Name: Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Aprenda a cultivar Caenorhabditis elegans em escala em meio sólido para estudos de alterações metabólicas em Diabetes. Este protocolo permite produzir populações sincronizadas de nematoides com alta reprodutibilidade.

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Este estudo foi suportado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro a 1874 IRTG "Complicações microvasculares diabéticas" e CRC 1118 "Metabólitos reativos como causa para complicações tardias diabéticas". Cepas de c. elegans N2 e CL2166 foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40).

Nota: Este protocolo é dividido em cinco seções. Nas seções 1-3, é apresentado o protocolo principal à cultura de c. elegans em larga escala. Nas secções 4 e 5 fornecem protocolos adicionais para a avaliação dos metabolitos exemplificadas ocorrendo em metabólitos diabéticos. No detalhe, seção 1 descreve uma cultura geral em larga escala em placas. Secção 2 centra-se sobre a transferência de grandes quantidades de c. elegans, Considerando que a seção 3 explica que a colheita de uma amostra de grande escala. Seção 4 explica o isolamento de proteína da amostra e a seção 5 descreve a preparação de amostras para análises subsequentes líquida cromatografia-tandem espectrometria de massas (LC-MS/MS).
1. em grande escala cultura em placas
<ol><li>Em geral, trabalhe sob uma capa estéril ou perto de chamas para evitar contaminações.</li>
	<li>
A cultura vermes até atingirem a fase adulta jovem, siga este protocolo previamente publicado7 com as seguintes adaptações.
	<ol>
<li>Use vivos OP50 Escherichia coli bactérias para alimentar os nematódeos e preparar ágar de fluorodeoxyuridine 400 µM (não ampicilina/FUdR) para experimentos.</li>
		<li>Para a preparação de uma população síncrona, use OP50 não concentrado e para suceder experimentos com os adultos, use 3.3 x OP50 concentrada através da remoção de 70% do líquido sobrenadante.</li>
		<li>Recomendam-se intervalos de alimentação diários. Ao avaliar o estresse oxidativo, intervalos diferentes e volumes para a alimentação podem interferir com os resultados.</li>
		<li>Para inoculação, levar um prato com diversos nematódeos e corte em pedaços de aproximadamente 0,5 x 1 cm2 com um bisturi. Transferência de duas a três peças nas chapas de mídia (NGM) nematoides crescimento de 60 mm de diâmetro, contendo OP50 não concentrado.</li>
		<li>Incubar as placas à temperatura adequada para a tensão (N2 do selvagem-tipo devem ser cultivadas em 20 ° C) até que os ovos são visíveis na placa.</li>
		<li>Lave a maioria dos ovos e animais adultos com 2 mL de tampão de M9 e cobrá-los em um tubo de 15 mL. Centrifugar a suspensão de 800 x g por 2 min. Enquanto isso, comece a preparar a solução de branqueamento.</li>
		<li>Retire o tubo centrifugado e remover o tampão M9 com uma pipeta de 10 mL. Adicione 10 mL de solução de branqueamento e misture no vórtice até os nematódeos adultos lysed. Isso leva normalmente cerca de 5 – 7 min, mas não deve demorar mais do que 15 min ou os ovos não desenvolverá totalmente adiante no experimento.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de 800 x g por 2 min. lavar 3 vezes com 10 mL M9 para limpar os ovos da solução de branqueamento.</li>
		<li>Agora adicione 150 µ l de suspensão de ovo em placas OP50. Uma densidade de 200 – 300 ovos deve ser alcançada em cada prato. Espere até nemátodes alcançado o estágio adulto. Nota: O buffer de M9 (pH 7.0) usado para as experiências retratadas consiste das seguintes substâncias: 22mm KH2PO4, 42 mM Na2HPO4e 86 mM de NaCl. Após autoclavagem a mistura, adicione 1 mM MgSO4. A branqueamento solução contém 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl resolvido em água destilada.</li>
		<li>Prepare-se estéril M9 reserva, pontas de pipeta estéril com um corte de ponta para lavar o worms e tubos de 15 mL para coletá-los em.</li>
		<li>Aplicar aproximadamente 1 mL de tampão de M9 nas placas, delicadamente distribuir o buffer por balançando e, gentilmente, pipetar os nematódeos no prato.</li>
		<li>Agora, recolha os nematódeos no tubo. Aplicar 150 µ l de suspensão diretamente nas placas (semeado com OP50) com as pontas de pipeta corte e avaliar microscopicamente a densidade dos nematódeos (recomendado: 50 – 100 nematoides por placa de 60 mm).</li>
		<li>Se são muito densos, diluir a suspensão com buffer M9 e avaliá-lo sob o microscópio até a densidade desejada é atingida. Se o rendimento é muito pequeno, deixa os vermes assentar ou centrifugar a suspensão 10 s a x 800 g para remover o fluido. Nota: Um exemplo de uma densidade suficiente é dado em (macroscópicas) a figura 1A e 1B (microscópicos) no aumento de 20 X. Prosseguir empiricamente como descrito.</li>
		<li>Tenha em mente que os vermes assentar-se rapidamente. Para garantir uma repartição equitativa entre as placas, inverta o tubo após cada pilha de placas (placas de 4 – 5). Nota: O corte pipeta de ponta, bem como o balanço suave e lavagem das placas, reduz a tensão de cisalhamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. transferência de grandes quantidades de Caenorhabditis elegans
<ol><li>Lave os nematódeos com aproximadamente 500 µ l de tampão de M9, dependendo da idade e ressecamento das placas. Usando a mesma reserva, repita desanexando os nematódeos, até que a maioria dos animais é recolhida em suspensão.</li>
	<li>Lentamente, ocupam os nematódeos com uma ponta de pipeta corte e transferi-los em um prato preparado com OP50. Deixe a placa secar. Nota: Tenha cuidado para não aplicar muito mais do que o volume recomendado. Especialmente em experiências a longo prazo, as placas não podem tolerá-lo e o ágar-ágar pode quebrar, permitindo que os nematoides que rastejar nas rachaduras.</li>
</ol>3. a colheita de uma grande amostra de Caenorhabditis elegans
<ol><li>Dependendo do método selecionado, inicie experiências com uma quantidade suficiente de c. elegans. Para análises de LC-MS/MS, prepare 20 placas (60 x 15 mm) por grupo com aproximadamente 100 nematoides por placa para assegurar um rendimento de pelo menos 200 µ g de proteína por exemplo. Nota: Esta parte do protocolo não exige mais, trabalhando em condições estéreis como os nematoides serão coletados e congelados.</li>
	<li>No dia da coleta da amostra, prepare nitrogênio líquido para snap-congelar as amostras coletadas. Mantenha não estéreis M9 buffer no gelo para diminuir o metabolismo do nemátodo.</li>
	<li>Lave o c. elegans , as chapas, aplicando 1 mL de tampão de M9 e agitando suavemente as placas. Isso evita coletando falecidos nematoides e a maioria dos ovos, se houver qualquer presente, porque eles aparecem para as bactérias e o ágar-ágar.</li>
	<li>Ocupam o volume e transferi-lo para um tubo de 15 mL.</li>
	<li>Após a coleta da amostra completa, espere que os nematoides resolver ou centrifugar o tubo momentaneamente a 800 x g e remover a maioria do buffer M9. Lavar a amostra 3 x com cerca de 10 mL de M9 (10x o volume da amostra) para remover todas as bactérias. Nota: Para garantir que todos os nematoides falecidos são removidos, flutuação de sacarose é outra opção. No entanto, isso não era adequado para os experimentos exibido15. Sacarose é hidrolisado em glicose e frutose. Nas experiências de retratados, o papel da glicose foi avaliado para promover mudanças bioquímicas encontradas em diabetes crônica. Assim, a flutuação de sacarose potencialmente poderia confundir os resultados.</li>
	<li>Prepare um tubo de 1,5 mL com 1 mL de tampão de M9 e um tubo vazio de 1,5 mL para cada amostra. Transferi a pelota com uma pipeta de vidro do tubo de 15ml para o tubo vazio 1,5 mL. Esta etapa é essencial para garantir uma transferência quantitativa. Nota: Ao contrário durante as etapas anteriores, aqui os nematódeos são mais concentrados. Por causa de uma possível adesão ao pontas de pipeta plástica, perda de grande parte da amostra é esperada. Portanto, use pipetas de vidro em vez disso.</li>
	<li>Após a transferência, use a pipeta de vidro para pegar 1 mL de tampão de M9 do segundo tubo de 1,5 mL para enxaguar os nematódeos da parede da pipeta. Além disso, lave os nematódeos restantes do tubo de 15 mL e transferi-los para o tubo de amostra.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de amostra no 19.000 x g por 1 min e em seguida, remover o sobrenadante possível.</li>
	<li>Feche o tubo com Parafilm e imediatamente snap freeze-lo em nitrogênio líquido. Armazene o tubo a-80 ° C até a preparação de lisado.</li>
</ol>4. proteína isolamento por espectrometria de massa
Nota: O isolamento da proteína aqui descrito também pode ser usado para outros ensaios (por exemplo, borrão ocidental).
<ol><li>Para a amostra congelada, adicione os mesmos volumes de grânulos de óxido de zircônio de 0.5 mm e pelo menos 2x o volume de lisado tampão contendo um coquetel de inibidor de protease. Nota: As análises de correlação de nematoides-para-proteína retratados foram realizadas usando 100 µ l de tampão. Amostras de LC-MS/MS foram lysed com 200 µ l de tampão.</li>
	<li>Inicie o homogeneizador por 1 min na velocidade 9. Certifique-se de que as amostras completamente lysed. Repita essa etapa se eles não lysed totalmente.</li>
	<li>Centrifugar as amostras por 30 min a 4 ° C no 19.000 x g. Transferir o sobrenadante para um tubo novo no gelo e armazená-lo a-80 ° C até mais medidas vão ser tomadas. Nota: O buffer não-desnaturação usado para experimentos retratados consiste das seguintes substâncias: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl 1% Triton-X e 2 mM de EDTA. Nota: Tendo seguido os passos do presente protocolo e tendo aplicado a escala sugerida, o rendimento de uma pelota de proteína de aproximadamente 1.000 nematoides deve ser de aproximadamente 500 µ g. Para mais comparações, consulte a Figura 2 e os Resultados de representante.</li>
</ol>5. amostra preparação para medições de espectrometria de massa em tandem-cromatografia líquida
Nota: Dependendo do parâmetro de interesse, a preparação da amostra será diferente. Este protocolo incide sobre metilglioxal e determinação de idade.
<ol><li>
Medir o metilglioxal intracelular por derivatização com 1,2-diaminobenzene (DB) como descrito anteriormente,9.
	<ol>
<li>Homogeneizar as amostras com 20 µ l de gelado ácido tricloroacético de 20% (wt/vol) em cloreto de sódio 0,9% (wt/vol) e 80 µ l de água em um tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Spike as amostras de 5 µ l com padrão interno (13C3-MG; 400 nM), misturá-los pela utilização do Vortex e centrifugá-los a 21.000 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Transferi 35 µ l do sobrenadante para o frasco de amostra HPLC contendo uma pastilha de vidro de 200 µ l.</li>
		<li>Adicione 5 µ l de 3% de azida sódica (wt/vol) para cada amostra, seguida de 10 µ l de 0,5 mM DB em 200mm HCl contendo 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic ácido (DETAPAC) em água.</li>
		<li>Incube as amostras para 4 h à temperatura ambiente, protegida da luz.</li>
		<li>Analise as amostras por LC-MS/MS, como descrito anteriormente,9. Nota: Para a medição de idades, isole as proteínas conforme descrito na seção 4 do protocolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medir a concentração de proteína dos lysates (descongeladas) usando um ensaio de Bradford10.
	<ol>
<li>Preparar alíquotas de 30 µ l para uma curva padrão cravada com albumina de soro bovino (BSA) resolvida em tampão fosfato salino (PBS) da seguinte concentração: 0; 0.1; 0,2; 0.3; 0,4; 0,6; 0,8; e 1,0 mg/dL. Nota: Se a amostra foi preparada para o tamanho sugerido (consulte a etapa 4.1 para a preparação de lisado com 200 µ l de tampão), a concentração estimada deve ser no intervalo de aproximadamente 2-7 mg/mL. Neste caso, dilua as amostras 01:10 com PBS antes da medição. Nota: Para os primeiros experimentos usando este método, recomenda-se medir as amostras em diferentes diluições (1, 01:10 e 1: 100). Como não há nenhuma determinação exata do número de nematoides, o rendimento pode diferir entre investigadores individuais.</li>
		<li>Usar uma placa de 96 poços transparente (poliestireno) e pipetar 10 µ l de cada concentração de padrão e das amostras nas diluições escolhidas em duplicatas em poços.</li>
		<li>Diluir a proteína ensaio corante reagente concentrado 1:5 com água destilada (aq. dest.) e adicionar 200 µ l da diluição para cada amostra na placa. Incube a placa por 10 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Medir a absorvância dentro de 30 min em 595 nm com um leitor de placa. As amostras podem ser interpoladas a partir da curva padrão calculada. Mais detalhes do método foram descritas extensivamente na literatura10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medir as idades intracelulares, como descrito anteriormente,11,12.
	<ol>
<li>Lave os extratos de proteínas totais (aproximadamente 200 µ g) 3x com água por ultracentrifugação em 10 unidades de filtro centrífugo kDa.</li>
		<li>Adicionar 10 µ l de HCl a 100 mM, 10 µ l de pepsina (2 mg/mL em 20 mM HCl) e 10 µ l de timol (2 mg/mL em 20 mM HCl) à proteína recuperada (cerca de 100 µ l) e incubar as amostras a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Neutralizar e as amostras do buffer em pH 7,4, adicionando 12,5 µ l de tampão de fosfato de potássio 0,5 M (pH 7,4) e 5 µ l de KOH de 260 mM.</li>
		<li>Adicionar 10 µ l de Pronase E [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e 10 µ l de uma solução de penicilina-estreptomicina e incubar as amostras a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Adicionar 10 µ l de aminopeptidase [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e 10 µ l de prolidase [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e incubar as amostras a 37 ° C por 48 h.</li>
		<li>Analise o hidrolisado resultante por LC-MS/MS, como descrito anteriormente,12.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo apresenta uma abordagem confiável para o cultivo em grande escala de c. elegans , obter resultados quantitativos. Achados da literatura poderiam ser replicados como mostrado nos Resultados de representante. Mesmo que este protocolo para a recolha de amostras em grande escala de c. elegans parece ser um método direto, há certas armadilhas para ter em conta. Sobre a sincronização da população de nematoides, este protocolo descreve uma abordagem por branqueamento da populaçã...

Análise de proteína, como um borrão ocidental ou espectrometria de massa, exige mg de proteína. Este rendimento requer um cultivo em grande escala de centenas de c. elegans, que pode ser feito por cultura líquida ou em meios sólidos, transferir os nematódeos por lavagem. Fluido e tensão de cisalhamento induz a expressão dos canais de sódio epitelial (ENaC), que poderia aumentar o estresse osmótico através de um aumento da absorção de sódio, potencialmente alterando o tempo de vida de c. elegans e afetando análises metabólicas1 . Portanto, algumas etapas críticas neste protocolo para a abordagem baseada em placa leva a redução de estresse que afetam a variabilidade experimental em conta. Cultura líquida, por outro lado, influencia o fenótipo dos nematódeos e complica a cultura e a coleção de um número exato de nematoides2. Além disso, substâncias reativas podem ser alteradas pelos componentes de mídia e podem distribuir irregularmente antes de atingir os nematoides. Sobre as limitações da cultura líquida, este protocolo fornece uma abordagem alternativa para cultivo em grande escala amostras de c. elegans.
C. elegans é um organismo modelo com uma rede distinta de 302 células neuronais, inventando um terço de todas as suas células3. Desde a sua introdução em ciência, muitos homólogas e genes ortólogos têm sido descritos, ampliando seu valor como um modelo para pesquisa médica. Recentemente, evidências de comprometimento neurológico em retinopatia diabética, precedendo a lesão vascular, foi apresentada4. C. elegans é desprovido de vasos sanguíneos, mas contém uma rede neuronal distinta, tornando-se um modelo adequado para investigar alterações neuronais além aqueles vasculares. Assim, o c. elegans é de especial interesse para o estudo de mecanismos gerais de complicações do diabético. As alterações bioquímicas em complicações do diabético envolvem a formação de idades, que mais influenciam a formação de ROS em resposta à hiperglicemia5. As idades encontram-se em c. elegans e contribuam para o dano neuronal6. Doenças crônicas são frequentemente causadas por processos complexos, poligênicos, exigindo uma abordagem Multiparamétrico para a avaliação de seus mecanismos subjacentes, como exemplificado aqui com a avaliação de complicações do diabético. Este protocolo pode ser útil para a obtenção de vários parâmetros simultaneamente, bem como posteriormente. Maior comparabilidade e reprodutibilidade de uma abordagem Multiparamétrico podem ser alcançados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

<table><tbody><tr><td>E. coli OP50</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans N2</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans CL2166</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri, 60 mm x 15 mm</td><td>Greiner One</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta volumétrica, vidros, 10 mL</td><td>Neolab</td><td>E-0413</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase comprimidos de coquetel inibidor</td><td>Roche</td><td>04693124001</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lisado não desnaturante: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 8</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td> <td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td> <td>Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços, fundo transparente</td><td>Marca</td><td>781611</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200, leitor de placas</td><td>Tecan</td><td>30017581</td><td></td></tr><tr><td>Zirconium Oxide Beads, 0,5 mm</td><td>Next advance</td><td>ZROB05-RNA</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender, homogeneizador</td><td>Next advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina da mucosa gástrica suína</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Timol</td><td>Sigma</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>Pronase E / Protease de Streptomyces griseus </td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P43339</td><td></td></tr><tr><td>Prolidase de rim suíno</td><td>Sigma</td><td>P6675</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptidase de Aeromonas proteolytica</td><td>Sigma</td><td>A8200</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-0.5</td><td>Merckmillipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Basic Os materiais para cultura de placas são descritos na Referência 6.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

baseados na placa de cultivo em grande escala de caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Cultivo Caenorhabditis elegans (c. elegans) de uma forma em grande escala em placas de ágar-ágar pode ser demorado e difícil. Este protocolo descreve um método simples e de baixo custo para obter um grande número de animais para o isolamento de proteínas para prosseguir com um western blot, espectrometria de massa ou novas análises proteômica. Além disso, um aumento de números de nematoides para immunostainings e a integração de múltiplas análises sob as mesmas condições de cultivo podem facilmente ser alcançados. Além disso, uma transferência entre placas com diferentes condições experimentais é facilitada. Técnicas comuns na cultura de placa envolvem a transferência de um único c. elegans , usando um fio de platina e a transferência de ágar povoada pedaços usando um bisturi. No entanto, com o aumento do número de nematoides, essas técnicas se tornar excessivamente demoradas. Este protocolo descreve a cultura em grande escala de c. elegans incluindo numerosas medidas para minimizar o impacto da preparação amostra sobre a fisiologia do worm. Fluido e tensão de cisalhamento podem alterar o tempo de vida de e processos metabólicos em c. elegans, exigindo assim uma descrição detalhada das etapas críticas para recuperar resultados confiáveis e reprodutíveis. C. elegans é um organismo modelo, constituído por células neuronais para até um terço, mas falta os vasos sanguíneos, proporcionando assim a possibilidade de investigar unicamente neuronais alterações independentes de controle vascular. Recentemente, descobriu-se cedo neurodegeneração retinopatia diabética antes alterações vasculares. Assim, o c. elegans é de especial interesse para o estudo de mecanismos gerais de complicações do diabético. Por exemplo, uma maior formação de avançados de glicação produtos finais (idades) e espécies reativas de oxigênio (ROS) é observada, que se encontram reproducibly em c. elegans. Protocolos para lidar com amostras de tamanho adequado para um amplo espectro de investigações são aqui apresentados, exemplificado pelo estudo da diabetes induzido por alterações bioquímicas. Em geral, este protocolo pode ser útil para estudos que exigem grande c. elegans números e em qual cultura líquida não é adequada.

Aqui exemplos de criação de uma grande escala de c. elegans cultura para aplicações em pesquisa do diabetes são apresentadas. Pode ser de interesse para relacionar os parâmetros de um único animal, ao invés de normalizar isso à concentração de proteínas totais. Em um ensaio que exige um pequeno número de nematoides, isso pode ser facilmente realizado pela contagem dos nemátodes. Para uma grande escala de c. elegans cultura envolvendo centenas de nematoides por grupo expe...

Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

No campo de C. elegans, este método pode ajudar a responder a questões-chave que requerem a produção de grandes populações de nematóides e amostras usando cultura de placas. As principais vantagens deste protocolo são seu fácil estabelecimento e sua facilidade de descrição, incluindo armadilhas e aplicações. Depois de obter uma população sincronizada de nematóides, adicione aproximadamente um mililitro de tampão M nove às placas e distribua cuidadosamente o tampão balançando as placas.Depois disso, colete os nematóides em um tubo de 15 mililitros. Agora, inverta o tubo e use um microscópio para avaliar a densidade dos nematóides. Ajustar a densidade da suspensão conforme necessário e continuar a avaliá-la ao microscópio.Aplique 150 microlitros da suspensão diretamente nas placas com pontas de pipeta modificadas. Para garantir uma distribuição igual de nematóides entre as placas, inverter o tubo de suspensão em intervalos regulares. Primeiro, lave os nematóides usando uma ponta de pipeta modificada com aproximadamente 500 microlitros de tampão M nove.Usando o mesmo tampão, continue destacando os nematóides até que a maioria dos animais seja coletada em suspensão. Em seguida, pegue os nematóides com uma ponta de pipeta modificada e transfira-os para uma placa com OP50. As pontas da pipeta modificadas diminuem a tensão de cisalhamento e os danos aos nematóides devido a um diâmetro maior.Em seguida, deixe o prato secar. Antes de coletar amostras, prepare nitrogênio líquido para congelar os nematóides coletados. Em seguida, coloque o tampão M nove no gelo.Aplique um mililitro de tampão M nove em cada prato e gire suavemente para lavar cada prato. Em seguida, pegue o volume do tampão M nove e transfira-o para novos tubos de 15 mililitros. Centrifugar brevemente o tubo a 800 vezes g, antes de retirar a maior parte do tampão M nove.Em seguida, lave as amostras três vezes com 10 mililitros de tampão M nove para remover qualquer bactéria. Usando uma pipeta de vidro, transfira cada pellet para um tubo vazio de 1,5 mililitro. Use a pipeta de vidro para retirar um mililitro de tampão M nove do segundo tubo de 1,5 mililitro, para enxaguar os nematóides da parede da pipeta.Em seguida, lave os nematóides restantes dos tubos de 15 mililitros e transfira-os para os tubos de amostra. Em seguida, centrifugar os tubos de amostra a 19 000 vezes g durante um minuto e remover o máximo possível de sobrenadante. Em seguida, sele cada tubo com filme de parafina e congele-os em nitrogênio líquido imediatamente.Armazene os tubos a menos 80 graus Celsius até a preparação do lisado. Adicione os mesmos volumes de esferas de óxido de zircônio de 0,5 milímetro e o dobro do volume de tampão lisado com coquetel inibidor de proteinase a cada amostra congelada. Em seguida, coloque os tubos em um homogeneizador por um minuto na velocidade nove.Centrifugue as amostras por 30 minutos a quatro graus Celsius e 19.000 vezes g. Finalmente, transfira o sobrenadante para um novo tubo no gelo e armazene-o a 80 graus Celsius negativos para experimentos futuros. Neste protocolo, grandes quantidades de C. elegans foram cultivadas para aplicações em pesquisas em diabetes.O número de nematóides coletados correlacionou-se com o rendimento proteico do lisado, demonstrando que o isolamento proteico quantitativo reprodutível pode ser alcançado usando este protocolo. Análises espectrométricas de massa do metabólito reativo metilglioxal e produtos finais de glicação avançada formados pela exposição ao metilglioxal são mostradas aqui. Nematóides tratados com glicose e controles foram comparados.A transferência de nematóides via pipeta pode criar tensão de cisalhamento, potencialmente prejudicando os nematóides. Os níveis de estresse oxidativo em nematóides pipetados e nematóides transferidos com fio metálico não diferiram usando este protocolo. Seguindo este procedimento, outros métodos como western blot podem ser realizados, a fim de responder a perguntas adicionais em proteômica.Este protocolo também facilita experimentos que relacionam vários parâmetros à mesma população.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós descrevemos métodos para estudar aspectos da amylopathies do...

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Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

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