Name: Eletrofisiologia celular de células enterocromafins murino culta primário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda eletrofisiologia celular de células enterocromafins murinas em cultura primária. Este método permite estudar em detalhe a excitabilidade dessas células usando técnicas de célula única.

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Os autores Obrigado Sra. Lyndsay Busby para assistência administrativa e Sr. Robert Highet da Mayo Clinic divisão de engenharia para design e impressão 3D da inserção da cultura de prato. Este trabalho foi financiado pelo NIH K08 AB (DK106456), piloto e subvenção de viabilidade para AB da Mayo Clinic Center para sinalização celular em Gastroenterologia (NIH P30DK084567) e 2015 gastroenterológica Association Research Scholar Award da American (AGA RSA) para AB e NIH R01 para GF (DK52766).

<ol><li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22normal%22+endocrine+cell+of+the+gut%3A+changing+concepts+and+new+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li>
<li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).</li>
<li>Strege, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+NaV1.3+is+important+for+enterochromaffin+cell+excitability+and+serotonin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release.</a> Scientific Reports. 7 (15650), (2017).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198 (2017).</li>
<li>Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channel+Piezo2+is+inhibited+by+D-GsMTx4%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4.</a> Channels. 11 (3), 245-253 (2017).</li>
<li>Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+activates+Galphaq+signaling+pathways+and+5-hydroxytryptamine+release+from+human+carcinoid+BON+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).</li>
<li>Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+characterization+of+normal+and+neoplastic+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channel+Piezo2+is+important+for+enterochromaffin+cell+response+to+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces.</a> The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).</li>
<li>Li, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cellular+origins+for+serotonin-expressing+and+enterochromaffin-like+cells+in+the+gastric+corpus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus.</a> Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).</li>
<li>Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+primary+cultures+of+murine+small+intestine+intended+for+the+study+of+gut+hormone+secretion+and+live+cell+imaging+of+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), 55687(2017).</li>
<li>Raghupathi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unique+release+kinetics+of+serotonin+from+guinea-pig+and+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).</li>
<li>Nozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+regulates+gastrointestinal+motility+through+serotonin+release+from+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).</li>
<li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).</li>
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Compreender plenamente a função de célula CE requer um método de cultura primária de alta qualidade para gerar células para eletrofisiologia da célula inteira. Culturas primárias de epitélio GI tinham sido tradicionalmente difícil devido a baixa sobrevivência. Atenuar este fator de confundimento, o presente método produz culturas de células de CE singular do intestino pequeno ou grande que são capazes de sobreviver por vários dias.
Nós achamos que encontravam-se crítico para melhorar a qualida...

Epitélio gastrointestinal (GI) é uma comunidade diversificada, consistindo de vários tipos de células. Células enteroendócrina compreendem aproximadamente 1% de todas as células epiteliais e células enterocromafins (CE) são a maior população do enteroendócrina célula1. Estudos recentes mostram que enteroendócrina2 e4 células de3,CE são eletricamente excitáveis. Estamos interessados em compreender a eletrofisiologia de célula primária CE. Assim, o objetivo deste estudo foi estabelecer culturas primárias de células CE otimizadas para eletrofisiologia da célula inteira.
Célula de CE existente linhas que produzem e secretam 5-HT (por exemplo, QGP-15, BON6, KRJ-17) e têm sido usadas para examinar a eletrofisiologia5,8 normalmente geradas a partir de imortalizado tumorais. tecidos. Enquanto as informações adquiridas destas linhas de célula são valioso5,8, estudos de eletrofisiologia da célula primária são necessários compreender corretamente a fisiologia celular de CE. A eletrofisiologia das células primárias do CE requer o isolamento e a cultura de células epiteliais única, que tem sido limitada pela baixa viabilidade das culturas epiteliais.
O método de cultura apresentado neste estudo se baseia em ratos transgénicos com células fluorescente etiquetadas do CE, como Tph1-PCP9, utilizado neste estudo. O método otimiza primária mista epiteliais culturas anteriormente desenvolveram2,10 para única célula eletrofisiologia3. Métodos anteriores combinações de tripsina/EDTA além de A colagenase ou de EDTA e de TDT para digestão enzimática e costumavam especificamente isolar e cultura cobaia11 e rato CE células12gradientes de densidade. Mais recentemente, organoids intestinais foram gerados e mecanicamente interrompidos para gravações eletrofisiológicos4. Culturas usando estes métodos são adequadas para serotonina liberar experimentos, análise de RT-qPCR e, enquanto eles poderiam ser usados para eletrofisiologia, são dependente do sucesso da geração de organoides demorado, gradientes de densidade para identificar células da CE e o celulares efeitos pertubadores da tripsina e EDTA. Por outro lado, o protocolo descrito aqui melhora a tratamentos mecânicos e enzimáticos, otimiza as condições de cultivo e simplifica procedimentos para produzir células única e saudáveis de CE apropriadas para os altos padrões celulares necessários para eletrofisiologia.
Este método será útil para os cientistas que querem trabalhar em células primárias de CE em culturas mistas, em vez de culturas imortalizadas e deseja investigar a eletrofisiologia das células únicas. No entanto, pode ser menos apropriado para o estudo de populações de células que necessitam de classificação ou a longo prazo as culturas que exigem sobrevivência passado 72 h.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de 100 mm x 15 mm</td><td>Pipeta de Transferência Corning (Falcon)</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 10 mL</td><td>Corning (Falcon)&nbsp;</td><td></td><td></td>357551</tr><tr><td>50 mL de Corning Cônico</td><td>(Falcon)&nbsp;</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>15 mL de Corning Cônico</td><td>(Falcon)&nbsp;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>1.000 mL Pontas de Tubulação de Barreira</td><td>Thermo Scientific (Art)</td><td>2079E</td><td>Mantenha os</td></tr><tr><td>Pratos de Fundo de Vidro MatTek</td> Estéreis <td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Mantenha o</td></tr><tr><td>Fórceps de Micro-dissecação estéril - Muito Fino, Pontas Extra-Longas</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>SB12630M</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica-Sharp</td><td>Nasco</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Micro-Dissecção</td><td>Nasco</td><td>SB46568M</td><td></td></tr><tr><td>Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX</td><td>Covidien</td><td>8881250172</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice</td><td>Jackson</td><td>Stock # 028366</td><td>Use camundongos machos ou fêmeas entre as idades de 4-7 semanas</td></tr><tr><td>Agulhas de seringa não metálicas Microfil (calibre 34, 67 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" Filme</td><td>de Laboratório Pechiney Plastic Packaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R6101</td><td>Seringa Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 6 mL com ponta luer regular</td><td>Seringa Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL com ponta luer regular</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento de Eletrofisiologia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de aquisição de dados (daq)</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Condicionador</td> <td>de sinalSoftware Molecular Devices</td><td>CyberAmp 320</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.6</td><td></td></tr></tbody></table>

eletrofisiologia celular de células enterocromafins murino culta primário

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Células enterocromafins (CE) no epitélio gastrointestinal (GI) constituem a maior subpopulação de células enteroendócrina. Como células sensoriais especializadas, CE células sentem estímulos luminal e convertê-los em eventos de liberação de serotonina (5-hyroxytryptamine, 5-HT). No entanto, a eletrofisiologia destas células é mal compreendida porque eles são difíceis para cultura e identificar. O método apresentado em culturas de células de CE primário este papel contornos otimizado para eletrofisiologia única célula. Este protocolo utiliza um repórter de proteína fluorescente ciano transgénicos (PCP) para identificar células de CE rato em culturas primárias mistas, avançando a abordagem para obtenção de gravações de alta qualidade de eletrofisiologia da célula inteira em modos de grampo de tensão e de corrente.

Culturas: Primárias células epiteliais murino, feitas a partir de um modelo de Tph1-PCP transgénico anexar aos pratos após 4 horas e estão prontas para experiências fisiológicas entre 24 a 72 h. Quando as condições de cultura não tinham sido otimizadas, a cultura de pilha epithelial consistia de grandes aglomerações, flutuante restos celulares, membranas danificadas e sinal fraco do PCP nas células CE (Figura 1A). Culturas...

Células enterocromafins (CE) compõem um pequeno subconjunto de células epiteliais gastrointestinais. Células de CE são eletricamente excitáveis e liberam serotonina, ainda dificuldades no cultivo e identificação de células CE limitados estudos fisiológicos. O método apresentado aqui estabelece um modelo de cultura primária favorável ao exame de células únicas CE por eletrofisiologia.

Eletrofisiologia celular de células enterocromafins murino culta primário

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na neurociência entônica e fisiologia gastrointestinal, tais como, quais são os mecanismos de excitabilidade celular enterochromaffin e resposta a estímulos luminosos, e quais são os mecanismos de liberação hormonal gastrointestinal? A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite estudar em detalhes células enteroromaffin usando técnicas unicelulares, como eletrofisiologia. Demonstrando o procedimento serão os co-primeiros autores Kaitlyn Knutson e Peter Strege, os excelentes tecnólogos que desenvolveram essas técnicas.Para iniciar este procedimento, coloque uma agulha de seringa de seis mililitros cheia de PBS gelado no lúmen do segmento intestinal extraído. Use os fórceps de microdisseção, aperte e sele os intestinos ao redor da agulha de seringa, e levemente lave seis mililitros de PBS através do lúmen para enxaguar qualquer matéria fecal. Em seguida, inverta o tecido intestinal tecendo suavemente os fórceps de microdisseção através do lúmen, beliscando uma parede intestinal e retraindo o tecido proximal à ponta dos fórceps.Repita este processo até que o segmento esteja de dentro para fora com o lúmen voltado para f

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kv canal disfunção está associada a arritmias cardíacas. Para estudar os mecanismos moleculares que conduzem à ocorrência de arritmias tais que utilizam um protocolo sistemático para o isolamento dos cardiomiócitos atriais e ventriculares do canal Kv auxiliares ratinhos knockout de subunidade. Cardiomiócitos isolados podem então ser imediatamente utilizados para celulares estudos eletrofisiológicos, bioquímicos ou imunofluorescência (IF) ensaios.

Isolamento e gravações de canais Kv em Murino cardiomiócitos atriais e ventriculares

Arginina-vasopressina (AVP) controla o ajuste fino da homeostase de água do corpo, facilitando a reabsorção de água pelas células principais renais. Aqui, apresentamos um protocolo para o cultivo de rato principal coletor medular interno células do duto adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à reabsorção de água AVP-mediada.

Cultura primária Rat coletor medular interno células dos ductos

Nós demonstramos um protocolo de cultura de células para o estudo directo de componentes neuronais e gliais do sistema nervoso entérico. Um neurônio / glia cultura mista em lamelas é preparado a partir do plexo mioentérico de rato adulto fornecendo a capacidade de examinar neurônio individual e função glia por eletrofisiologia,...

Um<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto

Este vídeo demonstra um protocolo para a realização de gravações eletrofisiológicas de fibra única em uma preparação in vitro do nervo colorreto de camundongo.

In vitro caracterização funcional de Rato Colorretal Aferente Endings

Uma vez removido do corpo, tecido neuronal é muito afectado pelas condições ambientais, conduz a uma eventual degradação do tecido após 6-8 h. Usando um método de incubação único, que acompanha de perto e regula o ambiente extracelular do tecido, a viabilidade do tecido pode ser significativamente prolongada por&gt; 24 h.

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Este protocolo descreve o isolamento e cultura de células do intestino delgado de murídeo mistos. Estas culturas primárias intestinais permitir a investigação das vias de sinalização subjacentes a secreção do péptido intestino utilizando um número de técnicas.

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas

Apresentamos um protocolo que combina o isolamento celular e a gravação de grampos-grampos de células inteiras para medir as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato. Este protocolo permite a investigação das propriedades funcionais das células epiteliais primárias epidídmicas para elucidar ainda mais o papel fisiológico do epidídimo.

Gravação de grampos-grampo de células inteiras de células epiteliais primárias isoladas do epidídimo

Descrevemos um método de preparação das únicas células musculares lisas dedestruição recém-isoladas de espécimes da bexiga urinária humana que empregam um procedimento enzimático de duas etapas. As células DSM viáveis obtidas podem ser estudadas por várias técnicas de células únicas, incluindo a biosfisiologia de grampo-patch-grampo dentre-aniciana-B descrita para revelar propriedades fisiológicas e farmacológicas.

Preparação e Utilização de células musculares lisas recém-isoladas para caracterização de correntes de cisão sensíveis ao 9 fenantropo

Apresentamos a metodologia para o isolamento dos miócitos de urina e como obter traços de tensão ou cálcio simultaneamente com traços de encurtamento de sarcomeros usando fotometria de fluorescência com medições simultâneas de geometria celular digital.

Imagem óptica de miócitos ventriculares isolados de urina

Este protocolo descreve uma técnica de imagem confocal para detectar três modos de fusão em células adrenals de chromaffin bovinas. Esses modos de fusão incluem 1) close-fusion (também chamado de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) stay-fusion, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento vesícula fundido.

Microscopia Confocal para medir três modos de dinâmica de poros de fusão em células adrenal chromaffin

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Aprenda eletrofisiologia celular de células enterocromafins murinas em cultura primária. Este método permite estudar em detalhe a excitabilidade dessas células usando técnicas de célula única.

Eletrofisiologia celular de células enterocromafins murino culta primário

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