Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo
20 de agosto de 2018
Digital cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta útil para a detecção de alta sensibilidade de variantes de nucleotídeo único e as variantes números de cópia do DNA. Aqui, demonstramos considerações-chave para variantes raras no genoma humano usando PCR digital com o formato de microplaqueta-em-um-tubo de medição.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos testes genéticos, como detecção de mosaicismo e testes genéticos baseados em biópsia líquida. A principal vantagem dessa técnica é a detecção de alto rendimento da fração alélica de baixa variante. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de tumores, pois a detecção de mutações oncogênicas com alta sensibilidade pode contribuir para a medicina de precisão.
Comece este experimento adicionando 10 L de tampão de amostra de DNA aos tubos de uma tira de 8 tubos. Em seguida, adicione 1 microlitro de escada de DNA ao primeiro tubo da tira de 8 tubos e um microlitro de amostra de DNA genômico a cada um dos tubos restantes. Use o acessório de microplaca para misturar o conteúdo da tira de 8 tubos por vórtice por um minuto.
Coloque a tira, as pontas da pipeta e um dispositivo de gel em um instrumento de eletroforese. Pressione o botão Iniciar para iniciar a corrida. Após a execução completa, verifique o eletroferograma no visor para confirmar se o marcador inferior contido no tampão de amostra de DNA está corretamente atribuído no eletroferograma.
Caso contrário, atribua manualmente o marcador no modo eletroferograma do software. Em seguida, no modo de região do software, especifique a região de tamanho do DNA genômico para calcular automaticamente a concentração de DNA. Adicione primers, sondas e DNA genômico previamente projetados a uma nova tira de 8 tubos para obter um volume total de 15 L.Pipeta para cima e para baixo para misturar.
Adicione a plataforma de carregamento aos cavacos construídos na nova tira de 8 tubos e, em seguida, coloque a tira de tubo no carregador automático. Certifique-se de que haja um contato entre os cavacos e a plataforma de carregamento. Em seguida, coloque um controle deslizante de carregamento na plataforma e use uma rolha para segurar o controle deslizante fora do carregador.
Pipete 15 L da mistura de PCR perto da ponta do controle deslizante e, em seguida, pressione o botão do carregador para operar o carregador por um minuto. Remova a tira de tubo da carregadeira após a execução e coloque-a no intensificador de vedação. Empurre cuidadosamente a tampa deslizante e a borda da tampa superior.
Execute o intensificador de vedação por aproximadamente dois minutos. Se a vedação estiver incompleta, indicada por uma poça de líquido, repita a corrida por mais um minuto. Adicione 230 L de fluido de vedação aos tubos.
Coloque a tira de tubo no termociclador e execute a PCR conforme descrito no protocolo. Se houver uma distribuição desigual de partições positivas, ajuste a temperatura ou a duração da PCR. Para detectar e analisar a intensidade de fluorescência dos produtos de PCR, coloque a tira de tubo no gabarito de detecção e adicione 6 mL de água destilada.
Remova quaisquer bolhas de ar visíveis usando uma ponta de pipeta. Carregue o gabarito no detector. No software de detecção, selecione as guias Fluorescência, Experimento e, em seguida, Amostra NTC e clique no botão EXECUTAR para iniciar a execução.
Após a execução completa, confirme o gráfico de posição, histograma e gráfico de dispersão 2D. Para coletar o produto de PCR, remova o fluido de vedação do tubo. Adicione 100 L de tampão TE e vortex vigorosamente por 30 segundos.
Centrifugue brevemente os tubos em uma centrífuga de mesa e proceda conforme descrito no protocolo de texto para concluir a coleta do produto de PCR. Os gráficos de posição criados por PCR digital mostram fluorescência HEX amarela em amostras de pacientes e pais, indicando a presença da variante T do alelo APC, mas não em nenhum controle de molde. Apenas o DNA genômico dos pacientes contém a variante C, conforme mostrado por uma fluorescência verde de FAM.
Conforme confirmado ainda mais por gráficos de dispersão, tanto o paciente quanto o pai são positivos para HEX, ou variante T, enquanto apenas o paciente mostra a presença da variante C. A fração alélica variante dos pacientes, ou VAF, calculada pelo DPCR, foi de 13,2% semelhante aos 12,7% alcançados pelo sequenciamento de próxima geração. Por outro lado, os VAFs dos pais dos pacientes e doadores saudáveis foram inferiores a 0,1% A eletroférese dos produtos DPCR coletados e concentrados confirma que o tamanho do fragmento previsto é de 123 pares de bases no DNA dos pacientes e dos pais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a bancada limpa, por exemplo, usando uma unidade de filtro de ventilador.
Visão Geral
Este artigo discute a aplicação da reação em cadeia da polimerase digital (PCR digital) para a detecção sensível de variantes de nucleotídeo único e variantes no número de cópias de DNA. Destaca a metodologia e as implicações do uso da PCR digital em testes genéticos, particularmente para o diagnóstico de tumores.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Genética
- Oncologia
- Técnicas Diagnósticas
Contexto
- A PCR digital permite a detecção em alto rendimento de frações baixas de alelos variantes.
- Essa técnica é benéfica para a detecção de mosaicismo e para testes genéticos baseados em biópsia líquida.
- Ela contribui para a medicina de precisão ao permitir a detecção de mutações oncogênicas com alta sensibilidade.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a eficácia da PCR digital na medição de variantes genéticas raras.
- Fornecer um protocolo detalhado para implementar esta técnica.
- Explorar as implicações da PCR digital em diagnósticos clínicos.
Métodos Utilizados
- Preparação de amostras de DNA e mistura com iniciadores e sondas.
- Eletroforese para análise inicial de DNA.
- Utilização de um ciclador térmico para amplificação por PCR.
- Detecção de produtos de PCR por meio de análise da intensidade de fluorescência.
Resultados Principais
- Detecção bem-sucedida de variantes de alelos APC em amostras de pacientes.
- A fração de alelo variante (VAF) calculada pela PCR digital foi comparável aos resultados de sequenciamento de próxima geração.
- A eletroforese confirmou o tamanho dos produtos de PCR.
- Demonstrou a importância de manter um ambiente de trabalho limpo durante o procedimento.
Conclusões
- A PCR digital é uma ferramenta poderosa para detectar variantes genéticas raras.
- Este método tem implicações significativas para o diagnóstico do câncer e a medicina de precisão.
- A execução adequada do protocolo é crucial para obter resultados precisos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A PCR digital permite a quantificação precisa de frações baixas de alelos variantes, apoiando a detecção precoce de mosaicismo somático em genes de predisposição ao câncer. Essa capacidade aumenta a validação de alvos ao fornecer confirmação ortogonal de variantes raras identificadas por meio de sequenciamento. O formato de chip-em-um-tubo melhora o rendimento para aplicações de triagem pré-clínica que exigem alta sensibilidade.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da detecção de variantes raras do APC em polipose adenomatosa familiar esporádica.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da validação ortogonal da mosaicidade detectada em amostras de pacientes.
- Valor Preditivo: A quantificação da fração alélica do variant ajuda no triagem de portfólios ao confirmar a presença da variante em sistemas relevantes para a doença.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do Ensaio: O formato de chip em tubo permite oito reações dPCR simultâneas, melhorando a padronização dos fluxos de trabalho de triagem de mutações.
- Saída Quantitativa: A medição precisa da FVA (13,2% no paciente) permite a avaliação confiável dos efeitos combinados em modelos pré-clínicos.
- Escalabilidade: Os procedimentos de vedação e coleta permitem análise reprodutível de partição para confirmação posterior.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: A detecção do mosaicismo somático em APC está alinhada com as vias tumorogênicas em modelos de câncer colorretal.
- Continuidade Translacional: A concordância da FVA com NGS (12,7%) sustenta decisões de avanço ajustadas ao risco na validação pré-clínica.
- Redução Mecanística de Riscos: Diagramas de dispersão baseados em fluorescência confirmam a especificidade da variante, reduzindo o risco de falsos positivos na seleção do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes, fornecendo análises genéticas quantitativas para desvio de risco mecanicista.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação das frações alélicas de variantes do APC em amostras de câncer familiar.
- Triagem: O formato de chip em tubo permite a reprodutibilidade do ensaio e saídas quantitativas para campanhas de triagem de mutações.
- Análises: A análise da intensidade de fluorescência e os gráficos de dispersão fornecem resultados estatísticos para comparação de condições variantes entre amostras.
- Pesquisa Translacional: As medições de VAF conectam descobertas iniciais à continuidade pré-clínica em modelos de polipose adenomatosa.
- Reutilização Empresarial: Procedimentos padronizados de vedação e coleta permitem a reutilização da plataforma em múltiplos alvos genéticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da detecção sensível de frações baixas de alelos variantes.
- Valor Operacional: Padronização por meio do formato de chip em tubo e protocolos de vedação garante reprodutibilidade entre corridas.
- Valor Estratégico: Redução do risco biológico em estágios avançados ao confirmar mosaicismo no início da descoberta.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco possibilitada por medições ortogonais de VAF compatíveis com padrões de NGS.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em configuração de dPCR, detecção de fluorescência e software de análise de partição.
- Requer ciclador térmico, dispositivo de detecção e instrumentação para reforço de vedação para reações baseadas em chip.
- Exige padronização entre equipes no tempo de vedação e posicionamento da tampa deslizante para evitar irregularidade nas partições.
- Considerações para adaptação incluem a otimização da duração da PCR para obter distribuição uniforme das partições entre diferentes tipos de amostras.
- Limitação prática: é necessário cuidado no preenchimento e vedação do chip para evitar superestimação ou subestimação de partições positivas.
