Um método automatizado para determinar o desempenho de Drosophila em resposta às mudanças de temperatura no espaço e no tempo
12 de outubro de 2018
Aqui nós apresentamos um protocolo para determinar automaticamente o desempenho locomotor de Drosophila em mudança de temperaturas usando uma arena programável de temperatura controlada que produz mudanças de temperatura rápidas e precisas no tempo e no espaço.
Este método pode nos ajudar a responder perguntas-chave sobre a resposta das moscas às mudanças de temperatura, como diferenças entre genótipos, a interação com outras pistas sensoriais ou a função de diferentes receptores de temperatura. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite múltiplas mudanças de temperatura rápidas e precisas controlando o tempo e o espaço e de forma automatizada. Comece colocando 20 moscas machos e 20 fêmeas em uma garrafa de criação contendo 45 mililitros de comida de mosca, e colocando a garrafa dentro de uma incubadora de 25 graus celsius sob 12 horas de luz, ciclos escuros de 12 horas.
Após 10 dias, anestesiar as moscas recém-eclosadas em almofadas de dióxido de carbono por um máximo de quatro minutos. E use um pincel para coletar moscas virgens em 2,5 por 9,5 centímetros de moscas criando frascos contendo 6,5 mililitros de alimentos frescos, separados por sexo em grupos de 20 moscas por frasco. Em seguida, devolva os frascos para a incubadora por cinco a sete dias.
Para configurar uma arena controlada pela temperatura, ligue a arena e abra o script de fases de temperatura no computador de controle. Verifique se a sequência de temperatura está devidamente definida e verifique se a duração de cada fase experimental está definida para 60 segundos. Sob a seção de bloco experimental inicial, confirme estas configurações: o número desejado de fases, a configuração iterativa on/off da luz vermelha indicativa que emite diodos, dois graus celsius aumento de temperatura por fase e 16 graus celsius como temperatura inicial.
Em seguida, execute o script de fases de temperatura. O software será inicializado por cinco segundos e depois parará. Para experimentos comportamentais de temperatura, coloque um fio de fita condutiva branca no topo dos azulejos de cobre da arena, garantindo que todas as bordas estejam cobertas.
Coloque um anel de alumínio aquecido ao redor das telhas de cobre e use um tecido limpo para limpar a tampa de vidro. Coloque a tampa na parte superior do anel de alumínio, deixando uma lacuna através da qual uma mosca pode ser soprada e toque um frasco de mosca aclimatado duas vezes para forçar as moscas até o fundo do frasco. Usando um aspirador bucal, aprisione uma mosca e feche o frasco antes de colocá-lo de volta na incubadora.
Exploda a mosca na arena através da abertura entre a tampa de vidro e o anel de alumínio e empurre imediatamente o trevo de vidro para fechar a abertura. Coloque um quadro de luzes ao redor da arena para garantir a iluminação simétrica e comece a gravar com o programa de gravação de vídeo. Em seguida, pressione a barra de espaço do computador de controle para começar a executar as fases experimentais.
Para acompanhar os vídeos, abra o software de rastreamento de passos de mosca e abra o arquivo de configuração dentro da pasta de rastreador de moscas. Defina a localização dos vídeos na pasta de vídeo e os nomes dos vídeos em arquivos de vídeo. Especifique as bordas da arena de moscas nas configurações da arena com base nas coordenadas de pixel x/y de vários pontos na borda da arena.
Específico a localização dos LEDs vermelhos inativos nas configurações de LED, com base nas coordenadas de pixel x/y da localização do centro dos LEDs. Para verificar a localização das bordas da arena de moscas, depure o depuração para verdade nas configurações da arena, clique em salvar e execute o script no terminal. Uma captura de tela do vídeo aparecerá com um quadrado azul formado pelas coordenadas inseridas nas configurações da arena.
Em seguida, mude a depuração nas configurações da arena para falsa. Clique em salvar e execute a tela no terminal novamente para iniciar o processo de rastreamento. Em um experimento típico de comportamento de temperatura, moscas únicas expostas a 16, 20 ou 24 graus celsius exibem uma locomoção maior no início do experimento, do que depois de cinco minutos.
A arena controlada pela temperatura também pode ser usada para comparar respostas comportamentais de moscas de diferentes origens genéticas com mudanças dinâmicas de temperatura. Por exemplo, neste experimento, a velocidade de todas as espécies testadas aumentou de acordo com suas próprias curvas de resposta à medida que a temperatura aumentava, até chegar a um ponto de desempenho máximo, após o qual suas velocidades se deterioraram e as moscas pereceram. Quando moscas individuais foram expostas a 40 graus celsius no meio e um azulejo lateral, com a azulejo lateral a 22 graus celsius confortável, as moscas do tipo Wild rapidamente pararam de se mover ao longo da arena e permanecem no local confortável.
Em contraste, o clássico mutante de memória Dunce voa continuar explorando a arena e gastar menos tempo do que controles no local confortável. Além disso, as combinações de testes de temperatura e localização também são úteis para entender a função de diferentes receptores de temperatura durante mudanças dinâmicas de temperatura. Como ilustrado neste experimento em que mutantes individuais d melanogaster foram expostos ao aumento das temperaturas, enquanto um local confortável em mudança a 22 graus celsius também foi fornecido.
Durante a realização desses procedimentos, lembre-se de executar as etapas em ordem e rapidamente para que você possa capturar o máximo de comportamento de moscas possível. Junto a este procedimento, outros métodos como geotaxis negativos ou ensaios de estrangulamento térmico podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como onde as moscas se movem normalmente ou têm uma resistência ao calor normal. As implicações dessa técnica estendem-nos a compreender distúrbios neurológicos ou mutações em que a percepção de temperatura ou dor desempenham um papel.
Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão porque cada passo é simples por si só, mas eles são obrigados a ser perfeitamente coordenados, então a técnica precisa ser praticada.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para avaliar o desempenho locomotor de Drosophila em resposta a variações de temperatura, utilizando uma arena programável com controle de temperatura. O método permite variações térmicas rápidas e precisas, facilitando o estudo das respostas das moscas a mudanças ambientais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Comportamental
- Sensibilidade à Temperatura
Antecedentes
- Drosophila atua como organismo modelo para o estudo de interações genéticas e ambientais.
- Mudanças de temperatura podem afetar significativamente a atividade locomotora e o comportamento.
- Compreender essas respostas pode fornecer insights sobre o processamento sensorial e a adaptação.
- Métodos automatizados aumentam a precisão nas condições experimentais.
Objetivo do Estudo
- Investigar o desempenho locomotor de Drosophila em diferentes temperaturas.
- Explorar as diferenças nas respostas entre diversos genótipos.
- Analisar as interações com outros estímulos sensoriais.
Métodos Utilizados
- Utilização de uma arena programável com controle de temperatura.
- Colocação de moscas macho e fêmea em ambientes controlados.
- Monitoramento da atividade locomotora sob diferentes condições de temperatura.
- Coleta automatizada de dados para análise precisa.
Resultados Principais
- Demonstrou a capacidade de alterar rapidamente as temperaturas e avaliar o comportamento das moscas.
- Identificou diferenças significativas no desempenho locomotor entre genótipos.
- Mostrou interações entre respostas à temperatura e sinais sensoriais.
Conclusões
- Este método fornece uma estrutura robusta para o estudo da sensibilidade à temperatura em Drosophila.
- Os achados contribuem para a compreensão das influências genéticas e ambientais sobre o comportamento.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para aplicações mais amplas em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a avaliação automatizada e de alto rendimento do desempenho locomotor dependente da temperatura em Drosophila, fornecendo dados fenotípicos quantitativos para a validação de alvos em estudos neurogenéticos. Ao capturar respostas comportamentais dinâmicas a estímulos térmicos controlados espacial e temporalmente, ele auxilia na desmistificação mecanicista de vias de detecção de temperatura relevantes para modelos de dor e distúrbios sensoriais. O rastreamento automatizado e o controle ambiental reprodutível aumentam a confiança preditiva em fluxos de trabalho iniciais de descoberta que envolvem estudos de função gênica e interação com o ambiente.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar as contribuições genéticas aos fenótipos de resposta térmica, apoiando a validação funcional de genes e vias neuronais envolvidos na detecção de temperatura.
- Valor Operacional: Facilita a comparação paralela de linhagens mutantes e selvagens sob condições ambientais idênticas e programáveis, permitindo isolar efeitos específicos do genótipo.
- Valor Preditivo: Gera curvas de desempenho semelhantes a curvas de dose-resposta ao longo de gradientes de temperatura, auxiliando na identificação de limiares funcionais e gradientes de gravidade fenotípica para a priorização de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Produz saídas locomotoras quantificáveis (velocidade, preferência de localização) que servem como leituras fenotípicas robustas e de alto conteúdo para triagem de bibliotecas genéticas ou moduladores farmacológicos da sensibilidade térmica.
- Valor Operacional: O rastreamento automatizado por vídeo e a padronização da arena reduzem a variabilidade entre experimentos, permitindo ensaios escaláveis e reprodutíveis, adequados para campanhas de triagem de média a alta produtividade.
- Prontidão do Ensaio: Gera métricas comportamentais normalizadas que podem ser comparadas entre genótipos e lotes experimentais, apoiando a validação do ensaio e a reprodutibilidade entre laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância Translacional: Modela mecanismos de adaptação térmica em ectotérmicos, oferecendo insights sobre vias conservadas de termossensação neuronal com possível relevância para alvos de dor e termorregulação em mamíferos.
- Continuidade Pré-clínica: Permite a avaliação longitudinal de curvas de desempenho térmico, apoiando decisões de avanço ajustadas ao risco em pipelines de validação de alvos, ao estabelecer relações genótipo-fenótipo-ambiente.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a dissecção da função de receptores térmicos por meio de perfis térmicos espaciais e temporais, reduzindo ambiguidades na associação de lesões genéticas a déficits no processamento sensorial.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, conectando perturbações genéticas a resultados comportamentais quantificáveis em um contexto ambiental controlado, apoiando assim esforços de validação de alvos orientados por hipóteses e identificação de compostos promissores na pesquisa neurocomportamental.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação sistemática da função de genes envolvidos na detecção de temperatura, correlacionando o background genético com respostas locomotoras dinâmicas a estímulos térmicos controlados.
- Triagem: Fornece leituras comportamentais quantitativas padronizadas (por exemplo, velocidade, preferência espacial) que permitem triagem confiável de compostos ou genótipos em vias sensíveis à temperatura.
- Análises: Gera conjuntos de dados comportamentais resolvidos no tempo e em temperatura, adequados para comparação estatística de curvas de desempenho, limiares térmicos semelhantes a EC50 e métricas de área sob a curva entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta fenótipos de resposta térmica em Drosophila a mecanismos conservados de transdução sensorial, contribuindo para a validação cruzada de espécies de alvos na pesquisa de termossensação e dor.
- Reutilização Empresarial: A arena automatizada e o fluxo de rastreamento representam uma plataforma reutilizável para o estudo de interações gene-ambiente em múltiplas modalidades sensoriais além da termossensação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece clareza mecanicista sobre circuitos neurais de detecção de temperatura, permitindo desafios térmicos com precisão espaciotemporal e quantificação automatizada do comportamento.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio do controle padronizado do ambiente, aquisição automatizada de dados e redução do manuseio manual, minimizando a variabilidade dependente do operador.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança nas decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer dados fenotípicos objetivos e quantitativos, reduzindo a dependência de pontuações comportamentais subjetivas em telas neurogenéticas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização de alvos com base na estratificação de riscos, associando lesões genéticas a déficits mensuráveis no desempenho térmico, apoiando a identificação precoce de alvos terapêuticos de alta confiança.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de Drosophila, no design de ensaios comportamentais e na configuração de software de rastreamento baseado em vídeo.
- Depende de equipamentos de arena com controle de temperatura, iluminação sincronizada e sistemas de gravação de vídeo para captura precisa de dados ambientais e comportamentais.
- Necessita padronização entre equipes dos parâmetros de calibração da arena, configurações de rastreamento e definições de protocolos térmicos para garantir reprodutibilidade entre diferentes locais ou usuários.
- A adaptação a outros modelos de insetos ou estímulos sensoriais pode exigir recalibração das dimensões da arena, limiares de rastreamento e taxas de rampa térmica com base no tamanho específico da espécie e na cinética de resposta.
- As limitações práticas incluem restrições na capacidade de processamento da arena (uma mosca por ensaio) e a necessidade de coordenação meticulosa dos procedimentos para manter o alinhamento temporal entre as mudanças térmicas e a gravação do comportamento.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:29
Fly and Temperature-Controlled Arena Preparation
2:02
Temperature Behavioral Experiments
3:13
Video Tracking and Data Analysis
4:31
Results: Representative Drosophila Performance Analyses in Response to Temperature Changes in Space and Time
6:08
Conclusion
