Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes
24 de agosto de 2018
Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.
No campo de C. elegans, este método pode ajudar a responder a questões-chave que requerem a produção de grandes populações de nematóides e amostras usando cultura de placas. As principais vantagens deste protocolo são seu fácil estabelecimento e sua facilidade de descrição, incluindo armadilhas e aplicações. Depois de obter uma população sincronizada de nematóides, adicione aproximadamente um mililitro de tampão M nove às placas e distribua cuidadosamente o tampão balançando as placas.
Depois disso, colete os nematóides em um tubo de 15 mililitros. Agora, inverta o tubo e use um microscópio para avaliar a densidade dos nematóides. Ajustar a densidade da suspensão conforme necessário e continuar a avaliá-la ao microscópio.
Aplique 150 microlitros da suspensão diretamente nas placas com pontas de pipeta modificadas. Para garantir uma distribuição igual de nematóides entre as placas, inverter o tubo de suspensão em intervalos regulares. Primeiro, lave os nematóides usando uma ponta de pipeta modificada com aproximadamente 500 microlitros de tampão M nove.
Usando o mesmo tampão, continue destacando os nematóides até que a maioria dos animais seja coletada em suspensão. Em seguida, pegue os nematóides com uma ponta de pipeta modificada e transfira-os para uma placa com OP50. As pontas da pipeta modificadas diminuem a tensão de cisalhamento e os danos aos nematóides devido a um diâmetro maior.
Em seguida, deixe o prato secar. Antes de coletar amostras, prepare nitrogênio líquido para congelar os nematóides coletados. Em seguida, coloque o tampão M nove no gelo.
Aplique um mililitro de tampão M nove em cada prato e gire suavemente para lavar cada prato. Em seguida, pegue o volume do tampão M nove e transfira-o para novos tubos de 15 mililitros. Centrifugar brevemente o tubo a 800 vezes g, antes de retirar a maior parte do tampão M nove.
Em seguida, lave as amostras três vezes com 10 mililitros de tampão M nove para remover qualquer bactéria. Usando uma pipeta de vidro, transfira cada pellet para um tubo vazio de 1,5 mililitro. Use a pipeta de vidro para retirar um mililitro de tampão M nove do segundo tubo de 1,5 mililitro, para enxaguar os nematóides da parede da pipeta.
Em seguida, lave os nematóides restantes dos tubos de 15 mililitros e transfira-os para os tubos de amostra. Em seguida, centrifugar os tubos de amostra a 19 000 vezes g durante um minuto e remover o máximo possível de sobrenadante. Em seguida, sele cada tubo com filme de parafina e congele-os em nitrogênio líquido imediatamente.
Armazene os tubos a menos 80 graus Celsius até a preparação do lisado. Adicione os mesmos volumes de esferas de óxido de zircônio de 0,5 milímetro e o dobro do volume de tampão lisado com coquetel inibidor de proteinase a cada amostra congelada. Em seguida, coloque os tubos em um homogeneizador por um minuto na velocidade nove.
Centrifugue as amostras por 30 minutos a quatro graus Celsius e 19.000 vezes g. Finalmente, transfira o sobrenadante para um novo tubo no gelo e armazene-o a 80 graus Celsius negativos para experimentos futuros. Neste protocolo, grandes quantidades de C. elegans foram cultivadas para aplicações em pesquisas em diabetes.
O número de nematóides coletados correlacionou-se com o rendimento proteico do lisado, demonstrando que o isolamento proteico quantitativo reprodutível pode ser alcançado usando este protocolo. Análises espectrométricas de massa do metabólito reativo metilglioxal e produtos finais de glicação avançada formados pela exposição ao metilglioxal são mostradas aqui. Nematóides tratados com glicose e controles foram comparados.
A transferência de nematóides via pipeta pode criar tensão de cisalhamento, potencialmente prejudicando os nematóides. Os níveis de estresse oxidativo em nematóides pipetados e nematóides transferidos com fio metálico não diferiram usando este protocolo. Seguindo este procedimento, outros métodos como western blot podem ser realizados, a fim de responder a perguntas adicionais em proteômica.
Este protocolo também facilita experimentos que relacionam vários parâmetros à mesma população.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para o cultivo em larga escala de Caenorhabditis elegans em meio sólido. Essa abordagem facilita a produção de grandes populações e amostras de nematoides, melhorando a comparabilidade dos resultados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Microbiologia
Contexto
- Caenorhabditis elegans é um organismo modelo amplamente utilizado.
- O cultivo em placas oferece vantagens em relação ao cultivo líquido.
- Compreender a dinâmica populacional de nematoides é crucial para diversas aplicações de pesquisa.
- Este método aborda questões fundamentais na área de C. elegans.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo confiável para o cultivo de C.elegans em meio sólido.
- Permitir a produção de populações sincronizadas de nematoides.
- Facilitar experimentos que exigem grandes tamanhos de amostra.
Métodos Utilizados
- Sincronização de populações de nematoides.
- Aplicação do tampão M nove a placas.
- Avaliação microscópica da densidade de nematoides.
- Ajuste da densidade da suspensão conforme necessário.
Resultados Principais
- Estabelecimento bem-sucedido de culturas de nematoides em larga escala.
- Melhoria da comparabilidade dos resultados obtidos com o cultivo em placas.
- Identificação de armadilhas potenciais no protocolo.
- Aplicações em diversos contextos de pesquisa.
Conclusões
- Este protocolo fornece um método robusto para o cultivo de C.elegans.
- Ele aumenta a capacidade de realizar experimentos em larga escala.
- O método é simples e reprodutível.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O cultivo em larga escala de C. elegans permite o isolamento quantitativo e reprodutível de proteínas para a descoberta de biomarcadores relacionados ao diabetes, apoiando a validação de alvos em complicações neurodegenerativas. Este método fornece um fluxo de trabalho escalável e com minimização do estresse por cisalhamento para análise proteômica de AGEs e ROS, diretamente aplicável à desmistificação mecanicista no estágio inicial da descoberta de fármacos. Ao facilitar a preparação sincronizada de populações sob condições controladas, ele aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos de patologia diabética.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas que relacionam a exposição à glicose à formação de AGEs e EROs em modelos neuronais.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da correlação reprodutível entre o rendimento proteico e o número de nematoides.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao fornecer dados proteômicos quantitativos para a identificação de compostos promissores nas vias de complicações da diabetes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para aplicações downstream de blotagem ocidental e espectrometria de massa.
- Reprodutibilidade: Padroniza a preparação de amostras para minimizar o impacto fisiológico e garantir resultados proteômicos consistentes.
- Escalabilidade: Permite a integração de múltiplas análises em condições de cultivo idênticas, compatibilizando com triagem de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Apoia o estudo de complicações diabéticas por meio de modelos de C. elegans que exibem acúmulo de AGEs e ROS independentemente de fatores de confusão vasculares.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao permitir o preparo consistente de amostras em diferentes condições experimentais.
- Avanço Ajustado ao Risco: Fornece lisados confiáveis para análise de biomarcadores, reduzindo resultados falsos positivos na priorização de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método posiciona-se dentro do espectro de descobertas que vai da verificação de hipóteses até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, apoiando especificamente pesquisas sobre neurodegeneração relacionada ao diabetes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre alterações metabólicas no diabetes por meio de análise quantitativa de proteínas e metabólitos.
- Triagem: Fornece amostras prontas para ensaio com densidade padronizada e estresse de cisalhamento mínimo para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Permite a medição por espectrometria de massa de metilglioxal e AGEs, fornecendo leituras quantitativas para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta de fenótipos neuronais à continuidade pré-clínica por meio de fluxos de trabalho proteômicos consistentes.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o cultivo em larga escala de nematoides em múltiplos estudos relacionados ao diabetes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em modelos de complicações diabéticas.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade em fluxos de trabalho proteômicos, minimizando a variabilidade no preparo de lisados.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de avanço ou interrupção com base em dados confiáveis de biomarcadores, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados em programas para diabetes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em dados reprodutíveis de modulação de AGE e ROS.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manejo de C. elegans e em técnicas de sincronização.
- Necessita de acesso a centrífugas, homogeneizadores e nitrogênio líquido para o processamento das amostras.
- Exige padronização entre equipes na avaliação da densidade de suspensão e nos protocolos de lavagem.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir entre placas com diferentes condições experimentais.
- Inclui limitações práticas relacionadas à mitigação do estresse de cisalhamento durante as etapas de pipetagem, abordadas por meio de ponteiras modificadas.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:27
Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
