Name: Implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprenda a implantar uma janela de vidro na medula espinhal de camundongos para microscopia intravital. Este método permite visualizar dinâmicas proteicas in vivo no sistema nervoso central intacto, auxiliando pesquisas em neurociência e imunologia.

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S.E. Lutz é apoiado pelo centro nacional para o avanço das Ciências translacionais, institutos nacionais de saúde, Grant KL2TR002002 e da Universidade de Illinois Chicago College of Medicine start-up fundos. Simon Alford é apoiado por RO1 MH084874. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais da NIH. Os autores agradecem Dritan Agalliu no departamento de Neurologia do centro médico da Universidade de Columbia para o TG eGFP: Claudin-5 camundongos, discussões científicas, e insights sobre o desenvolvimento do protocolo cirúrgico e aplicações de imagem. Os autores agradecem a Sunil P. Gandhi no departamento de neurobiologia e comportamento da Universidade da Califórnia, Irvine para projetar o primeiro protótipo do aparelho estereotáxica e controlador de temperatura animal, discussão do protocolo cirúrgico, e formação em microscopia de dois fótons. Os autores também agradecem Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) para o auxílio na personalização do estereomicroscópio cirúrgico, e Ron Lipinski (Whale Manufacturing) para usinagem de peças estereotáticas.

Todos os experimentos seguem a Universidade de Illinois, Chicago institucional cuidados com animais e protocolos de uso do Comitê. Este é um procedimento terminal.
1. preparação do reagente
<ol><li>Prepare o fluido espinhal cerebral artificial (aCSF) para conter 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de glicose, 10 mM de HEPES, 2 mM MgCl2· 6h2o, 2 mm CAcl2· 2h2o em DDH2o. filtro estéril e congelamento em alíquotas de uso individual. ACSF morno em um banho de água a 39 ° c antes de usar.</li>
	<li>Agarose de ponto de fusão baixa quente (2%) em aCSF até dissolver-se inteiramente em um banho de água ajustado a 65 ° c. Durante o laminectomy, esfrie a alíquota derretida do agarose a 39 ° c em um banho de água, de modo que possa pronto em perto da temperatura fisiológica para a etapa 5,2. Nota: a solução de agarose pode ser armazenada a-20 ° c em alíquotas de uso único.</li>
	<li>Prepare estéril 50 mg/mL de carprofeno em água bacteriostática. Conservar a 4 ° c.</li>
	<li>Limpe os óculos de proteção com 70% de etanol, três lavas de ddH2O e guarde-O em um recipiente sem poeira.</li>
</ol>2. backplate impressão 3D
<ol><li>Use o software CAD 3D é usado para criar um modelo para as dimensões mostradas na Figura 1. O interior é uma elipse mais larga na superfície inferior com relação à impressora e cortada com um corte elevado a uma elipse menor formando um lúmen na superfície oposta. Dois braços de projeção com furos para aceitar os parafusos estendem lateralmente, para o acessório à forquilha da terra arrendada da placa traseira. A partir desta estrutura 3D, crie um arquivo de malha 3D triangulado (. STL arquivo). Nota: consulte a Figura 1b\u2012D e os arquivos complementares 1 e 2.</li>
	<li>Carregue o arquivo de malha 3D triangulado em uma impressora 3D.</li>
	<li>Imprima placas traseiras usando um bocal de extremidade quente de 0,4 mm e uma altura de camada de 0,2 mm. Selecione a temperatura do bocal de 205 ° c, temperatura da cama de 45 ° c, e velocidade de impressão de 45 milímetros/s.</li>
	<li>Avalie os backplates impressos 3D resultantes visualmente para a integridade estrutural (Figura 1e); falha estrutural bruta (lúmen ausente, parede colapsado) indica defeitos de impressão (Figura 1F).</li>
</ol>3. Preparação cirúrgica
<ol><li>Pré-aqueça a almofada de aquecimento.</li>
	<li>Coloque o isoflurano na seringa de parto enquanto trabalha em uma capa de fumaça química. Prenda a seringa de entrega à unidade de isoflurano.</li>
	<li>Selecione um mouse 8 \ u201212-week-old. Pesar o animal. Induzir anestesia utilizando isoflurano a 2% em câmara de indução. Injetar carprofeno a 5 mg/kg por via subcutânea.</li>
	<li>Posicionar o nariz-cone e entregar isoflurano a 2% com vazão de 150 mL/min para manutenção de um plano cirúrgico de anestesia (Figura 2a\u2012e). Enrole a almofada de aquecimento com uma almofada absorvente descartável para a facilidade da limpeza.</li>
	<li>Posicione um animal na almofada de aquecimento na estação cirúrgica e instale o cone do nariz. Lubrificar o termómetro com vaselina e inseri-lo 5 mm no recto. Tape a sonda termômetro para a cauda para a estabilidade. Aplique pomada oftálmico aos olhos do rato.</li>
	<li>Para manter a hidratação, aplique 200 μL de solução de Ringer Ringer por injeção subcutânea a cada 30 min até a terminação do experimento.</li>
	<li>Pulverize o dorso com 70% de etanol, retire a pele com Clippers, e limpe o local com povidona-iodo.</li>
</ol>4. laminectomia
<ol><li>Posicione o animal entre as barras de orelha; estes mantêm a posição da cabeça do rato com respeito ao nariz-cone.</li>
	<li>Confirme que o animal está profundamente anestesiado como avaliado pela falta de reflexo interdigital de pinça e padrão respiratório constante.</li>
	<li>Faça uma incisão rostral-caudal de 1,5 cm na linha média sobre a região lombar torácica/superior, utilizando #11 lâmina (Figura 2). Separe a pele agarrando-a com o fórceps dentado sem corte e/ou os dedos gloved. Use o fórceps para separar e descascar para trás todo o tecido conjuntivo transparente restante abaixo da pele. A musculatura superficial deve agora ser exposta; deslocar isto com uma lança cirúrgica de espuma.</li>
	<li>Use as lanças cirúrgicas da espuma (ou um cutrette) para cancelar afastado o musculatura restante, mais profundo da vértebra do alvo (torácico 12). Para criar um assento para o backplate, também limpe afastado o músculo do aspecto do posterior de torácico 11, e o aspecto anterior do torácico 13. Controle toda a hemorragia aplicando a pressão delicada com uma lança cirúrgica ou use um pulso mínimo com uma arma cauttery. Continue a remover o músculo remanescente longe dos tendões usando fórceps</li>
	<li>Uma vez que os músculos são removidos, Retire cuidadosamente os tendões cortando com fórceps. Deve haver uma abundância do espaço para visualizar e manipular o cabo quando esta etapa é completa. Verifique se a dura-máter do espaço intervertebral, o osso laminar semitransparente, o vaso sanguíneo superficial central embaixo do osso e a artéria irradiante anterior são agora claramente visíveis.</li>
	<li>Molhe a região com aCSF quente. Use a microbroca para repetitivamente diluir o osso laminar usando traços retos paralelos ao longo eixo da medula espinhal (Figura 2, Figura 3). Se desejado, utilize um estágio de deslizamento para girar a plataforma cirúrgica para o conforto ergonómico realçado (por exemplo, um operador destro pode girar a plataforma cirúrgica no sentido anti-horário para a etapa da perfuração). Nota: o estágio de deslizamento usado é construído de uma placa de alumínio superior que deslize ± 15 milímetros com respeito à placa baixa fixa.</li>
	<li>Agarre delicadamente o processo espinhoso superficial com fórceps e levante a vértebra; o osso deve levantar afastado facilmente. Se houver resistência, repita o desbaste do osso com a broca e, se necessário, use a tesoura de íris, tendo o cuidado de apontar as pontas de tesoura para cima para evitar danificar o tecido. Nota: a fim de manter a dura intacta, é essencial não puxar o osso.</li>
	<li>Use #4 pinça para limpar qualquer estilhaços de osso. Use uma lança cirúrgica para aplicar a pressão constante suave para controlar qualquer sangramento. Enxágüe o tecido com aCSF morno. Não deixe o tecido secar.</li>
</ol>5. implante de vidro de cobertura
<ol><li>Aplique delicadamente uma tampa-vidro do borosilicato de 3 milímetros ao cabo exposto.</li>
	<li>Assegure-se de que o agarose esfrie 39 ° c. Usando uma espátula pequena, aplique o agarose/aCSF morno de 2% à borda da tampa-vidro e permita que a ação capilar a desenhe a superfície. Nota: em temperaturas abaixo de 39 ° c, o agarose pode começar a gel. Se isso ocorrer, Reaqueça usando um banho de água ou microondas. Alguns operadores preferem primeiro aplicar uma gota de agarose e colocar a tampa de vidro em cima.</li>
	<li>Aplique o adesivo do tecido aos processos articulados ósseos expostos da vértebra adjacente intata na espinha vertebral do nível torácico 11 e na espinha vertebral do nível torácico 13. Aplique o adesivo adicional do tecido em um anel em torno do local do laminectomy, sobre o tendão adjacente e o processo transversal. Nota: o adesivo do tecido é exigido para a aderência apropriada do cimento dental nas etapas subseqüentes. Os processos articulares formam um assento natural no qual a placa traseira pode descansar estavelmente (Figura 3). A adesão aos processos articulares formarão os pontos mais fortes do apego.</li>
	<li>Misture o cimento dental com o acelerante em uma bandeja de mistura da porcelana. Utilize uma espátula pequena para transferir o cimento dental na camada adesiva do tecido. Use o cimento dental para aderir o backplate ao campo cirúrgico, centrado sobre a janela. Aguarde 10 minutos para o cimento dental para curar. Nota: a aderência firme da placa traseira aos processos articulares anteriores e posteriores proporciona a estabilidade estrutural fundamental do implante.</li>
	<li>Use o cimento dental adicional para encher a base interior da placa traseira, e a parte inferior da placa traseira: relação do tecido. Nota: a aplicação extra do cimento dental melhora a aderência e reduz o risco de vazamento de fluido de imersão objetiva microscópio (soro fisiológico) para fora do fundo da placa traseira.</li>
	<li>Avance o suporte da placa traseira bifurcada para a posição apropriada sobre a janela. Fixe o backplate no suporte do backplate com parafusos. Nota: Este protocolo utilizou um suporte de backplate feito à máquina (Figura 2G\u2012H).</li>
	<li>Aplique soro fisiológico na placa traseira para testar o vazamento. Se qualquer vazamento de fluido, secar a área e aplicar mais cimento dental.</li>
</ol>6. preparação de imagens
<ol><li>Transfira o animal na plataforma cirúrgica para a mesa óptica. Nota: nossa plataforma cirúrgica, suporte do backplate, e o suporte do nariz-cone do isoflurano podem ser transportados entre estações cirúrgicas e do dois-fotão da imagem latente como uma unidade, ao aplicar a anestesia contínua do isoflurano (Figura 2D,H). As unidades similares podem ser montadas das forquilhas, dos feixes, e dos bornes de suporte da coluna que são obtidas das fontes comerciais (por exemplo ThorLabs). Para microscopia intravital, deve haver pelo menos 11 polegadas de folga entre o objetivo do microscópio e a tabela óptica para acomodar a altura da plataforma cirúrgica.</li>
	<li>Afixe a plataforma cirúrgica à tabela ótica usando um borne de montagem do aço inoxidável e uma forquilha de aperto rebaixada.</li>
	<li>Aplique salina fresca no poço da placa traseira. Abaixe uma lente da água-imersão no poço.</li>
	<li>Use luz transmitida ou epifluorescência para identificar a área de interesse e foco. Mude para o modo de digitalização a laser e realize imagens in vivo de acordo com o comprimento de onda de excitação a laser de dois fótons adequado, dicrónicos e filtros de bandpass para os fluoróforos presentes no tecido6.</li>
</ol>

<ol><li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li>
<li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826(2013).</li>
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<li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-0381-8_2">Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue</a>. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
<li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li>
<li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li>
<li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li>
<li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito aqui permite a imagem latente estável da medula espinal nos ratos através de uma janela de vidro. Este método foi aplicado para avaliar o remodelamento de BBB no EGFP transgênicas: Claudin5 +/-camundongos que expressam uma proteína de junção apertada fluorescente de BBB, mas poderia ser aplicada ingualmente bem para estudos de todas as proteínas ou pilhas fluorescentes na medula espinal.
Os métodos múltiplos para a estabilização do laminectomy e da medula espinal foram desenv...

Modelos animais transgênicos expressando proteínas fluorescentes, quando combinados com microscopia intravital, proporcionam uma plataforma poderosa para abordar a biologia e a fisiopatologia. Para aplicar estas técnicas à medula espinal, os protocolos especializados são exigidos para preparar a medula espinal para a imagem latente. Uma tal estratégia é conduzir um implante da janela do laminectomy e da medula espinal. As características chaves de um protocolo ideal do laminectomy para a microscopia incluem a preservação da estrutura e da função nativas do tecido, a estabilidade do campo da imagem latente, o tempo de processamento rápido, e a reprodutibilidade dos resultados. Um desafio particular é estabilizar o campo de imagem contra o movimento induzido pela respiração e batimento cardíaco. Várias estratégias ex vivo e in vivo têm sido relatadas para atingir esses objetivos1,2,3,4,5. A maioria dos métodos in vivo envolve o aperto dos lados dacoluna vertebral2,4e é freqüentemente seguido pelaimplantação de um aparelho metálico rígido3,4para estabilidade durante a cirurgia e aplicações de imagem a jusante. Apertar a coluna vertebral pode potencialmente comprometer o fluxo sanguíneo e induzir a remodelação da proteína da barreira hematoencefálica (BBB).
A finalidade deste método é fazer a medula espinal intacta disponível para a imagem latente ótica no rato vivo ao minimizar a invasividade do protocolo e de melhorar resultados. Nós descrevemos um único procedimento do implante do laminectomy e da tampa-vidro emparelhado com um backplate 3D-impresso plástico oval minimamente invasor que ainda consiga a estabilidade mecânica robusta. A placa traseira é diretamente aderida às espinhas vertebrais anterior e posterior com cimento dentário. O backplate é equipado com os braços laterais da extensão com os furos do parafuso que fixam rigidamente ao estágio do microscópio através de um braço do metal. Isto Ancora eficazmente a vértebra anterior e posterior intacta ao estágio do microscópio, fornecendo a resistência mecânica ao artefato do movimento que seria introduzido de outra maneira pela respiração e pelo batimento cardíaco. O método foi otimizado para laminectomia de uma única vértebra no nível torácico 12, omitindo as braçadeiras utilizadas em estratégias alternativas de estabilidade durante a imagiologia in vivo . O procedimento é rápido, levando aproximadamente 30 min por mouse.
Este protocolo pode ser usado para estudar os mecanismos da doença do BBB. O BBB é um sistema microvascular dinâmico composto por células endoteliais, músculo liso vascular, pericytes e processos de pé astrocícito que proporcionam um ambiente altamente seletivo para o sistema nervoso central (SNC). Os dados representativos descrevem a aplicação deste protocolo em camundongos transgênicos projetados para expressar proteína verde fluorescente reforçada (eGFP): Claudin-5, uma proteína de junção apertada BBB. Os arquivos de impressão de backplate fornecidos também podem ser personalizados para aplicativos alternativos.

<table><tbody><tr><td>Impressora 3D</td><td>Raise3D</td><td>Pro2</td><td>Para impressão de placas traseiras</td></tr><tr><td>PLA Filamento de impressão 3D</td><td>Inland</td><td>PLA+-175-B</td><td>Material de impressão 3D de plástico preto</td></tr><tr><td>Software CAD 3D</td><td>Software Dassault Systemes</td><td>Solidworks usado</td><td>para projetar formas 3D</td></tr><tr><td>Software de impressora 3D</td><td>Software Raise3D</td><td>Ideamaker</td><td>software usado para interface com a impressora 3D</td></tr><tr><td>Placa traseira oval impressa em 3D</td><td>personalizada</td><td></td><td>Campo de imagem</td></tr><tr><td>estabilizadora Microscópio de dissecação cirúrgica</td><td>Leica</td><td>M205 C</td><td>Equipado com Leica FusionOptics, objetiva Planapo 0.63x M-series e platina deslizante</td></tr><tr><td>Câmera de microscópio</td><td>Leica</td><td>MC170</td><td>Câmera colorida HD para visualização do campo cirúrgico</td></tr><tr><td>Platina deslizante</td><td>Leica</td><td>10446301</td><td>O estágio deslizante é construído com duas placas de metal. A placa de base é fixa. A placa superior desliza na interface lubrificada para permitir o movimento rotacional e linear.</td></tr><tr><td>Estação cirúrgica e garfo de estabilização</td><td>Whale Manufactoring</td><td>personalizado</td><td>Laminectomia</td></tr><tr><td>SomnoSuite unidade de entrega de isoflurano de baixo fluxo</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>Administração de anestesia cirúrgica com vaporizador digital integrado</td></tr><tr><td>Poste de montagem em aço inoxidável de 1,5 polegadas</td><td>ThorLabs</td><td>P50/M</td><td>Para montagem de estação cirúrgica em mesa óptica para imagem de</td></tr> <tr><td>dois fótonsGarfo de Fixação Rebaixado para Poste de Montagem de 1,5"</td><td>ThorLabs</td><td>PF175</td><td>Para estabilizar a montagem da estação cirúrgica em mesa óptica para imagem de dois fótons</td></tr><tr><td>Microdrill óssea ideal</td><td>Aparelho Harvard</td><td>72-6065</td><td>Osso de desbaste para laminectomia</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td>Aquecedor de solução salina</td></tr><tr><td>Pistola de cauterização</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>Cauterização menor sangra</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Benchmark</td><td>BF11222</td><td>1,9" x 4,5" aquecedor de silicone com 20" Cabos de teflon, 10W, 5V</td></tr><tr><td>K tipo sonda retal termoacoplada</td><td>Physitemp</td><td>RET3</td><td>Medição da temperatura corporal do rato</td></tr><tr><td>vaselina</td><td>Sigma</td><td>8009-03-8</td><td>Sonda retal lubrificante</td></tr><tr><td>Controlador térmico regulado por feedback</td><td>personalizado</td><td>NA</td><td>As alternativas comercialmente disponíveis incluem a série Physitemp TCAT</td></tr><tr><td>PVA Lanças oculares cirúrgicas</td><td>Castor-visitec international</td><td>40400-8</td><td>Aparador elétrico de sangue absorvente</td></tr><tr><td></td><td>Wahl</td><td>41590-0438</td><td>Aparador de pele de rato</td></tr><tr><td>, # 11</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>Fórceps de ferramenta cirúrgica</td></tr><tr><td>, # 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>Fórceps de ferramenta cirúrgica</td></tr><tr><td>, # 4</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>Ferramenta cirúrgica</td></tr><tr><td>Pinça dentada de titatnium</td><td>WPI</td><td>555047FT</td><td>Ferramenta cirúrgica</td></tr><tr><td>Tesoura de íris de titânio</td><td>WPI</td><td>555562S</td><td>Ferramenta cirúrgica</td></tr><tr><td>Adesivo de tecido Vetbond</td><td>3M</td><td>084-1469SB</td><td>Preparando a superfície do tecido para acrílico dental</td></tr><tr><td>Bandeja de mistura de cerâmica</td><td>Jack Richeson</td><td>420716</td><td>Mistura de agente acrílico dental com acelerador</td></tr><tr><td>Orthojet acrílico dental</td><td>Lang Dental</td><td>1520BLK, 1503BLK</td><td>Placa traseira de ligação permanente ao tecido</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura redondo pequeno, espessura #1, 3 mm</td><td>Janela óptica do aparelho Harvard</td><td>64-0720</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td>Para aCSF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7447-40-7</td><td>Para aCSF</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-99-7</td><td>Para aCSF</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Para aCSF</td></tr><tr><td>MgCl2& ponto médio; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td>Para aCSF</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>Para aCSF</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Rimadyl</td><td>QM01AE91</td><td>Analgesia</td></tr><tr><td>Água bacteriostática</td><td>Henry Schein</td><td>2587428</td><td>Diluente para carprofeno</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Solução de ringer lactato</td><td>Baxter</td><td>0338-0117-04</td><td>Hidratação para o rato</td></tr><tr><td>Agarose High EEO</td><td>Sigma</td><td>A9793</td><td>gel ponto 34-37 graus C</td></tr><tr><td>Pomada lubrificante oftálmica</td><td>Akwa Tears</td><td>68788-0697</td><td>Evitar a secagem da córnea</td></tr><tr><td>MOM Dois-Fóton microscópio</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Este protocolo descreve um método para o laminectomy da medula espinal e a implantação da janela de vidro para in vivo Imaging da medula espinal do rato. Um vaporizador digital integrado é utilizado para alcançar um plano estável de anestesia a uma taxa de baixo fluxo de isoflurano. Uma única espinha vertebral é removida, e um tampa-vidro comercialmente disponível é sobreposto em uma cama fina do agarose. Um backplate plástico 3D-Printed é afixado então às espinhas vertebrais adjacentes usando o adesivo do tecido e o cimento dental. Uma plataforma de estabilização é usada para reduzir o artefato de movimento da respiração e do batimento cardíaco. Este método rápido e braçadeira-livre é poço-serido para a microscopia de fluorescência aguda do multi-fóton. Os dados representativos são incluídos para uma aplicação desta técnica à microscopia do dois-fotão da vasculatura da medula espinal em ratos transgênicas que expressam EGFP: Claudin-5 — uma proteína apertada da junção.

As janelas de vidro implantadas e a microscopia intravital do dois-fotão fornecem uma ferramenta útil para avaliar mudanças dinâmicas em proteínas do CNS. A integridade funcional do BBB é influenciada pela expressão, localização subcelular e taxas de rotatividade de proteínas de junção apertadas7. Estudos prévios demonstraram que as proteínas de junção apertada passam por remodelações rápidas e dinâmicas no estado estacionário8. O laminectom...

Este protocolo descreve a implantação de uma janela de vidro na medula espinal de um rato para facilitar o visualização pela microscopia intravital.

Implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Este método permite o exame da dinâmica proteica in vivo dentro do sistema nervoso central intacto para abordar questões em neurociência e imunologia. As principais vantagens deste procedimento são uma excelente estabilidade de movimento para aquisição de imagens, breve tempo cirúrgico, redução da exposição do operador à anestesia gasosa e backplates personalizáveis baratos. A demonstração visual deste método é fundamental, pois é difícil remover o osso sem danificar o tecido do sistema nervoso intimamente subjacente durante as etapas de laminectomia do procedimento.Antes de iniciar o procedimento, use um software de design auxiliado por computador 3D para criar um modelo para as dimensões indicadas. Então temos um objeto, que é o objeto tridimensional, que é com isso que podemos começar. O que posso fazer então é colocar configurações sobre isso para a versão de impressão.Então, se eu abrir Editar isso, entrar no Advanced, abrir uma janela que me permita olhar para todas essas configurações. Defina a temperatura do bocal para 205 graus Celsius, a temperatura do leito para 45 graus Celsius e a velocidade de impressão para 45 milímetros por segundo em uma impressora 3D. Use um bocal de ent quente de 0,4 milímetros e uma altura de camada de 0,2 milímetros para imprimir as placas traseiras.Em seguida, avalie as placas traseiras impressas visualmente para sua integridade estrutural. Falhas estruturais brutas indicam defeitos de impressão. Quando as placas traseiras estiverem prontas, coloque a cabeça de um rato anestesiado de oito a 12 semanas em uma almofada de calor entre as barras de ouvido de um auxiliar cirúrgico e aplique pomada nos olhos do animal.Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, use uma lâmina número 11 para fazer um rostral de 1,5 centímetros para caudal incisão midline sobre a região lombar superior torácica inferior e separar a pele do peritônio. Use fórceps para descascar qualquer tecido conjuntivo transparente restante sob a pele para expor a musculatura superficial. Deslocar os músculos com uma lança cirúrgica de espuma junto com o músculo mais profundo restante da vértebra alvo.Para criar um assento para a placa traseira, limpe o músculo do aspecto posterior da torácica 11 e o aspecto anterior da torácica 13. Usando fórceps para remover o músculo restante dos tendões, conforme necessário. Quando todo o músculo tiver sido removido, corte cuidadosamente os tendões com fórceps até que seja alcançado espaço suficiente para visualizar e manipular a medula espinhal.Confirme que a dura-luz do espaço intervertebral, o osso laminar semitransparente, o vaso sanguíneo superficial central sob o osso, e a artéria radiadora anterior são claramente visíveis. Molhe a região com fluido espinhal cerebral artificial quente e use uma microfuradeira para afinar o osso laminar usando traços retos paralelos ao longo eixo da medula espinhal. Agarrando suavemente o processo superficial de espimoss com fórceps, levante a vértebra.O osso deve levantar facilmente. Use fórceps número quatro para limpar quaisquer fragmentos ósseos, controlando qualquer sangramento com uma lança cirúrgica e pressão suave e constante, conforme necessário. Em seguida, enxágue o tecido com fluido espinhal cerebral cerebral quente.Para implantação de vidro de cobertura, aplique delicadamente um copo de tampa de borossilicato de três milímetros no cabo exposto. Use uma pequena espátula para aplicar 39 graus Celsius aquecido 2% à borda do vidro e permitir que a ação capilar desenhe a agarose sob a superfície de vidro de cobertura. Aplique adesivo tecidual aos processos articular ósseo exposto da vértebra adjacente intacta no nível torácico 11 e 13 colunas vertebrais.Aplique adesivo de tecido adicional em um anel ao redor do local da laminectomia sobre o tendão adjacente e o processo transversal. Em seguida, use uma nova espátula para aplicar cimento dental misturado com acelerador na camada adesiva do tecido e coloque uma placa traseira no campo cirúrgico centrada sobre a janela de vidro da tampa. Aplicar várias camadas finas de cimento dental resulta em uma adesão mais forte da placa traseira, mas certifique-se de colocar a placa traseira rapidamente antes que o cimento dentário comece a secar.Depois de permitir que o cimento dental cure por 10 minutos, preencha a base interna e a parte inferior do fundo com adesivo adicional. A aplicação do cimento dental em camadas finas pode ajudar a reduzir o risco de o cimento se espalhar para o vidro da tampa e agarose, o que pode comprometer todo o protocolo. Quando o cimento dentário secar, aplique um suporte de placa de trás bifurcado na posição apropriada sobre a janela e enrosque a placa traseira no suporte da placa traseira.Em seguida, aplique soro fisiológico na placa traseira para testar o vazamento. O animal e a plataforma cirúrgica podem então ser transferidos para a tabela óptica de um microscópio de dois fótons para imagem através da janela de vidro da tampa. Neste experimento representativo, o EGFP positivo claudin-5 foi visualizado dentro das junções apertadas fluorescentes rotuladas ao longo de um plexo vascular.O delineamento claro das estruturas de junção apertadas na projeção Z indica que o deslocamento mínimo da imagem XY é produzido após uma laminectomia bem sucedida, colocação da janela e implantação da placa traseira. Ao tentar este procedimento é importante lembrar que esta microcirurgia é difícil e pode levar tempo para dominar. No entanto, uma vez dominada, esta cirurgia pode ser realizada em aproximadamente 30 minutos.Após esse procedimento, outros métodos, como duas microscopia de fótons e imagem in vivo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre remodelagem neurovascular e outros processos da doença envolvendo a medula espinhal.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um protocolo minimamente invasiva para estabilizar a coluna vertebral do mouse e executar...

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

O transplante de células-tronco do mouse neural (NSCs) na medula espinhal de ratos com desmielinização estabelecida é detalhado. A preparação de NSCs, a laminectomia de vértebra torácica 9 (T9), e transplante de NSCs é descrito juntamente com os cuidados pré e pós-operatório dos ratos.

Transplante de Células-Tronco cirúrgica do rato Neural na medula espinhal de camundongos infectados com o vírus da Hepatite neurotrófico rato

Este vídeo apresenta um procedimento cirúrgico para implantar janela craniana em um modelo de camundongo para acesso óptico estável a diferentes regiões do cérebro.

Implantação de janela de imagem craniana em modelo de camundongo: um procedimento cirúrgico para implantar lamínula à base de vidro para acesso óptico estável a regiões do cérebro murino

Este vídeo demonstra a gravação da atividade neural do cérebro através de uma janela óptica em camundongos transgênicos. Os camundongos expressam uma proteína fluorescente que permite a detecção de atividades neurais. Uma pequena parte do crânio é cuidadosamente removida para instalar uma janela óptica, e o crânio é então coberto com cimento preto para bloquear a luz antes da imagem.

Instalação de janelas ópticas no cérebro de camundongos transgênicos para imagens de atividades neurais

Fonte: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomia e implantação de janela da medula espinhal no camundongo. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a implantação de uma janela da medula espinhal em um camundongo anestesiado para imagens in vivo. O protocolo estabiliza a medula espinhal exposta usando uma lamínula de borossilicato e uma placa traseira impressa em 3D. Este método permite a microscopia de dois fótons de alta resolução para estudar a dinâmica da barreira hematoencefálica e as...

Implantação de janela da medula espinhal em um camundongo para imagens in vivo

Vetores virais permitem a manipulação de genes alvo. Nós demonstramos um método para a expressão de genes condicionais ou ablação da medula espinhal de rato, utilizando a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal, um local proeminente de contacto sináptico entre os aferentes primários e os neurónios de somatossensorial no sistema nervoso central.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Descrevemos um método para implantar e manter janelas de vidro sobre a medula espinhal exposta de camundongos adultos para estudar a encefalomielite autoimune experimental. Essas janelas fornecem acesso óptico crônico à medula espinhal para monitorar a dinâmica celular no nível subcelular em animais vivos usando microscopia de dois fótons.

Implantação de vidro Medular do Windows em camundongos adultos com Experimental Auto-imune Encephalomyelitis

A lesão medular é uma condição traumática que causa grave morbidade e mortalidade elevada. Neste trabalho, descrever em detalhes um modelo contusão de lesão medular em ratos, seguido por um transplante de células-tronco neurais.

Neural Stem Cell Transplantation em Experimental contusão Model of Spinal Cord Injury

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a implantação de uma câmara de imagem óptica crônica sobre a medula espinhal dorsal de um rato vivo. A câmara, procedimento cirúrgico, e imagiologia crônica são revisados ​​e demonstrada.

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal In Vivo Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Este protocolo descreve como criar uma laminectomia precisa para indução de lesão medular do tipo transecção estável no modelo do camundongo, com danos colaterais mínimos para a pesquisa de lesão medular.

Indução da lesão da medula espinhal tipo transssecção completa em camundongos

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo murino reprodutível de glioma medular por meio da injeção de células tumorais no espaço intervertebral, oferecendo uma abordagem mais eficaz e menos invasiva para pesquisa e desenvolvimento terapêutico.

Transplante cirúrgico de células tumorais na medula espinhal de camundongos

Aprenda a implantar uma janela de vidro na medula espinhal de camundongos para microscopia intravital. Este método permite visualizar dinâmicas proteicas in vivo no sistema nervoso central intacto, auxiliando pesquisas em neurociência e imunologia.

Implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse

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