Name: Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda a modelar tuberculose em zebrafish adultos infectados com Mycobacterium marinum. Este método permite quantificar cargas bacterianas e respostas imunes simultaneamente através de qPCR.

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Este trabalho foi apoiado pelo finlandês Cultural Foundation (H.L.), Fundação de tuberculose de Tampere (H.L., L.-M.V., M.M.H, M.P.), Fundação da associação finlandesa de antituberculose (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H, M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (P.F.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H), Jane e Aatos Erkko Foundation (P.F.) e Academia da Finlândia (P.F.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo e Jenna Ilomäki são reconhecidos por sua assistência técnica. Os autores reconhecem o laboratório de Zebrafish de Tampere para seu serviço.

Todos os experimentos de zebrafish foram aprovados pelo Conselho de experimento Animal na Finlândia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Métodos são executados de acordo com a lei (497/2013) e do Decreto do governo (564/2013), relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos ou educacionais na Finlândia.
1. cultivo de Mycobacterium marinum
Nota: Desde que o Mycobacterium marinum é um patógeno capaz de causar infecções superficiais nos seres humanos, descobrir as diretrizes locais para segurança pessoal e eliminação de resíduos de risco biológico antes de começar a trabalhar com esta bactéria.
<ol><li>Cultura de M. marinum em um 7 H 10 placa suplementado com 10% OADC (ácido oleico, albumina, dextrose, catalase) enriquecimento e 0,5% v/v de glicerol a 29 ° C durante pelo menos 5 dias. Manter as culturas de M. marinum tomando frescas bactérias do congelador a cada duas semanas e transferir para um prato novo toda semana. Nota: M. marinum é um patógeno de peixe natural infectar espécies aquáticas e é importante tomar precauções para não contaminar o zebrafish existências com as bactérias. Zebrafish infectado e itens contaminados com bactérias devem ser mantidas separadas das instalações da reprodução.</li>
	<li>Usar um loop de inoculação de 1 µ l estéril para transferir assepticamente uma loopful de M. marinum massa bacteriana em um frasco de cultura de células contendo 10 mL de 7h 9 médio com enriquecimento de ADC (albumina, glicose, catalase) 10%, 0,2% v/v Polissorbato 80 e 0,2% v/v de glicerol. Cultura por 3 – 4 dias para aproximadamente uma OD600 (densidade óptica) de 0,7 a 29 ° C, no escuro sem tremer. Deixar a tampa solta, ou use uma tampa de filtro, para permitir o intercâmbio suficiente de gases. Nota: Polissorbato 80 é adicionado ao meio para evitar a agregação das bactérias. Além disso, a exposição à luz conduz a alterações fenotípicas em colônias bacterianas (por exemplo, a cor muda de branco para amarelo). Para evitar isso, mantenha as culturas no escuro.</li>
	<li>Medir o valor de600OD com um espectrofotômetro. Diluir a cultura líquida para uma OD600 de 0,07 – 0,09 e continuar o cultivo por 2 dias a 29 ° C, no escuro, sem tremer. Deixe a tampa solta. Nota: Durante estes dois dias, a suspensão bacteriana alcançará uma OD600de aproximadamente 0,5 correspondente a uma fase inicial de registro.</li>
</ol>2. preparação da solução bacteriana por infectar adulto Zebrafish
<ol><li>Transferir a suspensão bacteriana em uma cubeta grande estéril ou um tubo de 15 mL e colocá-lo no escuro à temperatura ambiente por 15 min permitir que os grupos maiores resolver.</li>
	<li>Transferir o top 5-7 mL da suspensão para um tubo limpo ou uma cubeta e medir o OD600. Use esta fase superior da suspensão para as infecções.</li>
	<li>Colete 1 mL de cultura de M. marinum em um tubo fresco e centrifugar para 3 min a 10.000 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de PBS 1x estéril.</li>
	<li>Diluir a alcançar a concentração bacteriana desejada usando estéril 1 x PBS com 0,3 mg/mL de vermelho de fenol como um traçador. Divida a suspensão diluída em três alíquotas. Nota: Use um pré-determinado OD600 vs UFC (unidades formadoras de Colônia) / curva µ l para estimar a diluição necessária para obter o número procurado de bactérias a injeção de 5 µ l volume34. A correlação entre a concentração da suspensão bacteriana e OD600 precisa ser validado antes de iniciar os experimentos de infecção real. Reserva duas semanas para coletar esses dados de validação.</li>
	<li>Utilizando uma seringa de 1 mL, lentamente puxar a suspensão através de um 27G agulha x 3. Para cada alíquota, execute esta etapa antes do uso. Nota: Não use a mesma solução bacteriana para mais de 2 h.</li>
</ol>3. experimental M. marinum infecção com injeção Intraperitoneal
<ol><li>Pipetar uma gotícula de 5 µ l da solução diluída em um pedaço de filme de parafilm bacteriana e puxar a gota em uma agulha de insulina 30g.</li>
	<li>Use 5 – 8 mês-velho selvagem-tipo peixe e peixes mutantes de rag1−/−hu1999 para o experimento. Anestesia o zebrafish adulto na água tanque com éster de ácido etil 3-aminobenzoico 0,02% (pH 7,0). Posicione o lado ventral do peixe acima em uma fenda em um plástico espumado húmida. Nota: Rag-/- peixes mutantes não são capazes de se submeter a recombinação somática e produzir células T e B funcionais.</li>
	<li>Injetar a agulha entre as nadadeiras pélvicas em um ângulo de aproximadamente 45°. Manter a abertura da agulha para cima para observar que a abertura inteira está dentro da cavidade abdominal. Injetar lentamente a suspensão bacteriana e Retire cuidadosamente a agulha. Nota: no caso do marcador vermelho está vazando o peixe em cima da injeção, exclua o peixe do experimento.</li>
	<li>Imediatamente após a injeção, transferi os peixes em um tanque de recuperação com água fresca.</li>
	<li>Tirar amostras da suspensão bacteriana em 7H 10 placas a cada 15 min da alíquota em uso o bacteriano e incubar a bactéria a 29 ° C durante 5 dias e verificar se a dose de infecção através da contagem das colônias nas placas.</li>
	<li>Verifique regularmente se o bem-estar dos peixes e eutanásia qualquer peixe com sintomas da infecção com mais de 0,02% concentração de éster de ácido etil 3-aminobenzoico (pH 7.0). Nota: Aproximadamente, 7% do zebrafish adulto infectado com 34 ± UFC 15 e 30% de zebrafish infectado com 2029 ± 709 CFU por 8 semanas19terá tido sintomas. Os sintomas podem incluir natação anormal, falta de resposta ao toque, ofegante, edema ou desperdiçar observáveis.</li>
	<li>Manter o zebrafish de acordo com os padrões comuns35.</li>
</ol>4. cobrança dos órgãos internos
<ol><li>Eutanásia o zebrafish com uma overdose de éster de ácido etil 3-aminobenzoico (mais de 0,02% de concentração, pH 7,0) na água do tanque.</li>
	<li>Inserir um pino posterior para os raios branquiostegais e outra através da cauda para virar o peixe para a plataforma.</li>
	<li>Abrir a cavidade abdominal todo com um bisturi e coletar os órgãos internos, usando uma colher pequena e uma pinça de pontas afiadas. Começar do coração e ao longo da espinha para a cauda para desanexar todos os órgãos internos em um bloco. Nota: Certifique-se de recolher todo o tecido renal por raspagem ao longo da espinha com a colher.</li>
	<li>Finalmente, use uma pinça para desanexar o intestino ao lado da cloaca e transferir os órgãos em um tubo de homogeneização de 1,5 mL com seis esferas de cerâmica de 2,8 mm. Coloca imediatamente em gelo seco para congelar a amostra. A amostra pode ser armazenada a-80 ° C até homogeneizado.</li>
	<li>Lave os instrumentos com etanol a 70% entre os indivíduos.</li>
</ol>5. homogeneização e RNA extraído um bloco de órgão.
Nota: O método é modificado da Universidade de Stanford protocolos36.
<ol><li>Adicionar a solução de fenol-tiocianato de guanidina usada para extração de ácidos nucleicos (Tabela de materiais) na parte superior da amostra para um volume total de 1.500 µ l. Certifique-se de que a amostra abrange um máximo de 10% do volume total. Atenção: O volume esperado do tecido colhido é 100 µ l. guanidina tiocianato-solução de fenol contém tóxico e irritante compostos e exige roupas de proteção, luvas de nitrilo e trabalhando em uma coifa. Não combinam com água sanitária porque isso poderá provocar a formação de gases tóxicos. Leia a folha de dados de segurança do material (MSDS) antes do uso.</li>
	<li>Homogeneizar as amostras usando um homogeneizador de grânulo batendo 3 vezes para 40 s a 3.200 rpm. Legal no gelo por 30 s entre os ciclos. Proceda à sonicação as amostras homogeneizadas num banho de água durante 9 min.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e mover 1.000 µ l do homogenate apurada em um tubo de microcentrifugadora fresco.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de clorofórmio, imediatamente misture vortexing por 15 s e incubar por 2 min à temperatura ambiente. Cuidado: Clorofórmio é um tóxico e irritante composto se inaladas, ingeridas ou em contato com a pele ou olhos. Usar equipamento de segurança necessário para a proteção pessoal e trabalho em uma coifa. Leia a folha de dados de segurança do material (MSDS) antes do uso.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C para separar as fases aquosas e orgânicas.</li>
	<li>Transferi com cuidado, 500 µ l da fase superior para um tubo fresco para não poluir o RNA. Remover e descartar o resto da fase aquosa (~ 100 µ l) e armazenar a interfase e a fase orgânica a 4 ° C para a extração de DNA. Nota: A fase superior contém o RNA.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l de 2-propanol e imediatamente misture num Vortex durante 15 s. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente precipitar o RNA.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C para o RNA de Pelotas. Retire o sobrenadante por pipetagem.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de etanol 75% e vórtice por 10 s. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras mantidas durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 7.500 x g por 5 min a 4 ° C. Retire o sobrenadante por pipetagem.</li>
	<li>Repita as etapas de lavagem 5.9-5.10. Remover o sobrenadante cuidadosamente pipetando e deixar o sedimento secar ao ar livre em uma coifa.</li>
	<li>Dissolva a pelota do RNA em 500 µ l de água livre de nuclease e manter as amostras no gelo. Medir as concentrações com um espectrofotômetro microvolume ou equipamento equivalente. Armazenar o RNA a-80 ° C.</li>
</ol>6. purificação de Zebrafish co extraído e DNA micobacteriana
<ol><li>Preparar uma volta-solução tampão (BEB) dissolvendo 118,2 g de tiocianato de guanidina (concentração final 4 M), 3,68 g de citrato de sódio (concentração final 50mm) e 30,29 g de Tris base livre (concentração final de 1 M) em 120 mL de água livre de nuclease (maio deste exigem que a agitação durante a noite). Adicione água nuclease livre para um volume total final de 250 mL e filtro para esterilizar a solução. Nota: Esta reserva pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 6 meses. Não combine BEB com lixívia como eles reagem para produzir gases tóxicos tais como o cloreto de hidrogênio e cianeto de hidrogênio.</li>
	<li>Use a interfase e a fase orgânica da amostra para extrair DNA de micobactérias. Adicione 500 μL de BEB a cada tubo. Misture-se extensivamente por 10 min por inversão à temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 12.000 x g por 30 min à temperatura ambiente e 500 µ l da fase aquosa superior contendo o DNA para um novo tubo de transferência com cuidado.</li>
	<li>Adicione 400 μL de 2-propanol. Misture por inversão e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C. Neste ponto, uma pastilha que contém o DNA deve ser visível. Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.</li>
	<li>Adicione 800 μL de etanol a 70%. Lave o pellet por inversão. Fazer não vórtice neste momento, as amostras como DNA genômico quebra facilmente.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C e retire o sobrenadante por pipetagem. Repeti a lavagem de etanol (etapas 6.6 e 6.7).</li>
	<li>Remova o etanol pipetando cuidadosamente. Deixe que as amostras secar ao ar por 5-10 min. dissolva a pelota em 200 μL de água livre de nuclease.</li>
	<li>Medir as concentrações de DNA com um espectrofotômetro microvolume ou equipamento equivalente. DNA pode ser armazenado a 4 ° C ou a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>7. quantitativo PCR para medir cargas micobacterianas
<ol><li>Prepare misturas de reação qPCR com n-ROX (carboxi-X-rodamina) contra o M. marinum espaçador interno transcrito (ITS) entre 16S-23S ITS de acordo com as instruções do fabricante com primers MMITS1 (tabela 1). Pipetar o mix de reação e diluições da amostra como duplicatas em uma placa de 96 poços apropriada para qPCR. Incluem uma série de diluição padrão de DNA de uma quantidade conhecida de bactérias em cada execução. Nota: O esperado M. marinum carga por peixes pode variar de 0 UFC UFC 1.000.000 no wpi 4. O ensaio de qPCR também pode ser realizado com outros kits de qPCR, mas a temperatura do recozimento para as primeiras demão deve ser re-otimizado.</li>
	<li>A placa com uma película opticamente transparente do selo e centrifugar a placa a 2.000 x g por 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>Execute o programa de qPCR mostrado na tabela 2.</li>
	<li>Usando a curva de calibração, calcule o número de bactérias na amostra peixe inteiro.</li>
</ol>8. DNase tratamento das amostras de RNA
<ol><li>Para remover todos os restos possíveis de DNA genômico de RNA, realizar DNase eu tratamento. Descongele as amostras de RNA no gelo. Nota: Certifique-se de usar apenas equipamento livre de RNase e soluções e limpe a superfície de trabalho e as pipetas com um reagente de descontaminação eliminando RNases (Tabela de materiais) antes de começar a trabalhar. Vestir um jaleco de mangas compridas e luvas para proteger suas amostras.</li>
	<li>Prepare-se 10 μL DNase misturas de reação no gelo, de acordo com as instruções do fabricante. Misturar 1 μL de DNase I, 1 μL de 10x buffer de DNase e 8 μL do RNA da amostra incluindo um máximo de 1 μg de RNA.</li>
	<li>Delicadamente misture as reações (não num Vortex) e incube por 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Antes da calor-inactivação, adicione 1 µ l de 50 mM EDTA para cada 10 µ l da amostra. Se o EDTA não é adicionado, o RNA vai sofrer degradação química quando aquecido.</li>
	<li>Incubar durante 10 minutos a 65 ° C e calor-inativar DNase I. continuar diretamente para a síntese do cDNA ou armazenar o RNA DNase-tratados a-80 ° C.</li>
</ol>9. síntese de cDNA
<ol><li>Manter todos os reagentes e amostras no gelo e preparar a mistura de reação, de acordo com as instruções do fabricante. Para uma mistura de reação 5 μL, incluem 1 μL da mistura de mestre de transcrição reversa, 3 μL de água livre de nuclease e 1 μL de DNase tratados do RNA.</li>
	<li>Misture suavemente as reações de transcrição reversa e brevemente girar o tubo, se necessário.</li>
	<li>Colocar as amostras em uma máquina PCR e usar o programa mostrado na tabela 3.</li>
	<li>Dilua o cDNA em água livre de nuclease para qPCR para uma concentração máxima de 2,5 ng/μL, se necessário. o cDNA pode ser armazenado a-20 ° C.</li>
</ol>10. medir a expressão gênica de Zebrafish por PCR quantitativo
<ol><li>Preparar uma mistura de mestre qPCR no gelo, de acordo com as instruções do fabricante e proteja da luz. Use os primers apresentados na tabela 1. Nota: Para calcular a dobra de indução para cada gene, medir a expressão também a partir de uma amostra de linha de base em pool extraída 6 zebrafish saudável.</li>
	<li>Preparar as repetições de cada amostra e pipetar as misturas de reação em um prato de qPCR. A placa com uma película opticamente transparente do selo e centrifugar a placa a 2.000 x g por 2 min a 4 ° C antes de iniciar a execução.</li>
	<li>Executar o qPCR programa mostrado no quadro 4 , com a temperatura do recozimento dependendo do par de primer utilizado (tabela 1).</li>
	<li>Analise a relação de expressão do gene em comparação com um gene de domésticas (loopern437) com o método de ΔCt através da equação: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58299/58299eq1.jpg">
</li>
</ol>

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Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui nós descrevemos uma aplicação baseada em qPCR para medir micobacterianas cargas de DNA extraído de tecidos de zebrafish adultos infectados experimentalmente. Este aplicativo é baseado em cartilhas projetadas em torno do 16S-23S rRNA espaçador transcrito interno sequência40. A carga total de micobactérias em uma amostra de peixes é estimada usando uma curva padrão preparada a partir de DNA extraído de um número conhecido de micobactérias culturas e assumindo que uma bactéria tem uma cópia do s...

Peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo animal amplamente utilizado na investigação biomédica e é um modelo aceito para a biologia de vertebrados comum. O zebrafish foi adaptada a muitos campos de pesquisa modelagem de doenças humanas e desordens que variam de câncer1 e doença cardíaca2 a infecção e estudos imunológicos de várias bactérias 3 e infecções virais4 , 5. Além disso, o ex utero desenvolvimento de embriões de zebrafish fez o zebrafish um modelo popular em biologia do desenvolvimento-6 e toxicologia7,8.
Em muitos campos de investigação, incluindo a biologia da infecção, as larvas de zebrafish opticamente transparente são comumente usadas. As primeiras células imunes aparecem dentro fertilização post de 24 h (hpf), quando os macrófagos primitivos são detectados9. Os neutrófilos são as células imunitárias próximo a aparecer por volta de 33 hpf10. Zebrafish larvas são, portanto, viáveis para o estudo da fase inicial da infecção e o papel da imunidade inata na ausência de células do sistema imune adaptativo11. No entanto, o zebrafish adulto com seu totalmente funcional sistema imune adaptativo fornece uma camada adicional de complexidade para experimentos de infecção. Células T podem ser detectadas em torno de 3 dias pós fertilização12, e as células B são capazes de produzir anticorpos funcionais por 4 semanas pós fertilização13. O peixe-zebra adulto tem todas as principais contrapartes do mamífero sistema imune inato e adaptativo. As principais diferenças entre o immune systems de peixe e os seres humanos são encontradas no anticorpo isotipos, bem como a anatomia dos tecidos linfoides. O peixe-zebra tem anticorpo apenas três classes14, Considerando que os seres humanos têm cinco15. Na ausência de medula óssea e gânglios linfáticos, os órgãos linfoides primários no peixe são o rim e o Timo16 e o baço, o rim e o intestino servem como órgãos linfoides secundários17. Apesar dessas diferenças, com seu arsenal completo imune das células inatas e adaptativas, o zebrafish adulto é um modelo altamente aplicável, fácil de usar, não-mamíferos para estudos de interação patógeno-hospedeiro.
O zebrafish ultimamente foi estabelecido como um modelo viável de estudar tuberculose18,19,20,21,22. A tuberculose é uma doença no ar, causada pelo Mycobacterium tuberculosis. De acordo com a Organização Mundial de saúde, tuberculose causou1,7 milhões de mortes em 2016 e é a principal causa de morte por um patógeno único no mundo23. Os ratos24,25, coelhos26 e primatas não-humanos27 são que o animal mais conhecido modelos na pesquisa de tuberculose, mas cada rosto suas limitações. O modelo de primatas não humanos de M. tuberculosis infecção da doença humana assemelha-se mais intimamente, mas usar este modelo é limitado devido a considerações éticas graves. Outros modelos animais são prejudicados pela anfitrião-especificidade de M. tuberculosis que afeta a patologia da doença. Provavelmente o maior problema na modelagem de tuberculose é o amplo espectro de infecção e doença resultados na doença humana: a tuberculose é uma doença muito heterogênea, variando de esterilização imunidade a infecção latente, ativa e reativada28 , que pode ser difícil de reproduzir e modelo experimentalmente.
Mycobacterium marinum é um parente próximo do M. tuberculosis com proteínas de ortólogos ~ 3.000 com 85% de identidade de aminoácidos29. M. marinum naturalmente infecta zebrafish produzir granulomas, as principais características da tuberculose, em seus órgãos internos19,30. Ao contrário de outros modelos animais utilizados na pesquisa de tuberculose, zebrafish produz muitos filhos, requer apenas um espaço limitado e importante, neurophysiologically é o modelo de tuberculose vertebrados menos desenvolvido disponível. Além disso, a M. marinum infecção causa infecção latente, doença ativa ou mesmo esterilização da infecção micobacteriana no zebrafish adulto intimamente imitando o espectro dos resultados de doença da tuberculose humana19, 31 , 32. aqui, descrevemos os métodos para o modelo experimental de tuberculose de adultos do zebrafish injetando M. marinum na cavidade abdominal e usando PCR quantitativo para medir a cargas micobacterianas e respostas imunes de zebrafish amostras de tecido.

<table><tbody><tr><td>Mycobacterium marinum</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 927</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H10 ágar</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11799042</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock OADC enriquecimento</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H9 medium</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11753473</td><td></td></tr><tr><td>Enriquecimento BD de Middlebrock ADC</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro GENESYS20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos salinos tamponados com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de fenol vermelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>27 G</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004020</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 1 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 100 30 G agulha de insulina</td><td>Braun</td><td>9151133</td><td></td></tr><tr><td>éster etílico de ácido 3-aminobenzóico (pH 7,0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tubo de homogeneização</td><td>Qiagen</td><td>13119-1000</td><td></td></tr><tr><td>grânulos cerâmicos de 2,8 mm</td><td>Qiagen</td><td>13114-325</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, ETAX Aa</td><td>Altia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td></td></tr><tr><td>Tiocianato de guanidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9277</td><td>FW 118,2 g/mol</td></tr><tr><td>Citrato</td> <td>de sódioSigma-Aldrich</td><td>1613859</td><td>FW 294,1 g/mol</td></tr><tr><td>Tris (base livre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>FW 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>TRI reagente</td><td>Centro de Pesquisa Molecular</td><td>TR118</td><td>Solução de tiocianato-fenol de guanidina</td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator m08</td><td>Finnsonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-98005</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Placa de 96 poços</td><td>BioRad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Filme opticamente transparente</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Termociclador com sistema em tempo real CFX96</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Reagente</td><td>de descontaminação 10666421 eliminando RNases</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Master Mix de Transcrição Reversa</td><td>Fluidigm</td><td>100-6298</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green master mix</td><td>BioRad</td><td>172-5211</td><td></td></tr></tbody></table>

modelagem de tuberculose no zebrafish adulto infectado de mycobacterium marinum

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis é atualmente o mais mortífero patógeno humano causando infecções 10,4 milhões e 1,7 milhões de mortes todos os anos. Exposição a esta bactéria faz com que um espectro largo de doença em seres humanos, que vão desde uma infecção esterilizada para uma doença mortal ativamente progredindo. A forma mais comum é a tuberculose latente, que é assintomática, mas tem o potencial para reativar a uma doença fulminante. Zebrafish adulto e seu patógeno natural Mycobacterium marinum recentemente provaram para ser um modelo aplicável para estudar o espectro de doença ampla de tuberculose. Importante, espontânea latência e reativação, bem como adaptáveis respostas imunes no contexto da infecção micobacteriana pode ser estudadas neste modelo. Neste artigo, descrevemos os métodos para a infecção experimental de zebrafish adulto, a coleção dos órgãos internos para a extração de ácidos nucleicos para a medição das cargas micobacterianas e acolhimento respostas imunes por PCR quantitativo. O in desenvolvido internamente, M. marinum -ensaio de qPCR específico é mais sensível que os métodos tradicionais de chapeamento como também detecta DNA de micobactérias não-dividindo, dormentes ou recentemente mortas. Como o DNA e o RNA são extraídos do mesmo indivíduo, é possível estudar as relações entre o estado doente e a expressão do gene hospedeiro e patógeno. O modelo adulto zebrafish para tuberculose, portanto, apresenta-se como um sistema altamente aplicável, não-mamíferos na vivo para estudar interações patógeno-hospedeiro.

O patógeno de peixe natural Mycobacterium marinum infecta os órgãos internos do peixe-zebra e produz uma infecção sistêmica com granulomas histologicamente visível19. Zebrafish adulto estão infectados com M. marinum por uma injeção intraperitoneal. O DNA e RNA são extraídos, e a carga de micobactérias é medida pela reacção em cadeia do polymerase quantitativa (qPCR) usando o DNA como o modelo. O contorno do método é mostrado na <strong class="xfig...

Aqui, apresentamos um protocolo para tuberculose humana de modelo em um adulto zebrafish usando seu patógeno natural Mycobacterium marinum. Extraído DNA e RNA de órgãos internos de zebrafish infectado podem ser usado para revelar que o total micobacteriana carrega no peixe e as respostas de imune do hospedeiro com qPCR.

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da tuberculose, como qual é o papel das respostas imunes adaptativas e a patogênese desta doença multifatorial. A principal vantagem deste método de base nucleico de ácido é que tanto cargas bacterianas quanto níveis de expressão genética podem ser medidos a partir do mesmo indivíduo. Para iniciar este procedimento, cultura M.marinum em uma placa 7H10 como descrito no protocolo de texto.Transfira 10 mililitros de meio 7H9 contendo enriquecimento ADC, polisorbato 80 e glicerol para um frasco de cultura celular. Em seguida, use um loop de inoculação de um microliter estéril para transferir asepticamente um loopful da massa bacteriana M.marinum para o frasco. Deixe a tampa solta ou use uma tampa de filtro para permitir a troca de gás e cultura suficientes a 29 graus Celsius no escuro sem tremer por três a quatro dias até que o OD600 atinja cerca de 0,7.Diluir e continuar a culminar as bactérias como descrito no texto. Para começar a preparar a solução bacteriana para infecção, transfira um mililitro da cultura para um tubo fresco. Centrífuga a 10.000 g por três minutos.Remova o supernatante e resuspenque a pelota em um mililitro de PBS estéril. Utilizando PBS estéril com um mililitro de 0,3 miligramas por mililitro de vermelho fenol como rastreador, diluir a suspensão para atingir a concentração bacteriana desejada. Depois disso, use uma seringa de um mililitro para puxar lentamente a suspensão através de uma agulha calibre 27 três vezes.Execute esta etapa um pouco antes de usar para cada alíquota. Primeiro, pipeta uma gotícula de cinco microliter da solução bacteriana diluída em um pedaço de filme de parafina. Em seguida, puxe a gota em uma agulha de insulina calibre 30.Use um peixe de cinco a oito meses para este experimento, sendo um peixe selvagem e o outro sendo um peixe mutante de trapos. Posicione estes peixes do lado ventral para cima nas fendas de um pedaço de plástico espumoso úmido. Injete a agulha de insulina entre as barbatanas pélvicas em um ângulo de 45 graus.Mantenha a agulha aberta para cima para garantir que toda a abertura esteja dentro da cavidade abdominal. Então, injete lentamente a solução bacteriana. Depois disso, remova cuidadosamente a agulha e transfira imediatamente o peixe para um tanque de recuperação cheio de água fresca do tanque.Pegue amostras da alíquota bacteriana em uso a cada 15 minutos em placas 7H10. Incubar essas amostras a 29 graus Celsius durante cinco dias para verificar a dose de infecção. Verifique o bem-estar dos peixes regularmente, certificando-se de eutanásia qualquer peixe com sintomas de infecção incubando-os em água com mais de 0,02% de 3-aminobenzoicos ácido etil ester.Depois de eutanásia do peixe, insira um pino posterior aos raios ramificaistegal. Insira um segundo pino através da cauda para colocar o peixe na plataforma. Usando um bisturi, abra toda a cavidade abdominal.Em seguida, use uma colher pequena e pinças afiadas para coletar os órgãos internos começando pelo coração e trabalhando ao longo da coluna em direção à cauda para desprender todos os órgãos internos em um bloco. Use pinças para separar a rede intestinal da cloaca e transferir os órgãos para um tubo de homogeneização de 1,5 mililitro contendo meia dúzia de contas cerâmicos de 2,8 milímetros. Coloque imediatamente o tubo em gelo seco para congelar a amostra.Armazene a amostra a 80 graus Celsius negativo até ficar pronto para homogeneizar. Após extrair o DNA e o RNA, meça as cargas micobacterianas por PCR quantitativo, conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, os zebrafish adultos são infectados com M.marinum por uma injeção intraperitoneal.Uma alta dose de infecção é vista para levar a uma doença progressiva na qual a carga micobacteriana continua a aumentar até que a carga média atinja cerca de cinco milhões de bactérias, matando o peixe. Uma dose baixa, por outro lado, leva ao desenvolvimento de um espectro de doença semelhante ao observado na tuberculose humana com infecções progressivas, latentes, reativadas e esterilizadas. Neste caso, a carga continua aumentando por quatro semanas após a qual a doença atinge um estado estável na maioria dos peixes.Esses dados revelam que o número inicial de micobactérias usadas para infectar o peixe é um determinante crítico para o resultado da infecção. Os zebrafish mutantes de trapos são vistos como incapazes de limitar suficientemente o crescimento das micobactérias levando a cargas bacterianas mais altas e maior morbidade. Isso demonstra claramente a importância da imunidade adaptativa no controle da infecção micobacteriana.Os níveis de interleucina-4 são significativamente mais elevados no grupo do tipo selvagem revelando que a resposta adaptativa é necessária para a introdução eficiente da interleucina-4, mas dispensável para a introdução de interferon gama após infecção micobacteriana. Este protocolo permite a coleta de DNA e RNA da mesma amostra, o que torna possível combinar a carga micobacteriana da amostra com dados de expressão genética tanto do hospedeiro quanto da bactéria. Esta técnica pode ser combinada com a administração de medicamentos ou candidatos à vacina para avaliar seu efeito sobre as cargas micobacterianas e respostas imunológicas.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de seguir as diretrizes locais para segurança pessoal e descarte de resíduos ao trabalhar com um patógeno de nível dois de biossegurança. Essa técnica permite estudar tuberculose ativa e latente com micobactérias dormentes no zebrafish, que é um modelo in vivo ético não-mamífero.

modeling-tuberculosis-mycobacterium-marinum-infected-adult

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Embriões do zebrafish transparente provaram anfitriões modelo útil para visualizar e interações de estudo funcional entre as células imunes inatas e patógenos bacterianos intracelulares, tais...

A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

Fonte: Niu, L., et al. Visualização da morte celular lítica de macrófagos durante infecção por micobactérias em embriões de peixe-zebra via microscopia intravital. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o uso da microscopia confocal intravital para visualizar a morte celular lítica de macrófagos em embriões de peixe-zebra após infecção por Mycobacterium marinum .

Imagens ao vivo da morte celular de macrófagos durante infecção por micobactérias em embriões de peixe-zebra

Fonte: Bernut, A., et al. Decifração e Imagem da Patogênese e Cordamento do Mycobacterium abscessus em embriões de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra um protocolo que utiliza embriões transgênicos de peixe-zebra expressando macrófagos fluorescentes e infectados com a cepa áspera fluorescente Mycobacterium abscessus para visualizar as interações hospedeiro-patógeno. Ele revela como o cordão extracelular possibilita a evasão imunológica, promovendo a sobrevivência bacteriana e...

Imagens ao vivo das interações hospedeiro-patógeno em embriões de peixe-zebra infectados com Mycobacterium abscessus

Fonte: Luukinen, H., et al. Modelagem da tuberculose em peixes-zebra adultos infectados por Mycobacterium marinum .  J. Vis. Exp. (2018).

Avaliação do papel da imunidade do hospedeiro na infecção por micobactérias usando um modelo de peixe-zebra

Fonte: Flores, E., et al. Utilizando o protozoário Paramecium caudatum como veículo para infecções alimentares em larvas de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o método de estabelecer um modelo de infecção intestinal bacteriana transmitida por alimentos em larvas de peixe-zebra, alimentando-as com paramecia infectada com E. coli fluorescente.

Modelagem de Infecção Intestinal em Larvas de Peixe-Zebra usando Bactérias Transmitidas por Alimentos

Este artigo descreve o vídeo elevado rendimento oleoduto que tenha sido estabelecida com sucesso para infectar e analisar um grande número de embriões de peixes-zebra proporcionando uma nova ferramenta poderosa para o teste e composto de descoberta de medicamentos usando um animal vertebrado organismo inteiro.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

In vivo interações espaço-temporais de patógenos e defesas imunes no nível da mucosa não são facilmente visualizadas em hospedeiros vertebrados existentes. O método aqui apresentado descreve uma plataforma versátil para estudar a candidíase mucosa em vertebrados vivos usando a bexiga natatória do peixe-zebra juvenil como local de infecção.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Embriões de peixe-zebra opticamente transparentes são amplamente utilizados para estudar e visualizar em tempo real as interações entre microrganismos patogênicos e as células imunes inatas. A microinjeção de Mycobacterium abscessus, combinada com imagens de fluorescência, é usada para examinar características patogênicas essenciais, como a formação de cordão em embriões de peixe-zebra.

Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish

Aqui descrevemos um protocolo para a imunização do adulto peixe-zebra (Danio rerio) com uma vacina baseada em DNA e demonstrar a validação de um evento de sucesso da vacinação. Este método é adequado para o rastreio pré-clínico de candidatos vacinais em vários modelos de infecção.

Imunização do adulto Zebrafish para o rastreio pré-clínica de vacinas baseadas em DNA

Este protocolo descreve uma técnica para visualizar o comportamento do macrófago e a morte no zebrafish embrionário durante a infecção do marinum de Mycobacterium. Etapas para a preparação de bactérias, infecção dos embriões e microscopia intravital estão incluídas. Esta técnica pode ser aplicada à observação do comportamento celular e da morte em cenários semelhantes envolvendo infecção ou inflamação estéril.

Visualização da morte de células ticas de macrófago durante infecção micobacteriana em embriões de zebrafish via microscopia intravital

Atualmente, faltam modelos in vivo passíveis de triagem de medicamentos contra infecções bacterianas crônicas. Aqui, descrevemos um protocolo para infecção de ferida por um isolado clínico de Pseudomonas aeruginosa para gerar uma infecção persistente em larvas de peixe-zebra.

Modelagem de infecção persistente por Pseudomonas aeruginosa em larvas de peixe-zebra feridas

Aprenda a modelar tuberculose em zebrafish adultos infectados com Mycobacterium marinum. Este método permite quantificar cargas bacterianas e respostas imunes simultaneamente através de qPCR.

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

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