Name: Uma abordagem In Vitro para terapia fotodinâmica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Aprenda uma abordagem in vitro para terapia fotodinâmica focada em apoptose celular. Este método utiliza 5-ALA e irradiação com luz azul para desenvolver protocolos terapêuticos inovadores contra câncer de pele.

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Os autores têm sem agradecimentos.

1. preparação das células
<ol><li>Células de placa 20.000 em 2 mL de meio de cultura em cada poço de uma placa de 6 utilizando uma técnica estéril em uma armário de biossegurança.</li>
	<li>Coloque placas 6-poços em uma incubadora umidificada (37 ° C, 5% CO2) para 24 h permitir que as células para aderir às placas.</li>
</ol>2. preparação do fotossensibilizador para tratamento de células
<ol><li>Prepare soluções de 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA em meio de cultura. Se o soro fetal bovino (FBS) é um ingrediente do meio de cultura, preparar e tratar as células com 5-ALA na solução de meio de cultura com 0,1% FBS para incubação do. 11 , 12 neste caso, as células de SCC-13 não exigem FBS, então 5-ALA foi adicionado diretamente ao queratinócito soro livre médio, suplementado com extrato de pituitária bovina e fator de crescimento epidérmico.</li>
	<li>Aspire o meio de cultura e lavar as células pelo menos 2 mL de soro de tampão fosfato (PBS).</li>
	<li>Aspire PBS e adicionar 2 mL de soluções de 5-ALA 0, 0,5, 1 ou 2 mM em chapas separadas ou poços.</li>
	<li>Incube as celulas com 0, 0,5, 1 ou 2 mM 5-ALA em um 36 a 37 ° C, bloco de 30 min. de aquecimento protegem as células da exposição à luz durante a incubação, usando papel alumínio.</li>
	<li>As soluções de 5-ALA 0, 0,5, 1 e 2 mM, Aspire e lavar as células com 2 mL de PBS.</li>
	<li>Aspire PBS e adicionar 2 mL de meio de cultura para a irradiação de luz azul.</li>
</ol>3. azul fototerapia Light
<ol><li>Antes de irradiar as células, ligue o aparelho de luz azul (por exemplo, diodo emissor de luz, lâmpadas fluorescentes ou luz halógena) e correr para um ciclo (1.000 s) para aquecer o dispositivo. O dispositivo de luz azul deve ter um comprimento de onda de saída de 417 + /-5 nm. Permitindo que o dispositivo executar um ciclo antes dos tratamentos garante que o comprimento de onda de luz azul e irradiância consistentes em toda a fase de fotoativação.</li>
	<li>Use um fotômetro para medir irradiância na superfície da célula. A irradiação de luz azul na superfície da célula deve ser de 10 mW/cm2. A distância entre a luz e as células pode precisar ser ajustada para atingir uma irradiância de 10 mW/cm2 , dependendo da intensidade da fonte luminosa.</li>
	<li>Coloque grupos de tratamento de ALA 0, 0,5, 1 e 2 mM sobre uma superfície preta sob a fonte de luz azul. Irradiar as células com luz azul para 1.000 s (16 min e 40 s) para uma total fluência de 10 J/cm2. Após a fotoativação de luz azul, as células estão prontas para análise.</li>
</ol>4. coleta e coloração
<ol><li>Prepare o buffer de fluxo de acordo com as orientações do fabricante (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Aspire o meio de cultura e as células de lavagem com 2 mL de PBS.</li>
	<li>Adicione 1 mL de 0,25% do trypsin-EDTA e permitir que as células desanexar por aproximadamente 3 a 5 min. As células podem ser examinadas ao microscópio para confirmar o desprendimento de células.</li>
	<li>Adicione 1 mL de meio de cultura (ou PBS) com 10% de soro bovino fetal para desactivar a tripsina.</li>
	<li>Colete suspensão de células em tubos de fluxo 5ml rotulada.</li>
	<li>Gire o tubo de fluxo de 5 mL em uma centrífuga a 201 x g por 5 min. aspirado de solução sem remover centrifugado.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de buffer de fluxo com conjugado anticorpo anexina-V (1 µ l de anexina-v por 39 µ l de buffer de fluxo) para cada amostra.</li>
	<li>Ressuspender as células e colocar na incubadora (37 ° C, 5% CO2) por 20 min permitir a ligação de anexina-V.</li>
	<li>Adicione 3 µ l de 7-AAD para cada amostra. Incube durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
</ol>5. fluxo Cytometric Analysis
<ol><li>Siga as orientações de fabricante de citômetro de fluxo para set-up (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Coletar e analisar amostras com citometria de fluxo. 13
</li>
	<li>Realize comparação estatística entre grupos tratamento e controle usando a análise de variância (ANOVA)14. Compare os meios dos grupos de tratamento para a média do controle com o teste de Dunnett, uma análise post hoc .</li>
</ol>

<ol><li>Morton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Dermatology+Forum+guidelines+on+topical+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy.</a> European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).</li>
<li>Ozog, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%3A+A+clinical+consensus+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy: A clinical consensus guide.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).</li>
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<li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+and+the+development+of+metal-based+photosensitisers%5BTitle%5D)+AND+%22Metal-Based+Drugs%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers.</a> Metal-Based Drugs. 2008, 276109(2008).</li>
<li>Ohgari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+involved+in+%CE%B4-aminolevulinic+acid+%28ALA%29-induced+photosensitivity+of+tumor+cells%3A+Relation+of+ferrochelatase+and+uptake+of+ALA+to+the+accumulation+of+protoporphyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms involved in δ-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin.</a> Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).</li>
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<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+ultra+short+photodynamic+therapy%3A+heating+fibroblasts+during+sub-30-minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+increases+photodynamic+therapy-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).</li>
<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+ultra+short+sub-30+minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).</li>
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<li>Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+impact+of+thermal+aminolaevulinic+acid+photodynamic+therapy+on+apoptosis+and+reactive+oxygen+species+generation+in+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts.</a> British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).</li>
<li>Gilaberte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+intrinsic+factors+involved+in+the+resistance+of+squamous+cell+carcinoma+to+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).</li>
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<li>Chen, Y. -C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cancer+cell+sphere+formation+for+characterizing+the+efficacy+of+photo+dynamic+therapy+in+3D+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures.</a> Scientific Reports. 5, 12175(2015).</li>
<li>Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/10476/104760S/Low-dose-PDT-on-breast-cancer-spheroids/10.1117/12.2290915.short?SSO=1">Low-dose PDT on breast cancer spheroids.</a> Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature+on+5-aminolevulinic+acid-based+photodynamic+reaction+in+keratinocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photodermatology%2C+Photoimmunology+%26+Photomedicine%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro.</a> Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).</li>
<li>Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+Accumulation+of+protoporphyrin+IX+after+topical+application+of+5-aminolevulinic+acid+and+its+methylester+and+hexylester+derivatives+in+normal+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).</li>
<li>Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+different+illumination+parameters+on+protoporphyrin+IX+induced+cell+death+in+squamous+cell+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).</li>
</ol>

DUSA/Sun farmacêutica desde 5-ALA e o dispositivo de luz BLU-U. Este manuscrito foi apoiado pelo residual do Dr. Jagdeo financiamento. O conteúdo não representam a opinião do departamento dos EUA de assuntos de veteranos ou o governo dos Estados Unidos.

Houve um aumento significativo na apoptose SCC-13 após incubação do 30 min de 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA seguido por 1.000 s da luz azul. Estes resultados são consistentes com nossa pesquisa publicada anteriormente, demonstrando que a incubação do 5-ALA de 30 min, seguido por ativação de luz azul leva a um aumento da percentagem de células de fibroblastos submetidos à apoptose12, dose-dependente 14.
Esta abordagem experimental para estudar PDT tem vantagens e limitações. Os métodos descritos em conformidade com a prática clínica como um PS comercialmente disponível e fonte de luz foram usados. Pesquisadores podem personalizar os métodos com diferentes tipos de células, PSs, fontes de luz e parâmetros de irradiação. No entanto, existem limitações dessa abordagem como este protocolo é projetado para células aderentes cultivadas em uma monocamada. Na prática clínica, as diferenças na patologia tecido arquitetura ou doença (ou seja, hiperqueratose ou fibrose) podem diminuir a absorção de PS ou penetração15de luz. Como resultado, as doses de tratamento e conclusões experimentais podem não corresponder diretamente à prática clínica. Modelos de tumor esferoide e microfluidic chip têm sido estudados como métodos para replicar mais estreitamente tumor microambiente16,17,18. Esferoides têm nichos celulares internos e externas que podem incorporar os fotossensibilizadores diferencialmente e representam a arquitetura do tumor heterogêneo. Outros pesquisadores usaram microfluidic chips para condições de tratamento de tela e entrega vascular de fotossensibilizadores. No entanto, microfluidic fichas podem ser caro para desenvolver ou difíceis de implementar para os investigadores não estão familiarizados com a técnica. Além disso, esferoides e microfluidic chips podem não refletir o tratamento clínico de cancros da pele em que fotossensibilizadores são aplicados diretamente para a superfície do tumor sem disseminação vascular. Pesquisadores podem ser necessário avaliar os prós e contras de cultura monocamada e modelos de tumor esferoide microfluidic fichas para estudar PDT em sistemas diferentes de doença. Como não existem células imunes ou matriz extracelular, não é possível determinar como PDT afeta as interações célula-célula complexas. Pesquisadores podem precisar confirmar em vitro resultados experimentais usando modelos animais e ensaios clínicos. Para alcançar alta validade inter teste, é importante manter a incubação consistente e luz parâmetros ao realizar experimentos em vitro PDT.
Temperatura é conhecida por alterar a eficácia do PDT19. Um estudo demonstrou que a morte celular, absorção de 5-ALA, PP-IX formação e liberação de citocinas podem ser melhoradas incubando-se células com 5-ALA em temperaturas acima de 44 ° C19. Temperaturas de incubação acima de 44 ° C podem levar à morte celular induzida térmica e temperaturas de incubação abaixo de 20 ° C não podem levar à absorção de 5-ALA significativa e acumulação19. Recomendamos que os investigadores realizar incubação do PS em um bloco de aquecimento temperatura ajustável a uma temperatura constante de Controlarar para confundir potencialmente efeitos térmicos. Além disso, é importante Incubar o fotossensibilizador para uma quantidade suficiente de tempo para permitir a conversão de 5-ALA em PP-IX. Neste protocolo, SCC-13 células foram incubadas com 5-ALA por 30 min, que com sucesso induziu a apoptose celular. Demonstramos anteriormente que uma incubação de 10 min de 5-ALA não aumentou significativamente apoptose em fibroblasto em relação ao controle não tratados fibroblastos11,14. PP-IX começa a acumular-se na pele de rato depois de 5-ALA está incubando durante seis minutos a 37 ° C. Portanto, após dez minutos de incubação de 5-ALA, pode não haver suficiente acumulação de PP-IX para induzir a apoptose de células20. Recomendamos um período de incubação mínimo de 20 a 30 min para 5-ALA baseado em nossos anteriores estudos11,14. Pesquisadores podem ser necessário otimizar o período de incubação, com base no laboratório de configuração, fotossensibilizador de interesse, tipo de célula e indicação clínica. Experimentos de otimização e titulação de anticorpos podem ser realizados para obter melhores resultados usando as orientações de fabricantes. Outros ensaios de interesse podem ser realizados seguindo o photoactivation luz azul, incluindo dihydroethidium quantificação fluxo cytometric ROS. 14
Variação na quantidade de luz entregues por unidade de superfície (ou seja, irradiância) e dose de irradiação total (ou seja, fluência) durante a fase de fotoativação pode afetar a formação de ROS e de apoptose celular21. A relação entre tempo, irradiância e fluência pode ser descrita pela seguinte equação:
Fluência (J/cm2) = irradiância (W/cm2) x tempo (s)
Como fluência é dependente do tempo, aumentando ou reduzindo as photoactivation fases pode mudar eficácia do tratamento. A irradiância é proporcional à distância ao quadrado entre a fonte luminosa e o tecido-alvo. Como resultado, se a luz for muito longe, pode não haver energia suficiente luz, entregada para o tecido-alvo para excitar o PS. Alternativamente, a irradiação pode ser aumentada pela luz refletindo as superfícies circundantes. Portanto, recomendamos realizar irradiações de luz com as placas de cultura de células colocadas sobre uma superfície preta para evitar a reflexão da luz. Pesquisadores podem adquirir comercialmente disponíveis ou aprovado pela FDA azuis diodos emissores de luz e dispositivos fluorescentes para uso nas experiências do PDT, mas estes dispositivos podem ter diferentes potências e uniformidade de campo claro. Um fotômetro de comprimento de onda específico deve ser usado para medir a radiação na superfície da célula e uniformidade do campo de luz antes de cada experimento para resultados consistentes. Um difusor comercialmente disponível pode ser usado para melhorar a uniformidade do campo, se necessário.
Em resumo, descrevemos uma abordagem in vitro para investigar PDT por detalhando a teoria, métodos experimentais, limitações, possíveis armadilhas e recomendações para a otimização. PDT é que uma investigação clínica útil em procedimento e in vitro pode permitir o desenvolvimento do romance PSs, otimização de protocolos e novas indicações para o PDT.

A terapia fotodinâmica (PDT) é um procedimento médico que envolve a incubação de um fotossensibilizador exogenamente aplicada (PS), seguida de fotoativação de luz visível para induzir apoptose celular. O Federal Drug Administration (FDA) aprovou o PDT para o tratamento de ceratose actínica (AK) e diretrizes clínicas recomendam o PDT como um tratamento para certos tipos de câncer de pele não-melanoma e acne vulgaris1,2. Usos não-dermatológico emergentes para PDT incluem o tratamento de cânceres ginecológicos, gastrointestinais e próstata3. PDT é uma modalidade terapêutica vantajosa como é associado com efeitos adversos mínimos e cicatrizes2, baixo custo e não-invasiva.
Na primeira etapa do PDT, um PS é aplicado e permitido acumular intracelular2. Nos Estados Unidos, ácido 5-aminolevulínico tópica (5-ALA) é comumente usado para tratar a AKs. Durante a incubação, fase, 5-ALA é convertido em protoporfirina IX (PP-IX), através da via de biossíntese do hemo em células incorporado3. Células de câncer e pré-câncer diminuíram a atividade ferroquelatase, que converte a protoporfirina IX (PP-IX), o produto final, hemo. Como resultado, as células do câncer se acumulam PP-IX em comparação com células normais4,5. Esta acumulação de PP-IX em câncer e pré-câncer células em relação ao tecido circundante permite PDT ser uma abordagem orientada com mínimos efeitos adversos. Irradiação de luz leva à geração de (ROS) de espécies reativas de oxigênio quando o oxigênio aceita elétrons excitados do PP-IX. PP-IX tem uma absorção de pico no espectro ultravioleta com picos menores em todo o espectro visível da luz, incluindo luz azul e vermelha2. Formação de ROS em última análise, pode levar a apoptose celular, ruptura de membrana, dano mitocondrial, imunomodulação, proliferação de queratinócitos e colágeno volume6,7,8,9 , 10.
PDT foi desenvolvido na década de 1970 e é uma evolução da modalidade terapêutica3. O protocolo aprovado pelo FDA para o tratamento de AKs recomenda incubação de 5-ALA pele de 14 – 18 h, mas incubação do 1 a 2 h é comumente usadas na prática clínica2. In vitro e mostramos que mais curta incubação do 5-ALA de 15 min pode aumentar apoptose celular de fibroblasto comparado com fibroblastos não tratados11,12. Além disso, romance chlorin, ftalocianina e PSs baseados em nanopartículas estão sendo estudados para melhorar a eficácia de PDT3. Neste documento, apresentamos um método em vitro para estudo PDT em um carcinoma de células escamosas aderente as células. Neste protocolo, SCC-13 células são incubadas com 0, 0,5, 1,0 e 2 mM 5-ALA por 30 min e fotoativados com 417 luz azul nm para 1.000 s. A medida de resultado primário é a apoptose e necrose, como medido por citometria de fluxo-anexina V e 7-aminoactinomycin D (7-AAD). Este protocolo de tratamento é projetado para simular o PDT e pode ser ajustado para estudar o uso do PDT com outras linhas celulares, fotossensibilizadores, temperaturas de incubação ou photoactivation comprimentos de onda. Preparação de grupos de controle adicionais pode ser necessária, incluindo o fluoróforo imaculado, único manchado, controles negativos e positivos por citometria de fluxo. Uma revisão abrangente da teoria, protocolos, delineamento experimental e gating para apoptose/necrose citometria de fluxo pode ser encontrada em outro lugar13.

<table><tbody><tr><td>Soro de queratinócitos meio livre</td><td>Thermofisher</td><td>17005042</td><td>Meio de cultura para células SSC-13</td></tr><tr><td>DMEM glutamax de baixa glicose</td><td>Thermofisher</td><td>10567022</td><td>Possível meio de cultura para outros tipos de células</td></tr><tr><td>Placas de cultura de 6 poços</td><td>Thermofisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Solução Azul, 0,4%</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td>Para contagem de células e galvanização&nbsp;</td></tr><tr><td>Luz BLU-U&nbsp;</td><td>Pedido</td><td>DUSA do fabricante</td><td>Outras luzes LED azuis, fluorescentes ou halógenas podem ser usadas&nbsp;</td></tr><tr><td>5-ALA</td><td>DUSA</td><td>Pedido do fabricante</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>C17032</td><td></td></tr><tr><td>FlowCellect Annexin Red Kit</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>FCCH100108&nbsp;</td><td>O iodeto de propídio pode substituir o 7-AAD. Vem com anexina-V, 7-AAD, e buffer de fluxo</td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD</td><td>Pedido do fabricante</td><td>Qualquer citômetro de fluxo pode ser usado&nbsp;</td></tr><tr><td>Câmara de Contagem</td><td>Hausser</td><td>3120</td><td>Para contagem de células e galvanização&nbsp;</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td></td><td>FlowJo Solicitação do fabricante Software de análise de</td><td>citometria de fluxo</td></tr></tbody></table>

uma abordagem in vitro para terapia fotodinâmica

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

A terapia fotodinâmica (PDT) é um procedimento médico que envolve a incubação de um fotossensibilizador exogenamente aplicada (PS), seguida de fotoativação de luz visível para induzir apoptose celular. O Federal Drug Administration aprovou o PDT para o tratamento de ceratose actínica e diretrizes clínicas recomendam o PDT como um tratamento para certos tipos de câncer de pele não-melanoma e acne vulgar. PDT é uma modalidade terapêutica vantajosa como é de baixo custo, não invasivo e associado com efeitos adversos mínimos e assustando. Na primeira etapa do PDT, um PS é aplicado e permitido acumular intracelular. Irradiação de luz subsequente induz a formação de espécies reativas de oxigênio, que em última análise, pode levar à apoptose celular, ruptura de membrana, dano mitocondrial, imunomodulação, proliferação de queratinócitos e volume de negócios de colágeno. Neste documento, apresentamos um método em vitro para estudo PDT em uma linhagem de células aderentes. Este protocolo de tratamento é projetado para simular o PDT e pode ser ajustado para estudar o uso do PDT com várias linhas celulares, fotossensibilizadores, temperaturas de incubação ou photoactivation comprimentos de onda. Células de carcinoma de células escamosas foram incubadas com 0, 0,5, 1,0 e 2 mM de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) por 30 min e fotoativados com 417 luz azul nm para 1.000 s. A medida de desfecho primário foi apoptose e necrose, como medido por citometria de fluxo D-anexina V e 7-aminoactinomycin. Houve um aumento dose-dependente na apoptose celular, após trinta minutos incubação de 5-ala Para alcançar alta validade inter teste, é importante manter a incubação consistente e luz parâmetros ao realizar experimentos em vitro PDT. PDT é que uma investigação clínica útil em procedimento e in vitro pode permitir o desenvolvimento do romance PSs, otimização de protocolos e novas indicações para o PDT.

Depois de SCC-13 células foram incubadas por 30 min com 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA e irradiadas com 1.000 s de azul claro, houve um aumento dose-dependente em apoptose celular. Apoptose total (média ± erro padrão da média) foi de 3,94 ± 0,34, 7,90 ± 0,52, 23,86 ± 0,52 e 38.33 ± 1,81 após 30 min de incubação com 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA, respectivamente e 1000 segundos de azul leves (Figura 1). Comparamos a porcentagem média da célula apoptótica entre 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA grupos incubados usando ANOVA. As células tratadas com 1 e 2 mM 5-ALA tinham um aumento significativo na apoptose celular, comparado a 0 mM 5-ALA células tratadas. Figura 2A mostra representativo fluxo cytometric gating de dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC) para SCC-13 células incubadas com 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-Alabama O círculo de gating inclui população celular SCC-13. Para este experimento, 7500 eventos foram coletados e o portão de população SCC-13 célula capturada pelo menos 90% dos eventos. Figura 2B mostra uma parcela representativa do 7-AAD no eixo x e anexina-V no eixo y. As populações de célula são bloqueadas em quatro quadrantes (Q1 a Q4) para discriminar células apoptóticas. Q1 (alta anexina-v, baixa 7-AAD) representa as células em fase precoce apoptose. Q2 (alta anexina-v de alta 7-AAD) representam as células em fase final apoptose ou necrose. Q3 (baixa anexina-v de alta 7-AAD) representa as células em fase de necrose. Representa a Q4 (baixa anexina-v, baixa 7-AAD) células não submetidos à apoptose ou necrose. Para calcular a porcentagem de células em apoptose, adicionamos a percentagem de células no Q1 e Q2. Inconsistência na duração do período de incubação de 5-ALA, temperatura de incubação ou dose de irradiação photoactivation pode alterar a eficácia do PDT. A Figura 3 demonstra um representante anexina-V e 7-AAD trama fluxo cytometric quando a temperatura de incubação é variada (i.e., 27, 36 ou 42 ° C). Houve um aumento de temperatura dependente na apoptose.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig1.jpg"> Figura 1: aumento Dose-dependente na apoptose após trinta minutos de incubação de 5-ala 5-ALA incubadas a 36 ° C durante trinta minutos, seguidos de 1.000 s de luz azul nas células SCC-13. Barras representam a médias positivas anexina-V células por cento em cada tratamento e grupo controle. Foram realizados experimentos em triplicado técnico. Significância estatística foi determinada por ANOVA, com p &lt; 0.05 indicado por um asterisco (*). Barras de erro representam média ± erro padrão da média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig2.jpg"> Figura 2: representante fluxo Cytometry plota. (A) representativo frente vs lado dispersão cytometry dispersão em unidades arbitrárias (AU) para x - e eixo y para 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA células incubadas. Para este experimento, 7500 eventos foram coletados e o portão de população celular SCC-13 capturado 90% dos eventos. (B) de citometria de fluxo representativo anexina-V vs. 7-AAD terrenos em AU para x - e eixo y para 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA células incubadas. Q1: início apoptotic células, Q2: tarde células apoptóticas/necrótico, Q3: células necróticas e Q4: células viáveis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig3.jpg"> Figura 3: incubação de 5-ALA em temperaturas diferentes pode alterar a eficácia de PDT. Terrenos de citometria de fluxo representativo anexina-V vs. 7-AAD em AU para x - e y - axis para SCC-13 células incubadas com 0,5 mM 5-ALA em 27, 36 e 42 ° C. Q1: início apoptotic células, Q2: tarde células apoptóticas/necrótico, Q3: células necróticas e Q4: células viáveis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A terapia fotodinâmica (PDT) é um procedimento médico que envolve a incubação de uma forma exógena aplicada fotossensibilizador (PS) seguido de fotoativação de luz visível para induzir apoptose. Apresentamos um protocolo em vitro PDT projetado para simular o PDT que pode ser usado para estudar as diferenças em incubação de PS e parâmetros de tratamento com luz.

Uma abordagem In Vitro para terapia fotodinâmica

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a terapia fotodinâmica, também conhecida como PDT. As perguntas que podem ser respondidas usando este método incluem a duração da incubação de um fotossensibilizador ou o uso de diferentes parâmetros no experimento, como alterar a temperatura aquecendo ou resfriando as células. Essa técnica pode ajudar a facilitar o desenvolvimento in vitro de novos fotossensibilizadores, protocolos e indicações para PDT.Comece por plaquear duas vezes 10 elevado à quarta célula em dois mililitros de meio de cultura em cada poço de uma placa de seis poços usando a técnica estéril para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, lave as células com pelo menos dois mililitros de PBS e trate as culturas com diluições de zero, zero vírgula cinco, um ou dois milímetros de 5-ALA recém-preparado. Em seguida, coloque a placa em um bloco de aquecimento de 36-37 graus Celsius por 30 minutos protegido da luz.Durante o procedimento, recomendamos durante a fase de incubação que os pesquisadores usem um bloco de aquecimento para atingir uma temperatura consistente durante todo o período de incubação. Além disso, recomendamos cobrir as células durante o período de incubação com papel alumínio para evitar a ativação precoce do fotossensibilizador. No final da incubação, lave as células de cada poço com dois mililitros de PBS.E refresque as culturas com dois mililitros de meio de cultura fresco para irradiação de luz azul. Antes de irradiar as células, aqueça o dispositivo de luz azul em um comprimento de onda de saída de 417 nanômetros por um ciclo de 1.000 segundos e use um fotômetro para medir a irradiância na superfície da célula, ajustando a distância da luz para atingir a irradiância apropriada de acordo com a intensidade da fonte de luz. Em seguida, coloque as células tratadas com 5-ALA em uma superfície preta sob a luz azul por 1.000 segundos para uma fluência total de 10 joules por centímetro quadrado.Durante a fotoativação, recomendamos colocar as células em uma superfície preta para evitar reflexo de luz e dosagem inconsistente. No final do tratamento de fototerapia, lave as células de cada poço com dois mililitros de PBS e retire as células com um mililitro de 0,25% de tripsina-EDTA por poço. Após três a cinco minutos, confirme o descolamento e desative a tripsina com 10% de FBS e PBS.Transfira as células de cada poço para tubos de fluxo individuais de cinco mililitros e colete as células por centrifugação. Adicione 200 microlitros de tampão de fluxo com anticorpo conjugado anexina-V a cada amostra. Ressuspenda as células e coloque os tubos na incubadora por 20 minutos para permitir a ligação da anexina-V.No final da incubação, adicione três microlitros de 7-AAD a cada amostra e incube novamente à temperatura ambiente por cinco minutos, seguido de uma análise da amostra feita de acordo com os protocolos padrão de análise por citometria de fluxo. Após cinco tratamentos com fototerapia com ALA e luz azul, observa-se um aumento dependente da dose na apoptose celular. Para calcular a porcentagem de células submetidas à apoptose, a porcentagem de células nos quadrantes anexina-V alta, 7-AAD baixa e anexina-V alta, 7-AAD alta é adicionada.Inconsistências na duração do período de incubação de cinco ALA, temperatura de incubação ou dose de irradiação de fotoativação podem alterar a eficácia da fototerapia, resultando em um aumento dependente da temperatura na apoptose, por exemplo. Após este procedimento, outras técnicas, incluindo RTQPCR e western blot, podem ser realizadas para determinar como a PDT altera a expressão gênica e a atividade da proteína. Este método permite que os pesquisadores interessados em terapia fotodinâmica descubram os efeitos nas células cancerígenas da pele e outras doenças de pele in vitro.

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Research

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Medicine

Medicina

A terapia fotodinâmica (PDT) é um método não invasivo e não cirúrgico para o tratamento do câncer de pulmão. Os fotossensibilizadores se acumulam seletivamente no tecido tumoral e levam à morte das células tumorais na presença de oxigênio e no comprimento de onda adequado da luz. Neste vídeo de protocolo, o método baseado em PDT é usado para avaliar o potencial fototóxico de um potencial fotossensibilizador em células de câncer de pulmão.

Ensaio de fototoxicidade in vitro: um método baseado em PDT para avaliar o potencial fototóxico de um fotossensibilizador em células de câncer de pulmão

Este vídeo demonstra uma técnica para remover seletivamente células específicas de uma cultura de células 3D mista por meio de fotoimunoterapia de infravermelho próximo. Neste método, as células-alvo são identificadas com precisão usando um anticorpo conjugado com um fotoabsorvedor NIR. A irradiação subsequente com luz infravermelha induz a morte celular, eliminando efetivamente as células-alvo da cultura 3D.

Fotoimunoterapia de infravermelho próximo para eliminação celular direcionada em culturas 3D mistas

O protocolo relatado aqui permite a avaliação da eficácia da terapia fotodinâmica (PDT) em linhas de células e a optimização das condições de PDT, antes de aplicar a terapia em modelos animais.

Citotóxicos Eficácia da Terapia Fotodinâmica no osteossarcoma Células<em&gt; In Vitro</em

Este protocolo descreve um método para a fabricação de nanopartículas poliméricas condutoras misturadas com fulereno. Essas nanopartículas foram investigadas quanto ao seu potencial uso como fotossensibilizadores de próxima geração para Terapia Fotodinâmica (PDT).

Terapia Fotodinâmica com Blended polímero condutor / Fullerene Nanoparticle Fotossensibilizadores

Eliminar células específicas sem danificar outras células é extremamente difícil, especialmente em tecidos estabelecidos, mas há uma necessidade urgente de um método de eliminação celular no campo da engenharia de tecidos. Aqui, apresentamos um método para eliminação celular específica de uma cultura de células 3D mista usando fotoimunoterapia no infravermelho próximo (NIR-PIT).

Eliminação celular seletiva de Cultura 3D Mixed usando uma técnica de infravermelho próximo Photoimmunotherapy

A fotoimunoterapia quase infravermelha (NIR-PIT) é uma estratégia terapêutica emergente do câncer que utiliza um conjugado de anticorpos fotoabsorto (IR700Dye) e luz NIR para destruir células cancerosas. Aqui, apresentamos um método para avaliar o efeito antitumoral do NIR-PIT em um modelo de camundongo de câncer de pulmão disseminado pleural e mesotelioma pleural maligno usando bioluminescência por imagem.

Fotoimunoterapia infravermelha próxima para modelos de mouse de disseminação pleural

Aqui, descrevemos um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar com sucesso ensaios de terapia fotodinâmica in vitro (TFD) usando cultura de células HeLa bidimensionais e verteporfina como fotossensibilizador.

Um dispositivo de terapia fotodinâmica interno construído internamente e baseado em diodo emissor de luz para melhorar a citotoxicidade da verteporfina em um modelo de cultura de células 2D

Este protocolo apresenta um conjunto de experimentos adotados para a avaliação de peptídeos anticâncer fotocomutáveis, que podem ser utilizados na triagem pré-clínica destes compostos. Isso inclui a avaliação da citotoxicidade em culturas de células 2D e 3D, a avaliação da eficiência de fotoisomerização ex vivo (tecido modelo) e a eficácia in vivo .

Avaliação in vitro e in vivo de compostos biologicamente ativos fotocontrolados - potenciais candidatos a fármacos para a fotofarmacologia do câncer

Este protocolo descreve um método simples e econômico para avaliar a eficácia de potenciais fotossensibilizadores na inativação fotodinâmica antibacteriana (aPDI), usando um formato de placa de 96 poços combinado com uma fonte de luz de painel de LED. Essa abordagem permite o teste simultâneo de várias condições experimentais, incluindo diferentes concentrações, compostos e cepas bacterianas.

Triagem in vitro baseada em LED para avaliação de moléculas fotoativáveis na inativação fotodinâmica bacteriana

Este manuscrito apresenta um novo e inovador dispositivo de iluminação impresso em 3D para estudar a terapia fotodinâmica mediada por Rosa Bengala in vitro.

Desenvolvimento de um Dispositivo Inovador de Iluminação Baseado em LED para Aplicação In Vitro de Terapia Fotodinâmica com Rosa Bengala

Aprenda uma abordagem in vitro para terapia fotodinâmica focada em apoptose celular. Este método utiliza 5-ALA e irradiação com luz azul para desenvolver protocolos terapêuticos inovadores contra câncer de pele.

Uma abordagem In Vitro para terapia fotodinâmica

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