Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma técnica sensível para medir a atividade da mitofagia celular usando citometria de fluxo. Aqui demonstramos que este método foi usado com sucesso para avaliar o aumento dramático na mitofagia de células HeLa, após o tratamento com CCCP, um desacoplador mitocondrial. Essa técnica permite que a atividade dos mitófagos seja medida de forma muito rápida e fácil.

A principal vantagem dessa técnica é que você pode medir com sensibilidade a atividade dos mitófagos em células vivas sem qualquer coloração adicional. Portanto, esta técnica será capaz de ajudar na compreensão do mecanismo e do papel fisiológico do mitófago. Demonstrando o procedimento estarão Jee-Hyun Um e Young Yeon Kim do meu laboratório.

Comece este procedimento preparando o mt-Keima, um lentivírus Keima direcionado às mitocôndrias. Primeiro, semeie HEK293T células em uma placa de cultura revestida com poli-L-lisina e cultive-as a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos por um dia. No dia seguinte, transfecte HEK293T células com DNA lentiviral mt-Keima e empacote DNase usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante.

Após oito horas de transfecção, remova o meio de transfecção e adicione oito mililitros de meio fresco. Colete os meios contendo partículas virais 48 horas depois e remova os detritos celulares por centrifugação. Em seguida, filtre a mídia contendo vírus com um filtro de seringa de 0,45 micrômetro.

Coloque as células HeLa-Parkin em uma placa de cultura de 60 milímetros um dia antes de colher o lentivírus mt-Keima e cultive as células com quatro mililitros de meio de crescimento por um dia a 37 graus Celsius em uma incubadora. No dia seguinte, remova o meio de crescimento, adicione um milímetro de meio de vírus mt-Keima, adicione mais dois mililitros de meio de crescimento contendo 3 microlitros de solução de estoque de polibreno e incube as células por um dia em uma incubadora de CO2. Às 24 horas após a infecção, remova o meio do vírus, lave as células duas vezes com PBS e adicione quatro mililitros de meio de crescimento.

Para remover células não infectadas, trate as células por dois dias com dois microgramas por microlitro de puromicina. Preparar um meio fresco contendo 10 CCCP micromolares. Remova o meio cultivado e adicione quatro mililitros de meio de crescimento fresco contendo CCCP.

Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de CO2 por seis horas. Remova o meio de crescimento e lave as células uma vez com PBS. Separar as células por tratamento com solução de tripsina EDTA.

Colete as células por centrifugação e ressuspenda-as em um mililitro de PBS. Transfira as células em um tubo FACS e coloque-as no gelo. Para citometria de fluxo, ligue o citômetro de fluxo e inicie o software de análise.

Gere um novo experimento e selecione BV605 para o laser violeta e PE-CF594 para o laser amarelo-verde na janela de parâmetros. Primeiro, execute uma amostra de controle de células não infectadas com o lentivírus mt-Keima. No gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral, desenhe uma porta, usando o ícone de polígono, ao redor das células vivas e elimine as células mortas e os detritos celulares.

Em seguida, execute células HeLa-Parkin infectadas com o lentivírus mt-Keima. No gráfico de pontos de BV605 versus dispersão lateral, ajuste a tensão para que as células HeLa-Parkin que expressam mt-Keima sejam claramente distinguidas das células de controle que não expressam mt-Keima. Em seguida, no gráfico de pontos de PE-CF594 versus dispersão lateral, ajuste a tensão para que as células HeLa-Parkin que expressam mt-Keima sejam claramente distinguidas das células de controle.

Em seguida, no gráfico de pontos de BV605 versus PE-CF594, selecione a população de células mt-Keima-positivas desenhando uma porta usando o ícone de polígono. Em seguida, crie outro gráfico de pontos de BV605 versus PE-CF594 mostrando apenas células fechadas mt-Keima. Neste gráfico de pontos, desenhe um portão ao redor de células mt-Keima positivas não tratadas.

Este portão é chamado de portão baixo. Em seguida, desenhe outro portão contendo a região acima do portão baixo. Essa porta é chamada de porta alta porque contém células com alta atividade mitofagia.

Em seguida, selecione o menu Mostrar Hierarquia de População. O valor de Porcentagem do Pai representa a porcentagem de células no portão alto entre a população positiva para mt-Keima. Agora execute cada amostra e registre pelo menos 10.000 eventos no portão de parada mt-Keima.

A análise por citometria de fluxo de células HeLa não tratadas expressando mt-Keima mostrou um baixo nível de mitofagia. O tratamento com CCCP induziu um aumento dramático nas células mitofagias na porta alta. A porcentagem de células mitofagias aumentou mais de 10 vezes seis horas após o tratamento com CCCP.

Este aumento na mitofagia pelo tratamento com CCCP foi completamente abolido pelo co-tratamento com bafilomicina A. Uma vez que as células que expressam mito-Keima estejam prontas, a medição de mitófagos usando citometria de fluxo pode ser realizada dentro de uma hora se preparada adequadamente. Para uma análise precisa dos mitófagos por citometria de fluxo, é importante configurar as portas altas e baixas corretas. Ao analisar novos tipos de células, é necessário usar células conhecidas, como as células HeLa, como controle.

Além disso, é importante lembrar que o mitófago deve ser totalmente confirmado por características adicionais, como diminuição da proteína mitocondrial e redução do DNA mitocondrial. Esta técnica pode ser aplicada a uma ampla variedade de tipos de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar mitófagos por citometria de fluxo.