Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos testes genéticos, como detecção de mosaicismo e testes genéticos baseados em biópsia líquida. A principal vantagem dessa técnica é a detecção de alto rendimento da fração alélica de baixa variante. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de tumores, pois a detecção de mutações oncogênicas com alta sensibilidade pode contribuir para a medicina de precisão.

Comece este experimento adicionando 10 L de tampão de amostra de DNA aos tubos de uma tira de 8 tubos. Em seguida, adicione 1 microlitro de escada de DNA ao primeiro tubo da tira de 8 tubos e um microlitro de amostra de DNA genômico a cada um dos tubos restantes. Use o acessório de microplaca para misturar o conteúdo da tira de 8 tubos por vórtice por um minuto.

Coloque a tira, as pontas da pipeta e um dispositivo de gel em um instrumento de eletroforese. Pressione o botão Iniciar para iniciar a corrida. Após a execução completa, verifique o eletroferograma no visor para confirmar se o marcador inferior contido no tampão de amostra de DNA está corretamente atribuído no eletroferograma.

Caso contrário, atribua manualmente o marcador no modo eletroferograma do software. Em seguida, no modo de região do software, especifique a região de tamanho do DNA genômico para calcular automaticamente a concentração de DNA. Adicione primers, sondas e DNA genômico previamente projetados a uma nova tira de 8 tubos para obter um volume total de 15 L.Pipeta para cima e para baixo para misturar.

Adicione a plataforma de carregamento aos cavacos construídos na nova tira de 8 tubos e, em seguida, coloque a tira de tubo no carregador automático. Certifique-se de que haja um contato entre os cavacos e a plataforma de carregamento. Em seguida, coloque um controle deslizante de carregamento na plataforma e use uma rolha para segurar o controle deslizante fora do carregador.

Pipete 15 L da mistura de PCR perto da ponta do controle deslizante e, em seguida, pressione o botão do carregador para operar o carregador por um minuto. Remova a tira de tubo da carregadeira após a execução e coloque-a no intensificador de vedação. Empurre cuidadosamente a tampa deslizante e a borda da tampa superior.

Execute o intensificador de vedação por aproximadamente dois minutos. Se a vedação estiver incompleta, indicada por uma poça de líquido, repita a corrida por mais um minuto. Adicione 230 L de fluido de vedação aos tubos.

Coloque a tira de tubo no termociclador e execute a PCR conforme descrito no protocolo. Se houver uma distribuição desigual de partições positivas, ajuste a temperatura ou a duração da PCR. Para detectar e analisar a intensidade de fluorescência dos produtos de PCR, coloque a tira de tubo no gabarito de detecção e adicione 6 mL de água destilada.

Remova quaisquer bolhas de ar visíveis usando uma ponta de pipeta. Carregue o gabarito no detector. No software de detecção, selecione as guias Fluorescência, Experimento e, em seguida, Amostra NTC e clique no botão EXECUTAR para iniciar a execução.

Após a execução completa, confirme o gráfico de posição, histograma e gráfico de dispersão 2D. Para coletar o produto de PCR, remova o fluido de vedação do tubo. Adicione 100 L de tampão TE e vortex vigorosamente por 30 segundos.

Centrifugue brevemente os tubos em uma centrífuga de mesa e proceda conforme descrito no protocolo de texto para concluir a coleta do produto de PCR. Os gráficos de posição criados por PCR digital mostram fluorescência HEX amarela em amostras de pacientes e pais, indicando a presença da variante T do alelo APC, mas não em nenhum controle de molde. Apenas o DNA genômico dos pacientes contém a variante C, conforme mostrado por uma fluorescência verde de FAM.

Conforme confirmado ainda mais por gráficos de dispersão, tanto o paciente quanto o pai são positivos para HEX, ou variante T, enquanto apenas o paciente mostra a presença da variante C. A fração alélica variante dos pacientes, ou VAF, calculada pelo DPCR, foi de 13,2% semelhante aos 12,7% alcançados pelo sequenciamento de próxima geração. Por outro lado, os VAFs dos pais dos pacientes e doadores saudáveis foram inferiores a 0,1% A eletroférese dos produtos DPCR coletados e concentrados confirma que o tamanho do fragmento previsto é de 123 pares de bases no DNA dos pacientes e dos pais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a bancada limpa, por exemplo, usando uma unidade de filtro de ventilador.