Um método automatizado para determinar o desempenho de Drosophila em resposta às mudanças de temperatura no espaço e no tempo

Este método pode nos ajudar a responder perguntas-chave sobre a resposta das moscas às mudanças de temperatura, como diferenças entre genótipos, a interação com outras pistas sensoriais ou a função de diferentes receptores de temperatura. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite múltiplas mudanças de temperatura rápidas e precisas controlando o tempo e o espaço e de forma automatizada. Comece colocando 20 moscas machos e 20 fêmeas em uma garrafa de criação contendo 45 mililitros de comida de mosca, e colocando a garrafa dentro de uma incubadora de 25 graus celsius sob 12 horas de luz, ciclos escuros de 12 horas.

Após 10 dias, anestesiar as moscas recém-eclosadas em almofadas de dióxido de carbono por um máximo de quatro minutos. E use um pincel para coletar moscas virgens em 2,5 por 9,5 centímetros de moscas criando frascos contendo 6,5 mililitros de alimentos frescos, separados por sexo em grupos de 20 moscas por frasco. Em seguida, devolva os frascos para a incubadora por cinco a sete dias.

Para configurar uma arena controlada pela temperatura, ligue a arena e abra o script de fases de temperatura no computador de controle. Verifique se a sequência de temperatura está devidamente definida e verifique se a duração de cada fase experimental está definida para 60 segundos. Sob a seção de bloco experimental inicial, confirme estas configurações: o número desejado de fases, a configuração iterativa on/off da luz vermelha indicativa que emite diodos, dois graus celsius aumento de temperatura por fase e 16 graus celsius como temperatura inicial.

Em seguida, execute o script de fases de temperatura. O software será inicializado por cinco segundos e depois parará. Para experimentos comportamentais de temperatura, coloque um fio de fita condutiva branca no topo dos azulejos de cobre da arena, garantindo que todas as bordas estejam cobertas.

Coloque um anel de alumínio aquecido ao redor das telhas de cobre e use um tecido limpo para limpar a tampa de vidro. Coloque a tampa na parte superior do anel de alumínio, deixando uma lacuna através da qual uma mosca pode ser soprada e toque um frasco de mosca aclimatado duas vezes para forçar as moscas até o fundo do frasco. Usando um aspirador bucal, aprisione uma mosca e feche o frasco antes de colocá-lo de volta na incubadora.

Exploda a mosca na arena através da abertura entre a tampa de vidro e o anel de alumínio e empurre imediatamente o trevo de vidro para fechar a abertura. Coloque um quadro de luzes ao redor da arena para garantir a iluminação simétrica e comece a gravar com o programa de gravação de vídeo. Em seguida, pressione a barra de espaço do computador de controle para começar a executar as fases experimentais.

Para acompanhar os vídeos, abra o software de rastreamento de passos de mosca e abra o arquivo de configuração dentro da pasta de rastreador de moscas. Defina a localização dos vídeos na pasta de vídeo e os nomes dos vídeos em arquivos de vídeo. Especifique as bordas da arena de moscas nas configurações da arena com base nas coordenadas de pixel x/y de vários pontos na borda da arena.

Específico a localização dos LEDs vermelhos inativos nas configurações de LED, com base nas coordenadas de pixel x/y da localização do centro dos LEDs. Para verificar a localização das bordas da arena de moscas, depure o depuração para verdade nas configurações da arena, clique em salvar e execute o script no terminal. Uma captura de tela do vídeo aparecerá com um quadrado azul formado pelas coordenadas inseridas nas configurações da arena.

Em seguida, mude a depuração nas configurações da arena para falsa. Clique em salvar e execute a tela no terminal novamente para iniciar o processo de rastreamento. Em um experimento típico de comportamento de temperatura, moscas únicas expostas a 16, 20 ou 24 graus celsius exibem uma locomoção maior no início do experimento, do que depois de cinco minutos.

A arena controlada pela temperatura também pode ser usada para comparar respostas comportamentais de moscas de diferentes origens genéticas com mudanças dinâmicas de temperatura. Por exemplo, neste experimento, a velocidade de todas as espécies testadas aumentou de acordo com suas próprias curvas de resposta à medida que a temperatura aumentava, até chegar a um ponto de desempenho máximo, após o qual suas velocidades se deterioraram e as moscas pereceram. Quando moscas individuais foram expostas a 40 graus celsius no meio e um azulejo lateral, com a azulejo lateral a 22 graus celsius confortável, as moscas do tipo Wild rapidamente pararam de se mover ao longo da arena e permanecem no local confortável.

Em contraste, o clássico mutante de memória Dunce voa continuar explorando a arena e gastar menos tempo do que controles no local confortável. Além disso, as combinações de testes de temperatura e localização também são úteis para entender a função de diferentes receptores de temperatura durante mudanças dinâmicas de temperatura. Como ilustrado neste experimento em que mutantes individuais d melanogaster foram expostos ao aumento das temperaturas, enquanto um local confortável em mudança a 22 graus celsius também foi fornecido.

Durante a realização desses procedimentos, lembre-se de executar as etapas em ordem e rapidamente para que você possa capturar o máximo de comportamento de moscas possível. Junto a este procedimento, outros métodos como geotaxis negativos ou ensaios de estrangulamento térmico podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como onde as moscas se movem normalmente ou têm uma resistência ao calor normal. As implicações dessa técnica estendem-nos a compreender distúrbios neurológicos ou mutações em que a percepção de temperatura ou dor desempenham um papel.

Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão porque cada passo é simples por si só, mas eles são obrigados a ser perfeitamente coordenados, então a técnica precisa ser praticada.