Name: Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda um método in vitro com esferoides tumorais para estudar a invasão do câncer de bexiga em tempo real usando imagem time-lapse. Esta técnica permite avaliar compostos terapêuticos que inibem a invasão.

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Os autores gostaria de agradecer o laboratório do Dr. Howard Crawford (Universidade de Michigan) para suporte técnico e fornecer materiais e equipamentos para este estudo e Alan Kelleher para suporte técnico.
Este trabalho foi financiado por doações da Universidade de Michigan Rogel Cancer Center núcleo Grant CA046592-26S3, CA201335 de NIH K08-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).

1. crescente esferoides de câncer
<ol><li>
Crescimento de linhagens celulares
	<ol>
<li>Células de câncer de bexiga humana cultura sob convencional aderente as condições de cultura de células e mantêm em uma incubadora de 37 ° C, fornecida com 5% de CO2. Manter as células no < confluência de 90%. Nota: meios de cultura utilizados é de Dulbecco modificado mídia essencial mínima (DMEM) contendo 4,5 g/L D-glicose, piruvato de sódio de 110 mg/L, L-glutamina e fornecido com 10% soro bovino fetal (FBS) ao longo do presente protocolo.</li>
		<li>Um dia antes do início do experimento, trypsinize (usando 0,25% Trypsin-EDTA) células, quantificar a concentração de células e distribuir 1 x 106 células em meios de cultura 3 mL em cada poço de uma placa de fixação 6-poços ultra baixo.</li>
		<li>Incube as células em condições de fixação baixo a 37 ° C para ≥16 h. Isto deve permitir um tempo adequado para as células para agregar em esferoides para a maioria das linhas de células de câncer de bexiga. Nota: A formação de esferoides pode ser observada pelo microscópio invertido de campo brilhante. O tamanho ideal e o número de esferoides podem depender de experiências individuais, mas achamos que esferoides com diâmetro de 50 µm a 150 µm são geralmente adequados para a imagem latente de lapso de tempo usando uma lente de objetiva X 20.</li>
		<li>Para incorporar tipos de células adicionais, como fibroblastos ou células imunes para os esferoides, misturar as células desejadas com células cancerosas na proporção desejada (1:1, 01:10, etc.) em um anexo de ultra baixo da placa e incubar a 37 ° C para ≥16 h permitir a formação de mistura de células tipo esferoides.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crescimento de tumores primários Nota: Tumor esferoides também podem ser derivados de tumor de bexiga primário fontes tais como tumores, desenvolvidos a partir de modelos de tumor de bexiga induzida por substância cancerígena8. Por exemplo, tumores de bexiga, gerados a partir de ratos alimentados com N-butil - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamina (BBN), podem ser colhidas e picada em pedaços pequenos (cerca de 0,5 mm3) usando instrumentos cirúrgicos estéreis. Digerido amostras primárias da bexiga humana cânceres também podem ser estudados neste sistema.<ol>
<li>Recolher e lavar os pedaços de tumor de3 0,5 mm em 5 mL gelada fosfato salino (PBS). Centrifugação a 200 x g por 5 min a 4 ° C. Repita essa etapa de lavagem uma vez.</li>
		<li>Recolher pedaços de tumor por centrifugação a 200 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remover o sobrenadante e adicionar 5 mL de DMEM contendo 10% FBS. Transfira a mistura de esferoide/mídia de tumor em uma chapa de fixação 6-poços ultra baixo. Incubar a 37 ° C para ≥16 h antes da incorporação em matriz de colagénio (ver passo 2.3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparar a câmara de cultura 3-d
<ol><li>
Diluir o colágeno tipo 1 (derivado de rabo de rato) em DMEM contendo 10% FBS para fazer uma mistura de 2 mg/mL de acordo com as instruções do fabricante.
	<ol>
<li>Em suma, misture colágeno com quantidade adequada de solução de NaOH N 1 e DMEM pipetando suave baseado as instruções do fabricante para atingir pH fisiológico.</li>
		<li>Depois de misturar colágeno e DMEM, rapidamente revestir os poços do slide câmara (para a maioria dos aplicativos, slides de câmara com um vidro de cobertura número 1.5 é ideal) com a mistura de colágeno-DMEM antes da solidificação (200 µ l/poço). Permitir que o slide de câmara revestido ser estacionária em temperatura ambiente por 15 min. Nota: A composição da matriz baseada em colágeno pode ser modificada com a adição de outros ingredientes, matriz extracelular, como fibronectina ou laminina, de acordo com os fins da experiência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Delicadamente Pipetar 500 µ l de mídia contendo esferoides (ou pedaços de tumor, se é utilizada a amostra do tumor primário) da placa de fixação ultra baixo 6-poços em um tubo de microcentrifugadora vazio 1,5 mL. Espere 2 min para deixar os esferoides resolver para o fundo do tubo.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo. Prepare um outro tubo de colágeno tipo 1 (2 mg/mL) misturado com DMEM contendo 10% FBS e rapidamente adicionar 500 µ l de mistura para os esferoides. Misture suavemente o esferoides e colágeno pipetando lento.</li>
	<li>Adicione 250 µ l de mistura de esferoides/colágeno para um poço de slide de colágeno-pré-revestidas de câmara. Permitir que a matriz de colagénio que contêm esferoides para solidificar completamente (cerca de 30 min a 37 ° C).</li>
	<li>Depois que a matriz de colagénio é solidificado, adicionar 1 mL de DMEM contendo 10% FBS a cada poço (Figura 1B). Incube o slide de câmara em uma incubadora de 37 ° C, fornecido com 5% CO2 até que esteja pronto para a imagem latente.</li>
</ol>3. live Cell Imaging lapso de tempo
<ol><li>Ligue o microscópio confocal, seguindo as instruções do fabricante e certifique-se de que a câmara climática atinge 37 ° C e é fornecida com 5% de CO2. Nota: Nosso microscópio e câmara normalmente requerem 1 h para atingir o equilíbrio do sistema.</li>
	<li>Transferi com cuidado o slide de câmara para o adaptador de slide anexado ao microscópio.</li>
	<li>Localize os esferoides de interesse usando um objectivo de baixa potência (por exemplo, 5 X) e começar a imagem com o objectivo de poder mais elevado (no atual protocolo, 20 objetivo X é usado pela maior parte a imagem de célula viva para sua melhor qualidade de imagem). Nota: Para amostras de tumor primário de bexiga, 5 X e 10 objectivos de X podem ser necessário a fim de cobrir a maior área de imagem. Para a nossa imagem de lapso de tempo, o intervalo de imagem é definido como 30 min e uma pilha de Z é usada para o spheroid todo da imagem. Tipicamente a distância entre Z-fatias é definida como 4 µm para a 20 X objetivo e a distância total do eixo Z é em torno de 200 µm. imagens podem ser obtidas usando DIC e fluorescência se células/tecidos abrigam marcadores de proteína fluorescente.</li>
	<li>Realize imagens de lapso de tempo de 24-72 h. Nota: A duração é determinada pelo tipo de célula e as necessidades do experimento.</li>
</ol>4. preparação do bloco de amostra contendo câncer esferoides para corte de tecido congelado
<ol><li>Cuidadosamente Retire o bloco do gel de colágeno e esferoides de slides a câmara usando pequenas pinças. Coloque o bloco do gel de colágeno em um molde de plástico histologia.</li>
	<li>Lave o gel de colágeno com 1X PBS brevemente e então corrigi-lo com paraformaldeído 4% (PFA) em PBS durante 30 min à temperatura ambiente. Cuidado: PFA é potencial cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado.</li>
	<li>Lave o gel de colágeno com 1,5 mL de 1X PBS num agitador de 15 min. substituir a PBS e repita a etapa anterior de lavar 3x.</li>
	<li>Aplique uma camada fina (cerca de 3 mm) da temperatura de corte ideal (OCT) composta para cobrir o fundo de um novo molde plástico da histologia. Coloque o fixo e gel de colágeno em cima da OCT lavado composto, então cuidadosamente incorporar o gel todo preenchendo o molde com OCT composto, evitando a formação de quaisquer bolhas de ar na OCT.</li>
	<li>Deixe o molde a 4 ° C, durante 1 h.</li>
	<li>Coloque o molde contendo a amostra e OCT composto em um prato de Petri de 100mm flutuando em nitrogênio líquido. Permitir que a amostra congelar completamente.</li>
	<li>Loja do bloco de amostra congelada a-80 ° C para uso futuro.</li>
</ol>5. imunofluorescência Imaging para câncer secionado congelados esferoides
<ol><li>O bloco de amostra congelada no freezer-80 ° C para a câmara de-20 ° C de um criostato de transferência.</li>
	<li>
Execute corte congelado convencional definindo o intervalo de seção de 7 µm. Deixe amostras secionadas anexar para a lâmina de vidro, sem rugas ou preso o ar.
	<ol>
<li>Armazene os slides a-80 ° C antes de realizar a coloração ainda mais. Nota: Intervalos diferentes podem ser usados para atender às necessidades de experimentais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ar seco os slides por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Permeabilize as amostras com PBS contendo 0,5% Triton X-100 por 15 min.</li>
	<li>Lavagem de amostras 3x com PBS por 10 min por lavagem.</li>
	<li>Cercam as amostras no slide com barreiras hidrofóbicos, usando uma caneta de barreira hidrofóbica.</li>
	<li>Trate as amostras com solução de bloqueio (1X PBS contendo 5% albumina de soro bovino (BSA)), por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aplica 40 µ l de solução contendo anticorpos primária (1X PBS contendo 5% BSA com diluição de 1: 100 de anticorpo primário) para cada amostra no slide.</li>
	<li>Incube os slides no anticorpo primário a 37 ° C por 1 h ou na temperatura de quarto durante a noite (o tempo de incubação e condições variam dependendo do anticorpo primário).</li>
	<li>Lavagem de amostras 3x com PBS por 15 min (por lavagem).</li>
	<li>Aplica 40 µ l de solução contendo anticorpos secundária (1X PBS contendo 5% de BSA com diluição de 1: 300 anticorpo secundário) para cada amostra no slide.</li>
	<li>Lavagem de amostras 3x com PBS por 15 min (por lavagem).</li>
	<li>Manche as amostras com solução de Hoechst 33342 (1 µ g/mL, diluído em PBS) à temperatura ambiente por 10 min. Em seguida, lave as amostras com PBS por 5 min.</li>
	<li>Montar as amostras com meio de montagem e cubra-os com o tamanhos adequado de lamínulas. Deixe os slides no escuro à temperatura ambiente por 24 h e em seguida, executar a microscopia confocal.</li>
</ol>

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<li>Goddette, D. W., Frieden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization.+The+mechanism+of+action+of+cytochalasin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).</li>
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</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Aqui descrevemos um modelo de esferoide de tumor em 3D que permite a observação em tempo real da invasão de câncer de bexiga que é crítico para metástase e progressão do câncer. Este sistema é favorável à incorporação de vários componentes do estroma e celulares para permitir que os investigadores melhor recapitular o microambiente do tecido onde ocorre invasão do câncer de bexiga. Esferoides de câncer da bexiga pode ser gerados a partir de várias fontes, tais como linhas de célula (incluindo linhas de células geneticame...

Invasão é um passo fundamental na progressão do câncer, que é necessário para a metástase e está associado a baixa sobrevivência e mau prognóstico em pacientes. Em câncer de bexiga humana, a mais comum malignidade do tracto urinário, o que faz com que cerca de 165.000 mortes por ano em todo o mundo, prognóstico, tratamento e estágio do câncer estão diretamente relacionadas com a presença ou ausência de invasão1. Cerca de 75% dos casos de câncer de bexiga são não-músculo invasivo e são gerenciados com ressecção local. Em contraste, os cânceres de bexiga músculo-invasivos (cerca de 25% dos casos) são tumores agressivos com altas taxas de metástases e são tratados com terapia de multimodalidade agressivo2,3. Portanto, compreender as vias moleculares que desencadeiam a invasão é essencial para melhor caracterizar o risco de progressão invasiva e desenvolver intervenções terapêuticas que podem impedir a progressão invasiva.
Progressão do tumor invasivo ocorre num ambiente complexo tridimensional (3D) e envolve a interação de células de tumor com outras células do tumor, estroma, membrana basal e outros tipos de células, incluindo células do sistema imunológico, fibroblastos, células musculares e vasculares células endoteliais. Permeável ao suporte (por exemplo, Transwell), sistemas de ensaio são comumente empregados para dosar de invasão de células de câncer4, mas esses sistemas são limitados porque não permitem monitoramento microscópico do processo de invasão em tempo real e a recuperação de amostras para análise molecular e ainda mais a coloração é um desafio. Desenvolvimento de um sistema de esferoide de tumor de bexiga em 3D para estudar a invasão é desejável porque permite a incorporação de componentes microenvironmental definidos com a conveniência de sistemas em vitro .
Neste protocolo, descrevemos um sistema para interrogar os processos invasivos de células de câncer de bexiga humana usando um ensaio de invasão de esferoide 3D incorporando as matrizes de gel à base de colagénio e microscopia confocal para permitir que os investigadores monitorar a motilidade celular e invasão em tempo real (Figura 1A). Este sistema é versátil e pode ser modificado para interrogar várias configurações/tumor estromal. Pode incorporar a maioria das linhas de células de câncer de bexiga ou bexiga primário tumores e células estromais adicionais tais como cancro associado fibroblastos e células do sistema imunológico5,6,7. Este protocolo descreve uma matriz composta de colágeno tipo 1, mas pode ser modificado para incorporar outras moléculas como fibronectina, laminina ou outras proteínas de colágeno. Processos invasivos podem ser seguidos por 72 horas ou mais dependendo da capacidade do microscópio e sistema utilizado. Fixação e mancha do tumor incorporado na matriz em 3D, antes, durante e depois da invasão da imunofluorescência permite o interrogatório de proteínas upregulated em células invasoras, assim fornecendo informações cruciais que geralmente ausente ou difícil de reunir usando outros modelos de cultura em 3D. Este sistema também pode ser utilizado para compostos de tela que bloqueiam a invasão e para delinear as vias de sinalização afectadas por tais compostos.

<table><tbody><tr><td>Linhas celulares de câncer de bexiga humano UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura de células DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Costar Conjunto de 6 poços de fixação ultrabaixa&nbsp;</td><td>Microscópio</td> invertido convencional Corning <td>3471</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>491206-0001-000</td><td>Uso geral para cultura de células e verificação de esferoides</td></tr><tr><td>Colágeno tipo 1 de cauda de rato, alta concentração&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Tampa de Vidro com Câmara</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM800</td><td>Um miscóscopo confocal com câmara climática, imagem multi-localização e função de varredura Z-stack&nbsp;</td></tr><tr><td>Micromtoma criostato</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 Software de processamento de imagem&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de Paraformaldeído</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Barreira Hidrofóbica PAP Pen</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>Composto H4000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T&nbsp;</td><td>Solução Thermo Fisher Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ATDC (Trim29) anticorpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA020053</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Citoqueratina 14</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Vimentina</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Meio de montagem</td></tr></tbody></table>

sistema de cultura de células 3d para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Câncer de bexiga é um problema significativo para a saúde. Estima-se que mais de 16.000 pessoas morrerão este ano nos Estados Unidos de câncer de bexiga. Enquanto 75% dos cânceres de bexiga são invasivos e improvável que metastatizam, cerca de 25% de progresso para um padrão de crescimento invasivo. Até metade dos pacientes com câncer invasivo desenvolverá letal recaída metastática. Assim, compreender o mecanismo de progressão invasiva no câncer de bexiga é crucial para prever os resultados dos pacientes e prevenir metástases letais. Neste artigo, apresentamos um modelo de invasão do câncer tridimensional que permite a incorporação de células tumorais e componentes do estroma para imitar na vivo condições ocorrem no microambiente do tumor de bexiga. Este modelo fornece a oportunidade de observar o processo invasivo em tempo real utilizando imagens de lapso de tempo, interrogar as vias moleculares envolvidos usando compostos de imagem e tela de imunofluorescência confocal com o potencial de invasão de bloco. Enquanto este protocolo centra-se em câncer de bexiga, é provável que métodos semelhantes poderiam ser usados para examinar a invasão e a mobilidade, bem como outros tipos de tumor.

Criação bem sucedida de esferoide de tumor de câncer de bexiga invasivo requer a formação de esferoides tumor tamanho de tumores primários ou linhas de célula. Figura 2 A mostra de esferoides apropriadamente dimensionados, desenvolvidos a partir de quatro as linhas da célula humana bexiga câncer (UC9-UM, UM-UC13, UM UC14, 253J e UM UC18). Figura 2 B mostra um esferoide de tumor de um tumor de bex...

Os processos que regem a invasão do câncer de bexiga representam oportunidades para o desenvolvimento de terapêutico e biomarcador. Aqui nós apresentamos um modelo de invasão de câncer de bexiga que incorpora a cultura 3D de esferoides de tumor, imagem latente de lapso de tempo e microscopia confocal. Essa técnica é útil para definir as características do processo invasivo e para a seleção de agentes terapêuticos.

Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

A progressão invasiva é um determinante crucial do desfecho clínico em pacientes com câncer de bexiga. Aqui descreveremos um método in vitro simples, que utiliza esferoides tumorais gerados usando linhagens celulares ou tumores primários para estudar a invasão. A principal vantagem dessa técnica é que somos capazes de monitorar o processo de invasão do câncer em tempo real e também usar a coloração imunofluorescente para interrogar as amostras no final do experimento.Esta técnica pode ser adaptada para incorporar outros tipos de células, como fibroblasto ou células imunológicas. Também pode ser usado para testar compostos que podem ser úteis para bloquear a invasão. Os fatores críticos para o sucesso incluem a otimização da formação de esferóides tumorais e a incorporação no colágeno, o uso de microscopia apropriada com distância de trabalho correta e procedimentos de imunocoloração apropriados.Para começar a gerar esferoides a partir de linhagens celulares, cultive células de câncer de bexiga humana sob condições convencionais de cultura de células de aderência. Um dia antes do experimento, tripsinize as células e distribua 1.000.000 células em três mililitros de meios de cultura de células para cada poço de uma placa de seis poços. Em seguida, incube as células em condições de baixa fixação a 37 graus Celsius por pelo menos 16 horas.Para gerar esferóides de tumores primários, colete e lave pedaços de tumor cúbico de 0,5 milímetro em cinco mililitros de PBS gelado. Centrifugue os pedaços do tumor a 200 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois disso, colete os pedaços do tumor por centrifugação a 200 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, remova o sobrenadante e adicione cinco mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS. Transfira a mistura de meios esferoides tumorais para uma placa de fixação ultrabaixa de seis poços. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por pelo menos 16 horas.Primeiro, dilua o colágeno tipo um em DMEM suplementado com 10% de FBS para fazer uma mistura de dois miligramas por mililitro. Em seguida, cubra rapidamente os poços de uma lâmina de câmara com a mistura. Mantenha a lâmina da câmara estacionária à temperatura ambiente por 15 minutos.Depois disso, pipete suavemente 500 microlitros de meio esferóide da placa de fixação ultrabaixa em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, deixe os esferóides assentarem no fundo do tubo por dois minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo.Em seguida, adicione rapidamente 500 mililitros de mistura de DMEM de colágeno fresco aos esferóides. Pipete para cima e para baixo para misturar suavemente os esferóides e o colágeno. Em seguida, adicione 250 microlitros da mistura de colágeno esferóide aos poços da lâmina da câmara revestida de colágeno.Deixe a matriz de colágeno contendo o esferóide solidificar completamente. Depois que a matriz de colágeno solidificar, adicione um mililitro de DMEM suplementado com FBS a cada poço das lâminas da câmara. Em seguida, incube a lâmina da câmara a 37 graus Celsius com 5% de CO2.Prepare o microscópio confocal de acordo com as instruções do fabricante e certifique-se de que a câmara climática atinja 37 graus Celsius e seja fornecida com 5% de CO2. Em seguida, transfira a lâmina da câmara para o adaptador de lâmina do microscópio. Usando uma objetiva de baixa potência, localize os esferoides de interesse, inicie a geração de imagens com a objetiva de alta potência e execute a imagem de lapso de tempo por 24 a 72 horas.Primeiro, use uma pequena pinça para levantar o bloco de gel de colágeno e esferóides da lâmina da câmara. Em seguida, coloque o bloco de gel de colágeno em um molde de histologia de plástico. Enxágue o bloco de gel de colágeno com 1x PBS brevemente.E fixe-o com 4% PFA e PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, lave o bloco de gel de colágeno com 1,5 mililitros de 1x PBS em uma coqueteleira por 15 minutos. Aplique uma fina camada de composto OTC no fundo de um novo molde de histologia de plástico.Em seguida, coloque o bloco de gel de colágeno fixo e lavado em cima do composto OTC antes de preencher cuidadosamente o restante do molde com o composto OTC. Mantenha o molde a quatro graus Celsius por uma hora. Depois disso, congele rapidamente o molde em uma placa de Petri de 100 milímetros flutuando em nitrogênio líquido e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius.Transfira o bloco de amostra congelado para a câmara de menos 20 graus Celsius de um criostato. Em seguida, execute o corte congelado convencional com um intervalo de seção de sete micrômetros. Depois disso, seque as lâminas ao ar por uma hora em temperatura ambiente.Em seguida, permeabilize as amostras por 15 minutos com PBS contendo 0,5% de Triton X-100. Em seguida, lave as amostras com PBS três vezes por 10 minutos cada. Em seguida, circunde as amostras com uma caneta de barreira hidrofóbica.Trate as amostras com solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, aplique 40 microlitros de solução contendo anticorpo primário em cada amostra. Incube as lâminas por uma hora a 37 graus Celsius.Depois disso, lave a amostra três vezes com PBS por 15 minutos por lavagem. Em seguida, aplique 40 microlitros de solução contendo anticorpos secundários em cada amostra. Em seguida, lave as amostras três vezes com PBS por 15 minutos por lavagem.Manjar a amostra com solução Hoechst 33342 à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, lave as amostras com PBS por cinco minutos. Monte as amostras com meio de montagem e cubra-as com lamínulas.Por fim, deixe as lâminas no escuro em temperatura ambiente por 24 horas antes de realizar a microscopia confocal. Neste protocolo, esferoides tumorais invasivos de câncer de bexiga foram formados a partir de linhagens celulares e tumores primários. O vídeo representativo do lapso de tempo demonstra a invasão esferóide do tumor do câncer de bexiga na matriz de colágeno.O vídeo representativo de lapso de tempo demonstra o comportamento invasivo de esferoides tumorais de câncer de bexiga marcados com GFP sozinhos ou co-cultivados com fibroblastos marcados com RFP. Para demonstrar a viabilidade do uso da coloração imunofluorescente de marcadores proteicos, os esferoides foram fixados, seccionados e corados em 24 ou 72 horas. A visão de maior ampliação dos esferoides UM-UC-14 mostra coloração filamentosa para ataxia telangiectasia proteína associada ao grupo D.As células altamente invasivas disseminadas a partir de esferoides UM-UC-18 após 24 horas de invasão, expressam um alto nível de Vimentina, um marcador de transição epitelial para mesenquimal. Este ensaio é útil para rastreios limitados de inibidores farmacológicos da invasão do cancro da bexiga. A citocalasina D é usada aqui para representar a inibição farmacológica da invasão.Aqui descrevemos um modelo que permite a observação em tempo real da invasão do câncer de bexiga. Este sistema é passível de incorporação de vários componentes estromais e celulares, o que permite aos investigadores recapitular melhor o microambiente tecidual onde ocorre a invasão do câncer de bexiga. Este sistema não apenas fornece uma ferramenta útil para estudar a invasão em ambiente 3D, mas também é adequado para triagem limitada de compostos farmacêuticos que têm potencial para bloquear a invasão de células cancerígenas.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Fluxo de fluido intersticial é elevada em tumores sólidos e pode modular a invasão de células tumorais. Descrevemos aqui uma técnica para aplicar o fluxo de fluido intersticial para as células embebidas numa matriz e, em seguida medir os seus efeitos sobre a invasão celular. Esta técnica pode ser facilmente adaptado para estudar outros sistemas.

Um modelo tridimensional de Cultura Celular para avaliar os efeitos de fluxo de fluido intersticial na invasão da célula tumoral

Este vídeo fornece uma metodologia detalhada para cultivar células de câncer de mama em uma matriz de proteína de membrana basal 3D, exemplificando o potencial da cultura 3D na avaliação da invasão celular no ambiente circundante.

Ensaio de Membrana Basal de Cultura 3D: Cultura de Células Cancerígenas em Matriz de Proteína de Membrana Basal 3D para Estudar a Invasão Celular

Este artigo proporciona metodologias detalhadas para a utilização de ensaios tridimensionais (3D), para quantificar a invasão das células do cancro da mama. Especificamente, vamos discutir os procedimentos necessários para a criação de tais ensaios, quantificação e análise de dados, bem como métodos para analisar a perda da integridade da membrana que ocorre quando as células invadem.

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Este método avalia a invasão de células cancerígenas de esferóides em uma matriz 3D circundante.  Os esferoides são gerados através do método de cultura de gota suspensa e, em seguida, incorporados em uma matriz composta de materiais de membrana basal e colágeno tipo I.  A invasão dos esferóides é posteriormente monitorada.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

As células cancerígenas são incorporadas em um gel de colágeno e, em seguida, ensanduichadas em um gel de fibrina acelular para gerar um sistema de cultura 3D no qual a invasividade e a formação de tumores satélites podem ser monitoradas.

Tridimensional Cultura Ensaio para Explorar Cancer Invasividade celular e formação de tumor Satélite

Este protocolo fornece medidas experimentais detalhadas para estabelecer uma cultura in vitro tridimensional de organoides tumorais da bexiga derivados do câncer de bexiga induzido pelo cancerígeno. Métodos culturais, incluindo passaging, engenharia genética e transplante ortotópico de organoides tumorais são descritos.

Cultura, Manipulação e Transplante Ortotópico de Organoides tumorais da bexiga de camundongo

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Os organoides derivados do paciente (PDOs) são uma ferramenta poderosa na pesquisa de câncer translacional, refletindo tanto a heterogeneidade genética e fenotípica da doença quanto a resposta a terapias anticânculas personalizadas. Aqui, um protocolo consolidado para gerar PDOs de câncer de bexiga primário humano em preparação para a avaliação de análises fenotípicas e respostas medicamentosas é detalhado.

Cultura dos Organoides do Câncer de Bexiga como Ferramentas de Medicina de Precisão

Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

A invasão é um fenômeno biológico importante no desenvolvimento e progressão do câncer. Esse processo é influenciado por células não neoplásicas e componentes do microambiente tumoral. O objetivo deste estudo é descrever um método alternativo para análise da invasão de células tumorais in vitro usando culturas tridimensionais (3D).

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Aprenda um método in vitro com esferoides tumorais para estudar a invasão do câncer de bexiga em tempo real usando imagem time-lapse. Esta técnica permite avaliar compostos terapêuticos que inibem a invasão.

Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga

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