Name: Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a medir mitofagia celular em células HeLa usando citometria de fluxo com o repórter mt-Keima. Esta técnica sensível permite avaliação rápida sem coloração adicional, facilitando estudos sobre dinâmica mitocondrial.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por uma concessão do National Research Foundation da Coreia (2016R1D1A1B03931949) (de J. U.) e pela Fundação de pesquisa nacional de concessão de Coreia (NRF), financiado pela government(MSIT) da Coreia (n. º 2016R1A2B2008887, n. º 2016R1A5A2007009) (para J.Y .)

1. geração de células HeLa expressando mito-Keima (mt-Keima)
<ol><li>
Preparação de lentivirus mt-Keima
	<ol>
<li>Revestir uma placa de cultura de 100-mm, adicionando 2 mL de 0,001% poli-L-lisina/fosfato-salino (PBS) e deixe repousar durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Remover a solução de poli-L-lisina, usando uma pipeta de vidro ligada a um vácuo e lavar o prato de cultura, adicionando 2 mL de 1X PBS.</li>
		<li>Placa de 1,5 x 106 HEK293T células na cultura revestida prato com 10 mL de DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e cultura as células a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos CO2 por um dia.</li>
		<li>Transfect 2 µ g de mt-Keima particulas de Lentivirus shRNA29 DNA juntamente com embalagem DNAs (psPAX 2 µ g e pVSVG 0,25 µ g) usando um reagente de Transfeccao para 8 h de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Remova a mídia do transfection e adicionar 8 mL de mídia fresca.</li>
		<li>Recolha a mídia que contém partículas virais 48 h mais tarde. Remover restos celulares da mídia coletada por centrifugação a 500 x g durante 5 min e filtrá-los com um filtro de seringa de 0,45 µm. Nota: Para uso a longo prazo, fazer alíquotas de particulas de Lentivirus e armazenar as amostras a-80 ° C. Não submeter as amostras virais para congelamento-descongelamento ciclos eficientes de infecção viral.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Infectando as células HeLa-Parkin com mt-Keima lentivirus
	<ol>
<li>Placa de 5 x 104 as células HeLa expressando Parkin (HeLa-Parkin) em um prato de cultura de 60-mm com 4 mL de DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina a 37 ° C, um dia antes da colheita do lentivirus mt-Keima. Nota: Por causa da ausência de expressão de Parkin endógena em HeLa células30, as células HeLa-Parkin usadas aqui para mais claramente mostrar CCCP-induzida mitophagy. Este procedimento também pode ser aplicado a outras linhas de célula primária ou imortalizado.</li>
		<li>Remover o meio de crescimento, no dia seguinte e adicione 1 mL de Lentivirus mídia mt-Keima. Adicione um adicional 2 mL de meio de cultura contendo 3 µ l de solução-mãe de polybrene (8 mg/mL em água destilada). Incube durante um dia em uma incubadora de cultura de tecidos CO2 .</li>
		<li>Retire a mistura de Lentivirus de mt-Keima no dia seguinte e lavar as células duas vezes com PBS 1x. Adicionar 4 mL de meio de crescimento e tratar as células com 2 puromicina µ g/mL para dois dias.</li>
		<li>Após dois dias de puromicina, retire o meio de crescimento e lave as células duas vezes com 1X PBS. Adicionar meio de crescimento e cultura das células numa incubadora de CO2 até o uso. Nota: Esse método pode ser aplicado para gerar células que expressam estàvel mt-Keima, incluindo outras linhas de células e as células primárias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. indução de mitophagy usando CCCP tratamento e preparação de amostras de FACS
<ol style="margin-left: 40px;"><li>Placa de 5 x 104 HeLa-Parkin células expressando mt-Keima em uma cultura de 60mm prato com 4 mL de DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e cultura-los por um dia a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos CO2 .</li>
	<li>Retire o meio de crescimento no dia seguinte e adicione 4 mL de DMEM fresco contendo 10 µM carbonila cianeto m-clorofenilhidrazone (CCCP). Incube as células HeLa-Parkin-mt-Keima numa incubadora de tecido CO2 para 6 h.</li>
	<li>Retire o meio de crescimento 6 h depois e lave as células com 2 mL de 1X PBS. Separar as células, tratando-as com solução de tripsina/EDTA e inativar a tripsina pela adição de meio de cultura contendo 10% FBS. Transferi as células para um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar as células a 500 x g por 5 min.</li>
	<li>Cuidadosamente Retire o meio de crescimento por aspiração e ressuspender as células com 1 mL de PBS 1x frio.</li>
	<li>Células de transferência para o tubo de FACS apropriado e coloque-o no gelo. Nota: Prepare as células de HeLa não infectadas como controlo negativo. Nota: As células são viáveis no gelo durante várias horas, e sinais de fluorescência de mt-Keima também permanecem estáveis.</li>
</ol>3. análise FACS de mitophagy
Nota: Neste estudo, as células foram analisadas com um citômetro de fluxo, equipado com um laser 405 nm e 561-nm. Células estavam animadas com um laser violeta (405 nm) com emissão detectada em 610 nm ± 10 com um detector de BV605 e com um laser verde-amarelo (561 nm) com emissão detectada em 610 nm ± 10 por um detector de PE-CF594 simultaneamente (Figura 1).
<ol><li>
Retenção de células vivas
	<ol>
<li>Ligue o citômetro de fluxo e o computador e logar o software de análise.</li>
		<li>Gerar uma nova experiência ou duplicar uma experiência existente. Para excitar as células com a violeta (405 nm) e verde-amarelo (561 nm) lasers e detectar emissões no detector de nm ± 10 610, selecione BV605 e PE-CF594 além de dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) na janela de parâmetro como fluorophores necessária. Nota: Todos os fluorophores deve ser adicionados em um modo linear.</li>
		<li>Vórtice cada amostra de célula brevemente para dispersar a célula agrega.</li>
		<li>Colocar o tubo contendo uma amostra de célula HeLa-Parkin de controle que não está infectada com mt-Keima lentivirus na porta de injeção de amostra e carregue no botão "executar" o citômetro.</li>
		<li>Na trama do ponto do FSC contra SSC, ajuste a voltagem FSC e SSC para colocar pilhas no centro da trama do ponto.</li>
		<li>Desenhar uma porta P1 usando o ícone de polígono ao redor de células vivas e eliminar as células mortas e detritos celulares (Figura 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ajustar voltagens para laser violeta e verde
	<ol>
<li>Coloca o tubo contendo as células HeLa-Parkin infectadas com mt-Keima lentivirus sobre a injeção de amostra da porta e carregue no botão "executar" o citômetro.</li>
		<li>Na trama do ponto de BV605 (405 nm) contra SSC, ajustar a tensão de BV605 para que as células HeLa-Parkin expressando mt-Keima distinguem-se claramente das células de controle que não expressam mt-Keima (Figura 2B).</li>
		<li>Na trama do ponto de PE-CF594 (561 nm) contra SSC, ajustar a tensão de PE-CF594 para que as células HeLa-Parkin expressando mt-Keima distinguem-se claramente das células de controle (Figura 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Avaliar a percentagem de células em mitophagy
	<ol>
<li>Adquira a BV605 contra a trama do ponto do PE-CF594 usando uma escala linear. Desenhar uma porta usando o ícone de polígono ao redor de células expressando mt-Keima e eliminar as células não expressando mt-Keima (Figura 3A). A população de fluorescência-positivo celular mt-Keima é referida como o "mt-Keima" portão.</li>
		<li>Criar outra trama do ponto de BV605 contra CF594-PE mostrando somente "mt-Keima"-condomínio fechado de células. Nesta trama de ponto, desenhe um portão ao redor não tratadas células de mt-Keima-positivo. A atividade de mitophagy basal de controle HeLa células é baixa, e a relação das emissões em PE-CF594/BV605 é menor que 1. Assim, este portão é referido como o "baixo" portão.</li>
		<li>Desenhe outro portal que contém a região acima do portão "baixa". Este portão é referido como o "alto" portão porque ele contém células com mitophagy de alta atividade, isto é, células com uma alta proporção de emissões no PE-CF594/BV605 (Figura 3B).</li>
		<li>Para calcular a percentagem de células no portão "alta", selecione o menu "Mostrar hierarquia de população". O valor de "Por cento do pai" (% pai) representa a porcentagem de células em "alta" portão entre a população de mt-Keima-positivo.</li>
		<li>Defina pelo menos 10.000 eventos para gravar no portão "mt-Keima" parar e executar cada amostra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+More+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: More than just a powerhouse.</a> Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).</li>
<li>Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZorov%2C+DB+%22Bioscience+Reports%22">Bioscience Reports</a>. 17 (6), 507-520 (1997).</li>
<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+control+of+cellular+life%2C+stress%2C+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial control of cellular life, stress, and death.</a> Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).</li>
<li>Kang, D., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+mitochondrial+DNA+in+common+diseases+and+disease+states%3A+aging%2C+neurodegeneration%2C+heart+failure%2C+diabetes%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer.</a> Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).</li>
<li>Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26942670">The mitochondrial basis of aging.</a> Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biology%2C+degenerative+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22BioFactors%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging.</a> BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).</li>
<li>Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitohormesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitohormesis.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).</li>
<li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li>
<li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Drosophila+PINK1+mutants+is+complemented+by+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).</li>
<li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li>
<li>Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+the+banquet%3A+Mitochondrial+biogenesis%2C+mitophagy%2C+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival.</a> Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).</li>
<li>Um, J. H., Yun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+mitophagy+in+human+diseases+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology.</a> BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).</li>
<li>Al Rawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfertilization+autophagy+of+sperm+organelles+prevents+paternal+mitochondrial+DNA+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission.</a> Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).</li>
<li>Kim, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SESN2%2Fsestrin2+suppresses+sepsis+by+inducing+mitophagy+and+inhibiting+NLRP3+activation+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages.</a> Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).</li>
<li>Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%3A+A+balance+regulator+of+NLRP3+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation.</a> BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).</li>
<li>Sandoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+Nix+in+autophagic+maturation+of+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells.</a> Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).</li>
<li>Sato, M., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+paternal+mitochondria+by+fertilization-triggered+autophagy+in+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos.</a> Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).</li>
<li>Geisler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2FParkin-mediated+mitophagy+is+dependent+on+VDAC1+and+p62%2FSQSTM1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).</li>
<li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li>
<li>Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+iron+triggers+PINK1%2FParkin-independent+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li>
<li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li>
<li>Kubli, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+Is+dispensable+for+mitochondrial+recruitment+of+Parkin+and+activation+of+mitophagy+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes.</a> PloS One. 10 (6), e0130707(2015).</li>
<li>Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+techniques+to+measure+mitophagy+using+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy.</a> Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).</li>
<li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+an+autophagosome+marker%2C+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy%3A+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+links+between+sirtuins+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The emerging links between sirtuins and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26549682">Measuring In vivo Mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li>
<li>Denison, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+common+fragile+site+gene+Parkin+in+ovarian+and+other+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers.</a> Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).</li>
<li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+Basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: Basic principles and applications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li>
<li>Bingol, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+deubiquitinase+USP30+opposes+parkin-mediated+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy.</a> Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).</li>
<li>Burbulla, L. F., Kruger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+primary+human+fibroblasts+for+monitoring+mitochondrial+phenotypes+in+the+field+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease.</a> Journal of Visualized Experiments. 68, e4228(2012).</li>
<li>Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+video+microscopy+for+assessment+of+EYFP-Parkin+aggregation+as+a+marker+for+cellular+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy.</a> Journal of Visualized Experiments. 111, e53657(2016).</li>
<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+detection+of+mitophagy+in+human+cells%2C+C.+Elegans%2C+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 129, e56301(2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, apresentamos um método rápido e sensível para a utilização de citometria de fluxo para medir a atividade celular mitophagy em células expressando mt-Keima. Passando por um elevado nível de mitophagy de células apresentam uma maior proporção de PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitação. Assim, a atividade mitophagy pode ser expressa como a porcentagem de células exibindo um elevado rácio de 561/405. Calculámos a percentagem de células na região de portão "alto" em um terreno de ponto de PE-CF594 (561 nm) contra B...

As mitocôndrias são organelas que são essenciais para a fisiologia e a proliferação celular. As mitocôndrias são responsáveis pela geração de mais de 80% da fonte de ATP via fosforilação oxidativa, e eles também fornecem vários intermediários metabólicos para biossíntese e metabolismo de1,2. Além de seus papéis no abastecimento de energia e metabolismo, as mitocôndrias desempenham um papel central na muitos outros processos importantes, incluindo a geração de (ROS) de espécies reactivas de oxigénio, a regulação da morte celular e Ca2 + dinâmica intracelular3 . Alterações na função mitocondrial têm sido associadas com doenças humanas, incluindo o câncer, diabetes mellitus e neurodegenerativas várias doenças4,5. Aumento de disfunção mitocondrial e mutações de DNA mitocondriais também são pensadas para contribuir para processos de envelhecimento normal a6,7,8. Portanto, o controle de qualidade é uma questão crucial nas mitocôndrias. As mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas que continuamente podem mudar a sua forma entre redes alongadas e formulário curto, fragmentado. Dinâmica de mitocôndrias desempenha um papel importante em manter a função das mitocôndrias, bem como a sua degradação a mitophagy9.
Mitophagy é um mecanismo que envolve a degradação seletiva de mitocôndrias inteira usando a maquinaria de autofagia. Mitophagy é o princípio mecanismo subjacente mitocondrial volume de negócios e a remoção de mitocôndrias danificadas ou disfuncionais. Neste processo, as mitocôndrias são primeiro rodeadas por uma membrana, resultando na formação de autophagosomes, que depois se fundem com lisossomos para degradação hidrolítica9. Estudos genéticos anteriores em Drosophila sugeriram que dois genes relacionados com a doença de Parkinson, induzida por PTEN putativa quinase 1 (PINK1) (PARK6) e Parkin (PARK2), funcionam na mesma via10,11. Subsequence estudos têm demonstrado que a via PINK1-Parkin é responsável por eliminar as mitocôndrias danificadas e defeitos deste resultado de percurso em mitophagy disfuncional e pode contribuir para doenças humanas12,13. Recentemente foram encontrados em várias doenças humanas, incluindo câncer, doenças cardíacas, doenças do fígado e de doenças neurodegenerativas 14defeitos em processos de mitophagy. Além disso, estudos recentes têm mostrado também que mitophagy é fundamental para muitos processos fisiológicos, tais como a diferenciação, desenvolvimento e a resposta imune15,16,17,18 ,19, sugerindo que mitophagy pode desempenhar um papel mais ativo no controle de funções de células.
Apesar da recente confirmação que mitophagy desempenha um papel importante no controle de qualidade tanto em mitocôndrias e doenças humanas, os mecanismos moleculares subjacentes mitophagy permanecem mal compreendido. Embora mecanismos relacionados com mitophagy têm sido sistematicamente estudados em levedura, estudos vistos explorar mecanismos relacionados com mitophagy em células de mamíferos têm focado principalmente via PINK1-Parkin. Estudos anteriores estabeleceram que o pathway PINK1-Parkin é principalmente responsável para a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas através de mitophagy12,20,21. No entanto, estudos recentes têm relatado que, em alguns modelos, mitophagy pode ser ativado mesmo na ausência de funcional PINK122,23,24. Estes resultados sugerem que além da via PINK1-Parkin, lá uma adicional via não identificada que pode ativar o mitophagy.
A ausência de um método conveniente para avaliar a atividade de mitophagy é um grande obstáculo para explorar os caminhos que regulam a mitophagy e o seu papel em eventos fisiopatológicos. Microscopia eletrônica é uma poderosa ferramenta para visualizar diretamente as mitocôndrias autophagosome-tragado. No entanto, a microscopia eletrônica tem limitações para quantificar a atividade de mitophagy. Embora as estratégias que usam microtubule-associada da proteína-1 luz corrente 3 (LC3)-conjugadas sondas fluorescentes, tais como a GFP-LC3, são atualmente as abordagens mais amplamente utilizado,25, a natureza transitória do sinal LC3-baseado e sua alta taxa de sinais de falso-positivos limitam sua sensibilidade para a detecção de mitophagy em células26. A combinação da mancha ocidental para medir o nível de proteína mitocondrial, a quantificação do DNA mitocondrial e análise de microscopia de fluorescência para colocalize mitocôndrias com autophagosomes ou lisossomos pode ser uma boa abordagem para a avaliação mitophagy. No entanto, limitações de quantificação e falta de conveniência das metodologias existentes exigem novas abordagens. A introdução de uma nova proteína fluorescente dependente do pH, o alvo mitocondrial Keima (mt-Keima), melhorou muito a capacidade de detectar mitophagy27. Fundindo a sequência mitocondrial-direcionamento de subunidade de citocromo c oxidase VIII (VIII COX) em Keima, mt-Keima é direcionado para a matriz mitocondrial. A grande mudança no pico da excitação de Keima de 440 nm a 586 nm (correspondente a pH 7 e pH 4, respectivamente) pode ser utilizada para avaliar a mitophagy com boa sensibilidade em ambos in vitro e in vivo experimentos28,29 . Mais importante, a resistência de mt-Keima a degradação lisossomal faz com que a integração do sinal do mt-Keima em lisossomos, permitindo a fácil medição quantitativa da atividade mitophagy. A mudança de fluorescência que ocorre no mt-Keima pode ser analisada usando qualquer microscopia confocal ou fluxo cytometry28,29. No entanto, um método baseado em citometria de fluxo para medir a atividade de mitophagy usando mt-Keima não foi apresentado em detalhe a data.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para uma técnica baseada em citometria de fluxo para medir a atividade de mitophagy nas células usando mt-Keima. Embora nós mostramos aqui que análise de citometria de fluxo detectado com sucesso mitophagy CCCP-induzida em células HeLa, expressando Parkin, esta técnica pode ser aplicada a uma ampla variedade de tipos de células.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013,02</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa Térmica Turbofect</td><td>Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m filtro de seringa</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/ml</td></tr><tr><td>puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazina (CCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPAMENTOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Bioscience</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>FACSDIVA</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSDIVA (v8.0.1)</td><td></td></tr></tbody></table>

medição de mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes flow cytometry usando o ph-dependente mt-keima

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy é um processo de remoção seletiva de mitocôndrias danificadas ou desnecessárias usando máquinas de autofagia. Foram encontradas relações estreitas entre mitophagy defeituoso e várias doenças humanas, incluindo doenças neurodegenerativas, câncer e doenças metabólicas. Além disso, estudos recentes têm mostrado que mitophagy está envolvido em processos celulares normais, tais como a diferenciação e desenvolvimento. No entanto, o papel preciso da e mecanismos moleculares subjacentes mitophagy exigem um estudo mais aprofundado. Portanto, é fundamental para desenvolver um método robusto e conveniente para medir as mudanças na atividade de mitophagy. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para avaliar quantitativamente a atividade mitophagy através de citometria de fluxo usando a proteína fluorescente mitocôndrias-alvo Keima (mt-Keima). Este ensaio de citometria de fluxo pode analisar a atividade do mitophagy mais rapidamente e com sensibilidade que os métodos convencionais microscopia ou immunoblotting-based. Este protocolo pode ser aplicado para analisar a atividade mitophagy em vários tipos de células.

Um exemplo da análise de citometria de fluxo de mitophagy CCCP-induzida em células HeLa-Parkin é mostrado na Figura 4. Usando o método de análise de citometria de fluxo descrito acima, podemos detectar um aumento dramático em células mitophagic na porta do "alta". A percentagem de células no portão "alta" foi aumentada mais de 10-fold em comparação com células controle não tratados (Figura 4A). Este aumento na atividade de mitoph...

Mitophagy, a degradação seletiva da mitocôndria, tem sido implicada na homeostase mitocondrial e é desregulamentado em várias doenças humanas. No entanto, convenientes métodos experimentais para medir a atividade de mitophagy são muito limitados. Aqui, nós fornecemos um ensaio sensível para medir a atividade de mitophagy usando citometria de fluxo.

Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma técnica sensível para medir a atividade da mitofagia celular usando citometria de fluxo. Aqui demonstramos que este método foi usado com sucesso para avaliar o aumento dramático na mitofagia de células HeLa, após o tratamento com CCCP, um desacoplador mitocondrial. Essa técnica permite que a atividade dos mitófagos seja medida de forma muito rápida e fácil.A principal vantagem dessa técnica é que você pode medir com sensibilidade a atividade dos mitófagos em células vivas sem qualquer coloração adicional. Portanto, esta técnica será capaz de ajudar na compreensão do mecanismo e do papel fisiológico do mitófago. Demonstrando o procedimento estarão Jee-Hyun Um e Young Yeon Kim do meu laboratório.Comece este procedimento preparando o mt-Keima, um lentivírus Keima direcionado às mitocôndrias. Primeiro, semeie HEK293T células em uma placa de cultura revestida com poli-L-lisina e cultive-as a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos por um dia. No dia seguinte, transfecte HEK293T células com DNA lentiviral mt-Keima e empacote DNase usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante.Após oito horas

sensitive-measurement-mitophagy-flow-cytometry-using-ph-dependent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma abordagem robusta para monitorar a entrega de organelas para a luz ácida do vacúolo levedura para a degradação e reciclagem é descrito. O método baseia-se na rotulagem específica de organelas-alvo com uma geneticamente codificado fluorescência dupla emissão de pH biosensor, e visualização de células individuais usando a microscopia de fluorescência.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Aqui descrito é um método para detectar e quantificar as proteínas da membrana exterior mitocondrial por imunomarcação das mitocôndrias isoladas a partir de tecidos de roedores e de análise por citometria de fluxo. Este método pode ser estendido para avaliar os aspectos funcionais de subpopulações mitocondriais.

Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

Aqui, descrevemos em detalhes uma abordagem de microscopia de vídeo com lapso de tempo para medir o recrutamento temporal de EYFP-Parkin durante a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas. Este processo dinâmico de remoção dependente de EYFP-Parkin de mitocôndrias danificadas pode ser usado como um indicador da saúde celular sob diferentes condições experimentais.

Time-Lapse Vídeo Microscopia de Avaliação da EYFP-Parkin Agregação como um marcador para Cellular Mitophagy

Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Mitophagy, o processo de compensação danificada mitocôndrias, é necessário para a manutenção de saúde e homeostase mitocondrial. Este artigo apresenta alguns dos mitophagy mais recente métodos de deteção em células humanas, Caenorhabditis eleganse os ratos.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Este artigo ilustra um poderoso método para quantificar as mitocôndrias ou lisossomos em células vivas. A combinação de corantes lisossomo mitocôndria-específico ou com conjugado fluorescente anticorpos marcadores de superfície permite a quantificação dessas organelas em populações de células mistas, como as células primárias de amostras de tecido, colhidas por meio de citometria de fluxo multicolor.

Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.

Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

A mitofagia é o principal mecanismo de controle de qualidade mitocondrial. No entanto, a avaliação da mitofagia in vivo é dificultada pela falta de ensaios quantitativos confiáveis. Apresenta-se aqui um protocolo para a observação da mitofagia em células vivas usando um corante de mitocôndrias verde-fluorescente per-celular e um corante lisossomático vermelho-fluorescente.

Visualizando a mitofagia com corantes fluorescentes para mitocôndrias e lisossomos

Explorar a mitofagia por meio de microscopia eletrônica, sensores genéticos e imunofluorescência requer equipamentos caros, pessoal qualificado e um investimento de tempo significativo. Aqui, demonstramos a eficácia de um kit comercial de corante de fluorescência na quantificação do processo de mitofagia em ambos Caenorhabditis elegans e uma linhagem celular de câncer de fígado.

Detecção de Mitofagia em Caenorhabditis elegans e Células de Mamíferos Usando Corantes Organel-Específicos

Este protocolo descreve dois métodos para a análise quantitativa da mitofagia em células β pancreáticas: primeiro, uma combinação de corantes específicos para mitocôndrias permeáveis a células e, segundo, um repórter de mitofagia codificado geneticamente. Essas duas técnicas são complementares e podem ser empregadas com base em necessidades específicas, permitindo flexibilidade e precisão na abordagem quantitativa do controle de qualidade mitocondrial.

Abordagens Complementares para Interrogar o Fluxo de Mitofagia em Células β Pancreáticas

Aprenda a medir mitofagia celular em células HeLa usando citometria de fluxo com o repórter mt-Keima. Esta técnica sensível permite avaliação rápida sem coloração adicional, facilitando estudos sobre dinâmica mitocondrial.

Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima

Explorar mais vídeos