. Para integrar as contagens de fluorescência verde, na guia Iniciar nova análise, selecione o intervalo de tempo e os poços a serem analisados e insira o nome do trabalho de análise.

Em seguida, clique em OK e clique duas vezes no nome do trabalho para exportar os dados para análise adicional em um programa de software gráfico apropriado. Para a ligação lipídica do MLKL por espectroscopia de ressonância magnética nuclear ou RMN, use seringas herméticas para alíquota de um miligrama por mililitro dos fosfolipídios de interesse em frascos de vidro limpo para séries individuais de titulação de RMN e coloque os frascos sob uma corrente gasosa de argônio ou nitrogênio por cinco a 30 minutos. A distribuição de lipídios de solventes voláteis, como clorofórmio ou metanol, deve ser realizada rapidamente a partir de estoques mantidos em gelo seco, a fim de minimizar inconsistências nas concentrações de lipídios entre as amostras devido à evaporação do solvente.

No final do período de evaporação, use uma pinça grande para organizar os frascos no fundo de um frasco de Buchner. Feche o frasco com uma rolha de borracha e prenda um tubo de plástico conectado a uma linha de vácuo para evacuar o conteúdo do frasco sob vácuo suave durante a noite para remover quaisquer orgânicos residuais. Na manhã seguinte, adicione tampão NMR suplementado com detergente na concentração experimental apropriada a cada frasco de vidro com um filme lipídico e sonice o frasco em banho-maria por até 30 minutos, interrompendo a sonicação a cada 10 minutos para verificar a solubilização do filme lipídico.

No final da sonicação, deixe os frascos esfriarem por 15 minutos e execute uma diluição em série das micelas de detergente lipídico em tampão de RMN positivo para detergente, sonicando as misturas 1:1 para a série de concentrações desejada. Preparar amostras de RMN de controlo e de referência de proteínas e aditivos em tampões de RMN detergente negativo e detergente-positivo, respectivamente, adicionando proteínas e aditivos a cada diluição lipídica em tampão detergente positivo. Em seguida, transfira o volume apropriado de amostras para tubos de RMN de tamanho adequado e carregue as amostras no instrumento de RMN.

A necroptose completa de MEFs nocaute para MLKL pode ser observada dentro de uma hora após a oligomerização mediada por dímero de células pré-incubadas de doxiciclina que expressam o transgene fundido. Essa necroptose cinética rápida apóia o papel do MLKL como o suposto executor da ruptura da membrana plasmática, resultando na produção de pontos de Vênus associados à membrana plasmática dentro de um a dois minutos de tratamento com o dímero e a codificação de Vênus da periferia celular e arredondamento celular gradual dentro de dois a três minutos. Sob necroptose rápida, as células mudam a morfologia de sua forma alongada normal para arredondadas e inchadas dentro de cinco minutos de oligomerização, parcialmente rompidas em 10 minutos e extensivamente desmanteladas com citosol desaparecido em 20 minutos.

Experimentos in vitro de ligação lipídica monitorados por espectroscopia de RMN revelam grandes mudanças estruturais na proteína do domínio executor MLKL após a ligação lipídica para deslocar a região da cinta inibitória da conformação N-helicoidal fechada para a conformação aberta e intrinsecamente desordenada, bem como informações por resíduo em misturas de ambos os conformadores. As porcentagens de conformadores fechados e abertos em uma determinada amostra também podem ser monitoradas, fornecendo evidências de apoio para a interação do domínio executor MLKL com fosfolipídios e sugerindo uma ligação direta entre MLKL e a membrana plasmática. Portanto, ao tentar quantificar a morte celular usando este procedimento, é importante saber e lembrar que o corante de ligação ao DNA tem fluorescência de limiar mais alto do que a proteína de fluorescência que normalmente codifica geneticamente.

Por esse motivo, eles podem ser usados em paralelo. Observe também que os lipídios micelares são sensíveis à temperatura e, portanto, a temperatura da amostra de RMN pode precisar ser otimizada. Portanto, após este procedimento, outra técnica pode ser usada, como microscopia de reflexão interna total e eletromicroscopia, para abordar a rapidez com que a ruptura celular ocorre nas células submetidas à necroptose e onde a ruptura está localizada na membrana plasmática.

Além disso, a termoforese em microescala pode ser realizada para validar ortogonalmente a ligação de MLKL a lipídios micelares. As técnicas descritas neste vídeo abriram caminho para pesquisadores no campo da necroptose explorarem o papel do MLKL como executor da ruptura da membrana plasmática. Não se esqueça de que trabalhar com clorofórmio pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar luvas e trabalhar em uma área bem ventilada devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.