Name: Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a usar PCR digital para detectar variantes genéticas raras em amostras de pacientes com polipose adenomatosa familiar. Este método oferece alta sensibilidade para diagnóstico oncológico e medicina de precisão.

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Este estudo foi suportado por um subsídio para a Scientific Research (C) da sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) (n. º 15 K 08397) para Tomoaki Kahyo e por concessões da Agência de pesquisa médica e desenvolvimento (AMED) (n º 927960719), Japão Subsídio para pesquisa exploratória (n. º 16K 15256), das despesas para projectos associados de um orçamento especial incentivo para a promoção de uma reforma da Universidade Nacional de subsídios de despesas de gestão (n º 1019253) e a Fundação de pesquisa de fumar para Haruhiko Sugimura. Os autores agradecer Dr. Iwaizumi e Dr. Kurachi pelo apoio clínico. Os financiadores não tinham qualquer papel na preparação do manuscrito. Figura 3, Figura 4e tabela 4 são adaptado e reproduzido a partir de um artigo por Kahyo et al . 10, com permissão da Elsevier.

O desenho do estudo foi aprovado pelos conselhos revisão institucional de a Hamamatsu University School of Medicine (G-260-4). Obteve-se consentimento escrito do paciente e seus pais.
1. controle da qualidade do DNA genômico
Nota: O DNA genômico (gDNA) foi extraído do sangue periférico utilizando o método de purificação de DNA baseado em sílica-membrana bem estabelecido. Antes da abaixo os procedimentos, a concentração de gDNA foi determinada utilizando um espectrofotômetro.
<ol><li>Prepare a amostra de gDNA em uma concentração de 10 a 100 ng / µ l.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de tampão de amostra de DNA para uma faixa de 8-tubo.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de DNA escada ou gDNA para os tubos. A mistura por 1 min, usando o acessório de microplacas de vórtice.</li>
	<li>Carga do tubo, o dispositivo de gel e pipeta dicas para o instrumento de eletroforese (Tabela de materiais) e começar a correr, pressionando o botão 'Iniciar'. Nota: O sistema de eletroforese funciona automaticamente com um clique no botão Iniciar.</li>
	<li>Confirme que o marcador inferior contido no buffer de amostra de DNA é atribuído corretamente sobre o electropherograms. Se ele é incorretamente atribuído, atribua manualmente o marcador no 'modo de Electroherogram' do software. Nota: O número de integridade do DNA (DIN) será automaticamente calculado. O valor DIN origina-se da integridade do DNA. Alto e baixo ruído valores indicam gDNA altamente intacta e fortemente degradada, respectivamente.</li>
	<li>Especifica a região de tamanho da gDNA (&gt; 200 bp) nomodo de região' ' do software para calcular automaticamente a concentração de gDNA (&gt; 200 bp).</li>
</ol>2. primer e sonda Design
<ol><li>Calcular os valores de temperatura (Tm) fusão usando qualquer ferramenta de acesso aberto sob as seguintes condições: bases de 10 – 25, 50mm at+/k+, dNTPs 0,80 mM e 3 mM Mg2 + (Tabela de materiais). Desenha os primers para diante e reversos para amplificar a região genômica contendo alelos de destino com o valor dem T em torno de 60 ° C e o comprimento do amplicon na bp 100-300. Nota: Consulte a tabela 1 para a concentração dos oligonucleotides.</li>
	<li>Projeto do ácido nucleico bloqueado (LNA) sondas para os alelos de referência e variante baseado nas seguintes condições: (i) 1 – 6 LNAs estão presentes em cada ponta de prova; (ii) um corante fluorescente e um quencher estão presentes em 5'- e 3'-terminal de cada sonda, respectivamente; (iii) a diferença entre os valores dem T das sondas combinados e incompatíveis é &gt; 10 ° C; (iv) Tm valores as sondas combinadas e incompatíveis são superiores e inferiores dos primers, respectivamente [por exemplo, para a frente da primeira demão: 60,8 ° C, primer reverso: 59,8 ° C, sonda alelo de referência (combinado/incompatíveis): 62.6/45.3 ° C, variante sonda alelo (combinado/incompatíveis): 61.7/50.5 ° C]. Os valores dem T foram calculados usando a ferramenta de acesso aberto, também usada no passo 2.1.</li>
	<li>Certifique-se que os primers projetados e sondas não englobar os polimorfismos de nucleotídeo único com uma frequência de &gt; 0,1% conforme determinado de bancos de dados [por exemplo, o banco de dados do polimorfismo de nucleotídeo único (dbSNP)].</li>
</ol>3. digital PCR
<ol><li>Preparar as primeiras demão, sondas e gDNA soluções estoque nas concentrações descritas na tabela 1 , com um buffer de TE e armazená-los no -20-4 ° C.</li>
	<li>
Misture os reagentes à temperatura ambiente em um volume total de 15 µ l para uma concentração final conforme descrito na tabela 1.
	<ol>
<li>Adicione 3 µ l de água destilada em vez de gDNA em um controle de não-modelo (NTC).</li>
		<li>Prepare 3.5 x a quantidade da mistura de PCR em triplicado para dar conta do erro de pipetagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipete a mistura PCR para cima e para baixo misturá-lo.</li>
	<li>Definir a plataforma de carregamento para os chips construídos na faixa de 8-tubo e defini-las sobre o carregador automático. Certifique-se de que há um contato entre o chip e a plataforma de carga.</li>
	<li>Ajustar um controle deslizante de carregamento na plataforma e mantenha o controle deslizante com a rolha fora o carregador.</li>
	<li>Pipete 15 µ l da mistura de PCR na plataforma perto da ponta do controle deslizante (Figura 1A).</li>
	<li>Execute o carregador pressionando o botão do loader (por aproximadamente 1 min). Nota: Isto não é um problema se uma pequena quantidade da mistura PCR permanece na plataforma. É possível sequencialmente, execute novamente o carregador.</li>
	<li>Defina o microplaqueta-em-um-tubo preenchido com mistura PCR na ranhura lateral do realçador da selagem. Empurre a tampa corrediça e a borda da tampa superior para não quebrar o chip (Figura 1B).</li>
	<li>Execute o realçador da selagem (aproximadamente 2 min). Sequencialmente executar novamente o realçador da selagem por 1 min, se uma poça de líquido é ainda visível, porque uma selagem incompleta faz com que uma contaminação cruzada dos sinais positivos (figuras 1 e 1 D).</li>
	<li>Adicione 230 µ l de líquido, um reagente à base de óleo, para os tubos de vedação. Nota: As fichas agora devem ser imerso no fluido.</li>
	<li>Defina os tubos no termociclador. Execute o termociclador conforme descrito na tabela 2 (para aproximadamente 2 h). Ajuste a temperatura e a duração das PCR se há uma distribuição desigual de partições positivas (Figura 1E). Nota: Recomenda-se definir a taxa de rampa de cerca de 1 ° C/s.</li>
	<li>Deixe os tubos no termociclador durante pelo menos 15 minutos para reduzir o ruído da linha de base. Nota: Os tubos podem ser deixados durante a noite também. Sinais de fluorescência foram detectados até o dia seguinte.</li>
	<li>Definir os tubos no anzol a deteção e despeje o jig 6 mL de água destilada. Se as bolhas de ar são visíveis dentro e fora dos tubos, eliminá-los (figuras 1F e 1 G).</li>
	<li>Carregar o gabarito para o detector e executá-lo com um clique no botão "executar" do software após a seleção de guias Fluorescene, experimento e amostra/NTC (Tabela de materiais). Nota: A detecção de cor dupla de oito amostras com uma intensidade padrão leva aproximadamente 4-5 min.</li>
	<li>Confirme o enredo de posição, o histograma e o 2D de dispersão. Nota: iIf a intensidade da fluorescência das partições negativas é elevado, ajuste a intensidade com um clique no botão Configurações do software, de modo que cabe dentro da faixa de 30 a 70.</li>
	<li>Calcule a fração de variante alélica (VAF) usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58199/58199eq1.jpg"> Aqui, Cv e Cr são o número de cópias da variante e o alelo de referência, respectivamente. Nota: Eles são automaticamente calculados no programa de software com base em estatísticas de Poisson.</li>
</ol>4. coleção de produto do PCR
<ol><li>Remova o fluido de vedação do tubo.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de tampão TE ao tubo. Vórtice vigorosamente por 30 s e brevemente centrifugar o tubo.</li>
	<li>Transferir a solução TE para outro tubo e adicionar 30 µ l de acetato de sódio 3M e 200 µ l de etanol.</li>
	<li>Legal a solução a-20 ° C durante a noite.</li>
	<li>Centrifugue a solução por 30 min a 16.000 x g e remover o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 300 µ l de etanol a 80% para o tubo e o vórtice.</li>
	<li>Centrifugue a solução por 15 min a 16.000 x g e remover o sobrenadante. Permitir que o precipitado secar ao ar por 5 min.</li>
	<li>Dissolva o precipitado em 1 – 5 µ l de tampão TE após secagem ao ar.</li>
	<li>Se necessário, avalie o tamanho do produto usando um instrumento de eletroforese com referência à etapa 1. Carrega de 1 µ l da solução para o dispositivo de gel para uma sensibilidade elevada (Tabela de materiais).</li>
</ol>

<ol><li>Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+modeling+for+maximal+sensitivity%2C+dynamic+range+and+measurement+precision%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision.</a> PLoS One. 10 (3), 0118833(2015).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+MIQE+guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
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<li>Iwaizumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+APC+mosaicism+in+a+patient+with+familial+adenomatous+polyposis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genome+Variation%22%5BJournal%5D)">A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis.</a> Human Genome Variation. 2, 15057(2015).</li>
<li>Kahyo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+digital+PCR+with+chip-in-a-tube+format+to+analyze+Adenomatous+polyposis+coli+%28APC%29+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism.</a> Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Japanese+Society+of+Pathology+Guidelines+on+the+handling+of+pathological+tissue+samples+for+genomic+research%3A+Standard+operating+procedures+based+on+empirical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses.</a> Pathology International. 68 (2), 63-90 (2018).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
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<li>Bio-Rad Laboratories. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf</a> (2018).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf">https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf</a> (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O valor DIN é usado frequentemente para avaliar o DNA danificado (por exemplo, gDNA de tecido fixada em formol de parafina) antes de quantificação ou sequenciamento, porque uma degradação avançada de gDNA pode resultar em dados de baixa qualidade. Avaliação de ruído é, tornando-se assim, um passo importante no controle de qualidade da gDNA humana11. Desde que o gDNA usado no experimento representativo foram guardada em 4 ° C por 4 – 11 anos após a sua extração de sangue, seus valores de ruído foram determinadas para um controle de qualidade antes do ensaio de dPCR. Esta etapa é recomendada especialmente se os materiais são suspeitos de ser danificado. A concentração de gDNA também foi determinada por eletroforese. Porque a gama dinâmica de dPCR não é tão ampla quanto a qPCR devido às limitações das partições, uma medida da concentração gDNA é um passo importante para um ensaio de sucesso dPCR. Como a quantidade de DNA foi correlacionada com o número de cópia total dos alelos no ensaio dPCR variante e referência de entrada (R-quadrado = 0.935; Tabela 4), electroforese é útil para medir a concentração de gDNA antes do ensaio de dPCR.
O carregamento e a processos de vedação são passos importantes para resultados de sucesso. É crucial confirmar a montagem adequada da mistura de PCR na plataforma e assegurar um contacto entre o chip e a plataforma (Figura 1A). Protrusão de mistura PCR do controle deslizante pode causar distribuição inválida no chip. Confirmando a distribuição das partições positivas e negativas em um terreno de posição também é necessário para uma análise precisa, porque presume-se em estatísticas de Poisson que modelos de DNA são aleatoriamente divididos em câmaras1. Nos resultados do representante, partições positivas foram distribuídas por todo o chip (Figura 3). Este resultado cumpre a exigência para as estatísticas de Poisson e reflete que a carga e procedimentos de selagem foram eficazes. Quando configuração o realçador da selagem dos tubos, os chips podem ser quebrados se a parte central da pálpebra superior é empurrada demasiado fortemente (Figura 1B). Para evitar isso, empurre suavemente a borda da tampa superior. Se houver um cluster artificial de partições positivos (Figura 1D), o número de cópia pode ser superestimado devido a uma contaminação cruzada entre as partições. O processo de selagem deve ser melhorado se uma poça de líquido é visível na superfície (Figura 1C) (por exemplo, por sequencialmente executar novamente o realçador da selagem por 1 min). Se há uma distribuição desigual de partições positivas (Figura 1E), o número de cópia pode ser subestimado devido a amplificação insuficiente ou contaminação do fluido de selagem e da água. As condições PCR devem ser ajustadas neste caso [por exemplo, por meio do ajuste da temperatura ou a duração da PCR (etapa 3.11 do protocolo), ou garantindo que o fluido da selagem e água derramada o jig limpos]. Sinais de fluorescência são detectados da faixa de 8-tubo imergida em água destilada. Se as bolhas de ar aderem à superfície do tubo, há a possibilidade de que eles podem interferir com a detecção de sinal (Figura 1F). Portanto, as bolhas devem ser canceladas usando uma ferramenta, como uma ponta de pipeta fina. Além disso, as bolhas de ar podem formar dentro dos tubos, quando eles são definidos o gabarito (Figura 1G). Se as bolhas dentro dos tubos são grandes o suficiente para cobrir o chip, eles também devem ser cancelados. As bolhas podem esclarecer se são deixados por alguns minutos em temperatura ambiente.
Algumas partições positivas podem ser detectadas no NTC. Para evitar uma contaminação dos modelos de DNA, mantenha a bancada limpa e, se possível, fazer um espaço limpo com uma unidade de filtro do ventilador. Se houver suspeita de uma contaminação dos modelos de DNA, cuidadosamente limpar o espaço e/ou descartar os reagentes usados. Por outro lado, se as partições positivas do alelo referência não são detectadas em presença de gDNA, reconfirme as concentrações do gDNA, cartilhas e sondas. Notavelmente, os primers foram usados em uma concentração mais baixa no experimento representativa, em relação ao convencional do PCR (tabela 1)12. Também é crucial confirmar a taxa de rampa, que raramente é alterada no PCR convencional.
O que torna dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo único é o particionamento da mistura de PCR dentro da faixa de 8-tubo universal8,13. Uma transferência das câmaras de particionamento em um tubo PCR não é necessário neste sistema, reduzindo assim o risco de contaminação. Há também uma vantagem no sistema dPCR com formato de microplaqueta-em-um-tubo; é preciso < 4h para terminar 96 ensaios nesse sistema dPCR, enquanto leva pelo menos 5 h para terminar o mesmo número de ensaios em baseados em gotículas dPCR14. Além disso, a faixa de 8-tubo universal permite o uso de um termociclador convencional, ao contrário de outro chip baseada dPCR15, que exige um termociclador com um bloco liso. Além disso, o conhecimento acumulado e reagentes para PCR convencional podem ser aplicados ao sistema dPCR. Isto será útil para expandir as aplicações de dPCR.
Deve notar-se que dPCR tem várias limitações. Em dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo, o número da partição do chip é relativamente baixo em comparação com aqueles em outras plataformas dPCR. Melhoria adicional para o dispositivo do chip deverão aumentar o alcance dinâmico, que varia de acordo com o número de partições. Porque o espaço interno do tubo universal é limitado, uma inovadora para o dispositivo de chip é necessário para aumentar o número de partições. A automação do processo inteiro dPCR futuramente reduziria muito o erro humano, resultando em resultados ainda mais confiáveis. Devido à sua natureza de alta produtividade e alta sensibilidade, o dPCR com microplaqueta-em-um-tubo formato deverá ser aplicado para tratar um número de amostras de biópsias líquidas e DNA ambiental.

PCR quantitativo (qPCR) é frequentemente usado para quantificar a variação genética humana, incluindo variantes de nucleotídeo único (SNVs) e DNA cópia números variações (CNVs). Em qPCR, uma polimerase é realizada em cada tubo, da mesma forma como a PCR convencional de ponto de extremidade, e um sinal de amplificação é adquirido a partir do tubo após cada ciclo térmico. Por outro lado, em dPCR, significa o ponto de extremidade dPCR neste relatório, a mistura PCR é carregada em muitas câmaras microscópicas, denominadas partições, onde modelos de DNA estão presentes ou ausentes em uma diluição limitante e cada partição contendo mistura PCR é avaliada como negativo ou positivo após o PCR completa. Enquanto é fácil estimar que não há nenhum modelo de DNA nas partições negativas, desconhece-se quantas cópias de modelos de DNA estão presentes nas partições positivas. Portanto, o número de modelos de DNA nas partições positivos é estimado com base na distribuição de Poisson, usando a contagem no negativo partições1. dPCR é mais caro e tem um alcance dinâmico menor comparado a qPCR, mas este método permite uma quantificação absoluta e oferece uma maior sensibilidade e maior precisão2.
Dentre as principais aplicações de dPCR é a validação das variantes identificadas por sequenciamento de próxima geração (NGS). Especialmente no caso das variantes raras, frações de variante baixa significado, validação é fundamental devido a erros de sequenciamento que podem ocorrer em NGS3. Enquanto Sanger sequenciamento e qPCR são ferramentas úteis para a validação da SNVs e CNVs, sua sensibilidade é baixa em comparação com dPCR. Portanto, dPCR tecnologia é na demanda por estudos genéticos lidando raras variantes. Recentemente, a detecção por biópsia líquida de raras variantes relacionadas com características de câncer, tais como a resistência aos medicamentos, tornou-se um tema quente no diagnóstico molecular e terapia4. A tecnologia dPCR aparece apropriada para estudos de biópsia líquida e deverá ter importantes aplicações clínicas no futuro próximo, apesar de melhorias relacionadas com a gama dinâmica e custo ainda são necessárias para ser implementado.
Tecnologia dPCR comercialmente disponíveis pode ser categorizada aproximadamente em plataformas baseadas no chip e gota; a diferença é como os modelos de DNA são particionadas5,6,7. No dPCR com formato de microplaqueta-em-um-tubo, a mistura PCR é distribuída pela ação capilar para as partições em um chip. Os chips são construídos em tiras de oito-tubo, que muitos funcionários do laboratório já vão estar familiarizados com, e, assim, oito amostras podem ser tratadas em um tempo8. Na etapa de leitura, é preciso < 1 h para tratar 96 amostras detectando a imagem inteira do chip e não de cada partição. Desde dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo tem um alto throughput em comparação com outros sistemas dPCR, usabilidade e produtividade são as principais vantagens para seus usuários.
Neste relatório, mosaicismo somático do gene APC em um paciente com esporádico polipose adenomatosa familiar é usado como um caso representativo e os resultados de dPCR e NGS são comparados. O objetivo principal deste relatório é quantificar claramente uma variante de nucleotídeo único usando dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo. Esperamos que este relatório é útil para pesquisadores interessados em adotar a plataforma dPCR para seu próprio trabalho.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Blood Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>51194</td><td>Antes do Protocolo 1: Extração do DNA genômico</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>ND-8000</td><td>Antes do Protocolo 1: Tubo</td></tr><tr><td>de 8 tiras</td> do espectrofotômetro <td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td>Protocolo 1</td></tr><tr><td>Tampão de amostra de DNA genômico</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5366</td><td>Protocolo 1: Um componente da</td></tr><tr><td>escada de DNA</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5366 Agilent Technologies 5067-5366</td><td>><Um componente do Ensaio de Fita de Tela de DNA Genômico</td></tr><tr><td>MS3 Basic Small Shaker</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>Protocolo 1: Misturador de vórtice</td></tr><tr><td>Genomic DNA ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5365</td><td>Protocolo 1: Dispositivo de gel</td></tr><tr><td>2200 Sistema</td> <td>TapeStationAgilent Technologies</td><td>G2965AA</td><td>Protocolo 1: Instrumento de eletroforese</td></tr><tr><td>Software de análise TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>Fornecido com G2965AA</td><td>Protocolo 1: Software de análise</td></tr><tr><td>Oligo primers de DNA</td><td>IDT</td><td>Pedido personalizado</td><td>Protocolo 2</td></tr><tr><td>Sondas LNA</td><td>IDT</td><td>Pedido personalizado</td><td>Protocolo 2</td></tr><tr><td>Ferramenta de software</td><td></td><td>IDT Web site: http://biophysics.idtdna.com/</td> <td>Protocolo 2</td></tr><tr><td>dbSNP banco de dados</td><td>NCBI</td><td>Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/</td> <td>Protocolo 2</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12090015</td><td>Protocolo 3</td></tr><tr><td>Água destilada livre de DNase/RNase</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>10977015</td><td>Protocolo 3 (Tabela 1)</td></tr> <tr><td>Clarity Digital PCR Probe Mastermix</td><td>JN Medsys</td><td>12013</td><td>Protocolo 3 (Tabela 1): 2xPCR Master Mix Um componente do #10011</td></tr><tr><td>Clarity Sealing Fluid</td><td>JN Medsys</td><td>12005</td><td>Protocolo 3: Fluido de vedação Um componente do #10011</td></tr><tr><td>Clarity</td><td>JN Solution JN Medsys</td><td>12006</td><td>Protocolo 3 (Tabela 1): 20xdPCR solution Um componente do #10011</td></tr><tr><td>Clarity Tube-strip</td><td>JN Medsys</td><td>12007</td><td>Protocolo 3: Chip-in-a-tube Um componente do #10011</td></tr><tr><td>Clarity Sample Loading Kit</td><td>JN Medsys</td><td>12008</td><td>Protocolo 3: Plataforma de carregamento e controle deslizante Um componente do #10011</td></tr><tr><td>Clarity Auto Loader</td><td>JN Medsys</td><td>11002</td><td>Protocolo 3: Carregador automático Um componente do #10001</td></tr><tr><td>Clarity Sealing Enhancer</td><td>JN Medsys</td><td>11003</td><td>Protocolo 3: Intensificador de selagem Um componente de #10001</td></tr><tr><td>Clarity Reader</td><td>JN Medsys</td><td>11004</td><td>Protocolo 3: Reader Um componente do #10001</td></tr><tr><td>Life Eco Thermal Cycler</td><td>Bioer Technology</td><td>TC-96GHbC</td><td>Protocolo 3: Termociclador</td></tr><tr><td>Clarity Software</td><td>JN Medsys</td><td>Empacotado com #10001</td><td>Protocolo 3: Software de análise</td></tr><tr><td>Fita de tela D1000 de alta sensibilidade</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>Protocolo 4: Dispositivo de gel para alta sensibilidade</td></tr></tbody></table>

ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

A análise quantitativa da variação genética humana é crucial para compreender as características moleculares de doenças graves, como tumores. Porque digital polimerase reações em cadeia (PCR) permitem a quantificação precisa das variantes números de cópia do DNA, eles estão se tornando uma ferramenta essencial para a detecção de variações genéticas raras, tais como mutações resistentes aos medicamentos. Espera-se que o diagnóstico molecular usando PCR digital (dPCR) estará disponível na prática clínica num futuro próximo; assim, como conduzir eficientemente dPCR com material genético humano é um tema quente. Aqui, apresentamos um método para detectar mosaicismo somático Polipose Adenomatosa do colo (APC), usando dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo, que permite oito reações dPCR ser realizados simultaneamente. Deve ter cuidado ao enchimento e selagem a mistura de reação nas fichas. Este artigo demonstra como evitar o over - e subestimação das partições positivas. Além disso, apresentamos um procedimento simples para a coleta do produto dPCR de partições nas fichas, que podem ser usadas para confirmar a amplificação específica. Esperamos que este relatório métodos ajudará a promover o dPCR com o método de microplaqueta-em-um-tubo na pesquisa genética.

Revimos o mosaicismo somático do gene APC em um paciente com esporádico polipose adenomatosa familiar de acordo com os procedimentos descritos acima. Em um estudo anterior, a APC c.834 + 2T &gt; mutação C foi encontrada no paciente, mas não em seus pais, usando Sanger sequenciamento e NGS9. Os projetos das primeiras demão e sondas utilizadas nos resultados representativos são mostrados na tabela 3. DNA genômico foi extraído do sangue do probando, os pais e seis doadores saudáveis. Os valores de ruído das nove amostras gDNA variou de 6,7 – 7,9 (Figura 2 e tabela 4). FAM e HEX foram usados como as tinturas de fluorescência para os alelos C e T, respectivamente. As manchas de verdes e amarelas nas parcelas posição representam partições FAM-positivo e HEX-positivo, respectivamente(Figura 3). Os pontos azuis representam partições negativas para FAM e HEX. O fundo preto corresponde a partições onde a mistura de reação não foi adicionada. Muitas partições positivas dos alelos C e T foram detectadas no probando, enquanto alguns partições positivas do alelo C foram detectadas no pai do probando ou a NTC e, nas últimas, positivas partições do T alelo não foram detectados. A separação do sinal entre os alelos C e T foi clara sobre o gráfico de dispersão bidimensional (2D), e os sinais mais positivos de HEX e FAM eram exclusivos um do outro (Figura 3B). O VAF do probando era 13,2%, que é similar àquele determinado usando NGS (12,7%) (Tabela 4). Os VAFs do probando pais e doadores saudáveis foram &lt; 0,1%. Limite de detecção para a APC c.834 + 2T &gt; mutação C foi estimada em 0,3% usando 3 vezes o desvio padrão para as medições repetidas com ng 10 – 11 do total gDNA10.
O tamanho do amplicon no ensaio dPCR para APC c.834 + 2T &gt; C foi previsto para ser 123 bp. Para confirmar que o produto dPCR foi amplificado como uma única banda, o produto dPCR foi coletado o chip analisado. Usando electroforese, uma única banda claramente foi detectada e o tamanho do produto era consistente com a previsão (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig1.jpg"> Figura 1 : Pontos a serem observados para o ensaio de dPCR com microplaqueta-em-um-tubo formato. (A), este painel mostra como configurar a faixa de 8-tubo no carregador automático. (B), este painel mostra fichas quebradas. (C), este painel mostra como o chip superfícies logo após (i) carregamento e (ii) a vedação. (iii) uma poça de líquido é visível no caso de uma selagem incompleta. (D), este painel mostra a trama de posição no caso de uma contaminação cruzada. (E), este painel mostra a trama de posição no caso de uma distribuição desigual. (F), este painel mostra como ar bolhas na superfície do tubo, imergidas em água. (G), este painel mostra as bolhas de ar dentro do tubo. Em toda a figura inteira, preto e brancas setas indicam peças chip quebrado e bolhas de ar, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig2.jpg"> Figura 2 : Electropherograms representante de sangue gDNA. Electropherograms de sangue gDNA com valores de ruído de 6,7 e 7,9 são mostradas no painel inferior e superior, respectivamente. O asterisco indica um marcador inferior. DIN: Número de integridade de DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig3.jpg"> Figura 3 : Resultados representativos da APC mosaicismo somático usando dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo. (A), a posição de parcelas e (B) scatterplots do controle não-modelo (NTC), o probando e o pai são mostrados aqui. HEX e FAM correspondem os alelos de referência e variante, respectivamente. Linhas verticais e horizontais indicam os limites das intensidades HEX e FAM, respectivamente. Esta figura foi modificada de Kahyo et al . 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig4.jpg"> Figura 4 : Coleção de produtos dPCR do chip analisado. Os produtos recolhidos e concentrado dPCR foram submetidos à eletroforese. O tamanho do alvo previsto era 123 bp. Esta figura foi modificada de Kahyo et al . 10. NTC: controle de não-modelo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentração da solução-mãe</td>
			<td>Volume (μL)</td>
			<td>Concentração final</td>
			<td>Recomendado concentração final</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase/RNase-livre água destilada</td>
			<td>-</td>
			<td>1,75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x PCR Master mix</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda do LNA para alelo principal</td>
			<td>2 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>66,7 nM</td>
			<td>3.33 – 100 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda do LNA para alelo menor</td>
			<td>2 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>66,7 nM</td>
			<td>3.33 – 100 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cartilha para a frente</td>
			<td>1 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>33.3 nM</td>
			<td>3.33 – 50,0 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primeira demão reversa</td>
			<td>1 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>33.3 nM</td>
			<td>3.33 – 50,0 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x solução dPCR</td>
			<td>-</td>
			<td>0.75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>gDNA</td>
			<td>3,33 ng/μL</td>
			<td>3</td>
			<td>pg 666/μL</td>
			<td>20 pg/μL – 2.000 pg/μL1
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: reagentes utilizados para o ensaio de dPCR. 1 Dependendo da precisão esperada e sensibilidade.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Tempo</td>
			<td>Ciclos de</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturação inicial</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>5 m</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturar Recozimento e extensão</td>
			<td>95 ° C 58 ° C</td>
			<td>50 s 90 s</td>
			<td>42</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensão final</td>
			<td>70 ° C</td>
			<td>5 m</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Condições de termociclador.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Sequência1</td>
			<td>Tm valor2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cartilha para a frente</td>
			<td>5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3 '</td>
			<td>60,8 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primeira demão reversa</td>
			<td>5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3 '</td>
			<td>59,8 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda do LNA para alelo T</td>
			<td>5'-HEX-ATTT [A] CCTGACCA-IBFQ-3'</td>
			<td>Correspondência: 62,6 ° C Incompatíveis: 45,3 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda do LNA para alelo C</td>
			<td>5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3'</td>
			<td>Correspondência: 61,7 ° C Incompatíveis: 50,5 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: desenho dos primers e sondas. 1 Letras sublinhadas e entre colchetes são o LNA e variante alvo, respectivamente. 2 Calculado de acordo com a etapa 2 do protocolo.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NGS3</td>
			<td colspan="4">dPCR4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Amostra1</td>
			<td rowspan="2">Tecido</td>
			<td rowspan="2">Entrada do DNA (ng)</td>
			<td rowspan="2">DIN2</td>
			<td rowspan="2">VAF (%)</td>
			<td rowspan="2">Variante (cópias)</td>
			<td rowspan="2">Referência (cópias)</td>
			<td colspan="2">VAF (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Quer dizer</td>
			<td>RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>NTC</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1.23</td>
			<td>0</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Probando</td>
			<td>Sangue</td>
			<td>11.3</td>
			<td>7.6</td>
			<td>12.7</td>
			<td>27 X</td>
			<td>2.48 x 103
</td>
			<td>13.2</td>
			<td>0.0353</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pai</td>
			<td>Sangue</td>
			<td>10.3</td>
			<td>7.7</td>
			<td>0,0167</td>
			<td>1.08</td>
			<td>3,42 x 103
</td>
			<td>0.0341</td>
			<td>0.439</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mãe</td>
			<td>Sangue</td>
			<td>10,8</td>
			<td>7.6</td>
			<td>0.0136</td>
			<td>0.956</td>
			<td>3,04 x 103
</td>
			<td>0.0313</td>
			<td>0.637</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doador-1</td>
			<td>Sangue</td>
			<td>11,7</td>
			<td>7.3</td>
			<td>-</td>
			<td>1.64</td>
			<td>3,01 x 103
</td>
			<td>0.0543</td>
			<td>0.414</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doador-2</td>
			<td>Sangue</td>
			<td>10.5</td>
			<td>7.6</td>
			<td>-</td>
			<td>1.06</td>
			<td>2,90 x 103
</td>
			<td>0.0406</td>
			<td>0,539</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doador-3</td>
			<td>Sangue</td>
			<td>17,6</td>
			<td>7,9</td>
			<td>-</td>
			<td>4.24</td>
			<td>5.65 x 103
</td>
			<td>0.0713</td>
			<td>0.783</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doador-4</td>
			<td>Sangue</td>
			<td>12.3</td>
			<td>7.6</td>
			<td>-</td>
			<td>2.38</td>
			<td>4.16 x 103
</td>
			<td>0.0666</td>
			<td>0.557</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doador-5</td>
			<td>Sangue</td>
			<td>19.2</td>
			<td>7</td>
			<td>-</td>
			<td>1.48</td>
			<td>6,79 x 103
</td>
			<td>0.0213</td>
			<td>0.571</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doador-6</td>
			<td>Sangue</td>
			<td>14,4</td>
			<td>6.7</td>
			<td>-</td>
			<td>3.44</td>
			<td>4,67 x 103
</td>
			<td>0.0728</td>
			<td>0.729</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4: resultados da dPCR do ensaio para APC mosaicismo somático. 1 NTC: controle de não-modelo; Doador: doador saudável. 2 DIN: Número de integridade de DNA. 3 Iwaizumi et al 9, hum genoma var. 15057 2 (2015). 4 Os experimentos foram executados em triplicado e independentemente repetida 3x; os dados são expressos como o valor médio; RSD: desvio-padrão relativo, N/a: não aplicável. A tabela foi modificada de Kahyo et al . 10.

Digital cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta útil para a detecção de alta sensibilidade de variantes de nucleotídeo único e as variantes números de cópia do DNA. Aqui, demonstramos considerações-chave para variantes raras no genoma humano usando PCR digital com o formato de microplaqueta-em-um-tubo de medição.

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos testes genéticos, como detecção de mosaicismo e testes genéticos baseados em biópsia líquida. A principal vantagem dessa técnica é a detecção de alto rendimento da fração alélica de baixa variante. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de tumores, pois a detecção de mutações oncogênicas com alta sensibilidade pode contribuir para a medicina de precisão.Comece este experimento adicionando 10 L de tampão de amostra de DNA aos tubos de uma tira de 8 tubos. Em seguida, adicione 1 microlitro de escada de DNA ao primeiro tubo da tira de 8 tubos e um microlitro de amostra de DNA genômico a cada um dos tubos restantes. Use o acessório de microplaca para misturar o conteúdo da tira de 8 tubos por vórtice por um minuto.Coloque a tira, as pontas da pipeta e um dispositivo de gel em um instrumento de eletroforese. Pressione o botão Iniciar para iniciar a corrida. Após a execução completa, verifique o eletroferograma no visor para confirmar se o marcador inferior contido no tampão de amostra de DNA está corretamente atribuído no eletroferograma.Caso contrário, atribua manualmente o marcador no modo eletroferograma do software. Em seguida, no modo de região do software, especifique a região de tamanho do DNA genômico para calcular automaticamente a concentração de DNA. Adicione primers, sondas e DNA genômico previamente projetados a uma nova tira de 8 tubos para obter um volume total de 15 L.Pipeta para cima e para baixo para misturar.Adicione a plataforma de carregamento aos cavacos construídos na nova tira de 8 tubos e, em seguida, coloque a tira de tubo no carregador automático. Certifique-se de que haja um contato entre os cavacos e a plataforma de carregamento. Em seguida, coloque um controle deslizante de carregamento na plataforma e use uma rolha para segurar o controle deslizante fora do carregador.Pipete 15 L da mistura de PCR perto da ponta do controle deslizante e, em seguida, pressione o botão do carregador para operar o carregador por um minuto. Remova a tira de tubo da carregadeira após a execução e coloque-a no intensificador de vedação. Empurre cuidadosamente a tampa deslizante e a borda da tampa superior.Execute o intensificador de vedação por aproximadamente dois minutos. Se a vedação estiver incompleta, indicada por uma poça de líquido, repita a corrida por mais um minuto. Adicione 230 L de fluido de vedação aos tubos.Coloque a tira de tubo no termociclador e execute a PCR conforme descrito no protocolo. Se houver uma distribuição desigual de partições positivas, ajuste a temperatura ou a duração da PCR. Para detectar e analisar a intensidade de fluorescência dos produtos de PCR, coloque a tira de tubo no gabarito de detecção e adicione 6 mL de água destilada.Remova quaisquer bolhas de ar visíveis usando uma ponta de pipeta. Carregue o gabarito no detector. No software de detecção, selecione as guias Fluorescência, Experimento e, em seguida, Amostra NTC e clique no botão EXECUTAR para iniciar a execução.Após a execução completa, confirme o gráfico de posição, histograma e gráfico de dispersão 2D. Para coletar o produto de PCR, remova o fluido de vedação do tubo. Adicione 100 L de tampão TE e vortex vigorosamente por 30 segundos.Centrifugue brevemente os tubos em uma centrífuga de mesa e proceda conforme descrito no protocolo de texto para concluir a coleta do produto de PCR. Os gráficos de posição criados por PCR digital mostram fluorescência HEX amarela em amostras de pacientes e pais, indicando a presença da variante T do alelo APC, mas não em nenhum controle de molde. Apenas o DNA genômico dos pacientes contém a variante C, conforme mostrado por uma fluorescência verde de FAM.Conforme confirmado ainda mais por gráficos de dispersão, tanto o paciente quanto o pai são positivos para HEX, ou variante T, enquanto apenas o paciente mostra a presença da variante C. A fração alélica variante dos pacientes, ou VAF, calculada pelo DPCR, foi de 13,2% semelhante aos 12,7% alcançados pelo sequenciamento de próxima geração. Por outro lado, os VAFs dos pais dos pacientes e doadores saudáveis foram inferiores a 0,1% A eletroférese dos produtos DPCR coletados e concentrados confirma que o tamanho do fragmento previsto é de 123 pares de bases no DNA dos pacientes e dos pais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a bancada limpa, por exemplo, usando uma unidade de filtro de ventilador.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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