Protocolo clínico de produzir tecido adiposo-derivado do estroma Vascular fração para a regeneração da cartilagem potenciais

A osteoartrite é um dos transtornos debilitantes mais comuns entre a população idosa. Atualmente, não há cura definitiva para as causas subjacentes da osteoartrite. Este protocolo clínico descreve um procedimento inovador para um tratamento promissor, minimamente invasivo e alternativo da osteoartrite do joelho humano, regenerando cartilagem como tecido.

A osteoartrite é um dos transtornos debilitantes mais comuns entre a população idosa. Atualmente, não há cura definitiva para as causas sublinhadoras da osteoartrite. Este protocolo clínico é um procedimento inovador para um tratamento promissor, minimamente invasivo e alternativo da osteoartrite do joelho humano, regenerando tecido semelhante à cartilagem.

Leve o paciente para uma sala de cirurgia com um capuz classe A de risco biológico, e coloque-o em uma posição supina. Limpe a área abdominal do paciente com 5% de iodo betadina-povidina e drape o paciente usando a técnica estéril, expondo a área limpa do abdômen para lipoaspiração. Aproximadamente cinco centímetros infero-lateralmente do umbigo, anestesiam dois locais, um à esquerda e outro no lado direito do umbigo da incisão a ser feita.

Usando dois mililitros de 2% de lidocaína sem epinefrina com uma agulha de 1,5 polegada de calibre 25 em uma seringa de cinco mililitros injetando cada local no nível epidérmico. Anestesiar o local da incisão a ser feita usando cinco mililitros de solução tumescente e seringa de 10 mililitros e a agulha de 25 bitola de 1,5 polegada. Faça duas incisões de 0,5 centímetros aproximadamente cinco centímetros abaixo do umbigo lateralmente, beliscando a pele para elevar a profundidade do nível subcutâneo.

Usando uma lâmina número 11, ajude a pele elevada a penetrar até o nível subcutâneo, mas não penetrar através da parede abdominal. Usando cânula de 20 centímetros de 60 metros, anestesia o nível subcutâneo de toda a área inferior do abdômen que deve ser lipoaspirado com 700 a 800 mililitros da solução tumescente. Após terminar a infiltração de todo o abdômen inferior com solução tumescente, prepare um aparelho de lipoaspiração conectando uma cânula de 3,0 milímetros conectada a uma seringa de 60 mililitros ou 30 mililitros para lipoaspiração manual ou especialmente projetada canânula de 3,0 milímetros conectada a um kit de centrífuga.

Uma seringa de sistema fechada desenvolvida por nós mesmos e aprovada pela FDA CDRH com o propósito de manter a esterilidade conectada a uma máquina de vácuo para lipoaspiração assistida a vácuo. Realizar lipoaspiração para obter 100 a 110 gramas de tecido adiposo excluindo solução tumescente. Ao realizar a lipoaspiração, o tecido adiposo será obtido juntamente com a solução tumescente, mas deve ser separado e removido.

Para separar a solução tumescente primeiro pela gravidade, o tecido adiposo no kit centrífuga pode ser transferido para uma seringa de 60 mililitros e colocar a seringa para baixo. Por exemplo, a parte de abertura da seringa está na parte inferior. Esperando de cinco a seis minutos, o tecido adiposo e a solução tumescente serão separados.

Remova o fluido na parte inferior da seringa pressionando a parte superior do êmbolo da seringa. Realize as etapas acima de nove a 11 até que o total de 100 gramas a 110 gramas de tecido adiposo aspirado por joelho tenha sido acumulado. Depois de separar a solução tumescente por gravidade e acumular 50 gramas a 55 gramas de lipídio aspirado por cada 60 mililitros centrífugas kit estéril sistema fechado, coloque os dois kits de centrífugas em um balde de recipiente de centrífugas e gire a 1600 G por cinco minutos, condensando o aspirado lipídico e separando fluido do tecido adiposo.

Esse processo condensa ainda mais o aspirado lipída e pode produzir óleo gorduroso em certos casos. Com cuidado para não tremer, remova a tampa de segurança e o plugue na parte inferior do kit centrífuga. Remova o fluido inferior empurrando lentamente para baixo em cima do êmbolo do kit centrífuga.

Em seringa de 60 mililitros separados, dissolva 10 miligramas de colagenase, cinco miligramas de colagenase específicos para tecido conjuntivo e cinco miligramas de colagenase específicos para tecido adiposo com 50 mililitros de soro fisiológico normal. Misture aproximadamente 25 a 30 mililitros de lipídico condensado aspirado com colagem dissolvida, cinco miligramas de colagenase específicos para tecido conjuntivo, e cinco miligramas de colagenase específico para tecido adiposo em uma proporção de um a um, volume a volume, conectando a seringa de 60 mililitros a um kit de centrífugas usando um conector especializado. Misture completamente para condensar o aspirado de preparação e colagem, empurrando o conteúdo entre a seringa de 60 mililitros e o kit centrífuga usando uma haste ou um empurrador.

Transfira a mistura do lipídio aspirado e a colagem de volta para a seringa de 60 mililitros. Conecte cada seringa de 60 mililitros contendo a mistura com o homogeneizador de tecido que contém lâminas. Conecte uma seringa vazia de 60 mililitros à outra extremidade do homogeneizador.

Empurre a mistura para a outra seringa de 60 mililitros através do homogeneizador por quatro a seis vezes, resultando em corte e picar o aspirado lipídudo. Transfira o aspirado lipídico homogeneizado e a mistura de colágeno de volta para o kit de centrífuga de 60 mililitros através de um conector especializado. Coloque os kits de centrífugas em um recipiente a ser colocado em uma incubadora que foi pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Incubar os dois kits de centrífugas com a mistura homogeneizada a 37 graus Celsius por 40 minutos enquanto gira a 45 rpm. Após 40 minutos de incubação, remova o recipiente da incubadora de forma estéril. Em seguida, remova os kits de centrífugas e coloque-os em uma máquina centrífuga.

Centrifugar as misturas a 800 G durante cinco minutos para separar o SVF derivado do tecido adiposo. Após a centrífuga, o supernante, que inclui colagenase e tecido adiposo digerido, é removido de cada kit de centrífuga, removendo a tampa da seringa em cima do êmbolo e colocando uma seringa de 30 mililitros no êmbolo abrindo através de uma conexão de trava de seringa. Pressione lentamente a parte do barril da seringa de 30 mililitros para que o supernatante encha a seringa de 30 mililitros.

Pressione o barril de seringa de 30 mililitros até os últimos três a quatro mililitros do fundo do kit centrífuga, deixando apenas os últimos três a quatro mililitros de SVF derivado de tecido adiposo. O supernante é descartado. Remova a seringa de 30 mililitros da parte superior do êmbolo e encha a seringa com solução de anéis lactados de 5%dextrose, também conhecida como D5LR.

Ao anexar a seringa de 30 mililitros preenchida com D5LR na parte superior da abertura do êmbolo, encha os kits de centrífugas contendo três a quatro mililitros de SVF derivado de tecido adiposo com D5LR até 55 mililitros. Em seguida, remova a seringa de 30 mililitros, tampe a abertura do êmbolo e centrifugar os kits de centrífugas novamente a 300 G por cerca de quatro minutos. Repita as etapas número 17 ao número 21 para um total de quatro lavagens.

Após a quarta centrífuga, a fim de obter o SVF final para injeção, remova a tampa de segurança e o plugue na abertura inferior do kit centrífuga sem balançar ou girar o kit centrífuga. Conecte uma seringa de 20 mililitros à abertura inferior do kit centrífuga usando um conector especialmente projetado. Puxe o êmbolo da seringa de 20 mililitros várias vezes para frente e para trás para agitar as células que se estabeleceram na parte inferior do kit de centrífuga.

Remova o volume total desejado do SVF contendo TANTO ASTs quanto ECM, juntamente com outras células e tecidos. Normalmente cerca de três a quatro mililitros de cada kit de centrífuga para injeções articulares do joelho. Fizemos 30 mililitros de sangue autólogo junto com 2,5 mililitros de solução de dextrose citrato anticoagulante.

Então o sangue extraído foi transferido para os kits de barril de centrífugas de 60 mililitros. Foi então centrifuada em 730 gravidade por cinco minutos. E o supernante foi removido e colocado em um novo kit de barril de centrífugas de 60 mililitros.

O supernasce foi centrifuado em 1350 gravidade por quatro minutos, obtendo 4,4 mililitros de PRP. Limpe o joelho do paciente com 5% de betadina e drape-o de forma estéril. Palpa o anterior do joelho para o espaço articular entre ossos tibiais e femorais.

Anestesiar o local de injeção superficialmente com lidocaína diluída, um mililitro de 1%lidocaína diluída com quatro mililitros de soro fisiológico normal, da pele para fora da cápsula articular. Em seguida, anestesiar o interior da cápsula articular com ropivacaína diluída, um mililitro 0,75% ropivacaína diluída com três mililitros de soro fisiológico normal. Misture dois mililitros de HA ao seis a oito mililitros de SVF contidos em uma seringa de 20 mililitros através de uma seringa para conector de seringa.

Usando uma seringa para conector de seringa, adicione 0,4 mililitros de cloreto de cálcio aos três a quatro mililitros de PRP autólogo que já foi preparado e estar pronto em uma seringa de cinco mililitros. Combine 3,5 a 4,5 mililitros prp cloreto de cálcio em uma seringa de cinco mililitros com oito a 10 mililitros de mistura HA-SVF em uma seringa de 20 mililitros através de uma seringa para conector de seringa. Injete imediatamente a mistura, cerca de 12 a 15 mililitros, lentamente na articulação tibial-femoral anterior do joelho, usando agulha de calibre 38 milímetros com ou sem a orientação de ultrassom.

Após a injeção, enfaixe o local da injeção com pressão dobrando a gaze de algodão 4x4 quatro vezes e colocando fitas sobre a gaze 4x4 dobrada. Instrua o paciente a ficar parado por 60 minutos para permitir a fixação celular. Instrua o paciente a limitar as atividades pelo mínimo de uma semana após a alta da clínica.

Retorne à clínica para três injeções adicionais de PRP ativados por cloreto de cálcio ao longo de três semanas. O paciente com estágio três de OA recebeu o tratamento conforme descrito na seção de protocolo. Após a segunda semana da injeção de mistura ASV-ECM, a dor do paciente e a ROM melhoraram.

Na 16ª semana, a dor do paciente e a ROM melhoraram significativamente mais de 70% A ressonância magnética pós-tratamento, feita após a 16ª semana, mostrou o aumento da espessura do tecido semelhante à cartilagem no lado medial do joelho. Outro paciente com estágio três de OA recebeu o tratamento conforme descrito na seção de protocolo. Após a segunda semana da injeção de mistura ASV-ECM, a dor do paciente e a ROM melhoraram.

Na 18ª semana, a dor e a ROM melhoraram significativamente para 80% A ressonância magnética repetida tomada após a 18ª semana mostrou um aumento na altura do tecido semelhante à cartilagem no lado medial anterior do joelho. O terceiro paciente com estágio três OA recebeu o tratamento conforme descrito na seção de protocolo. Após a segunda semana de injeção de mistura ASV-ECM, a dor do paciente e a ROM melhoraram em aproximadamente 50% Na 22ª semana, a dor e a ROM melhoraram significativamente mais de 80% A ressonância magnética repetida tomada após a 22ª semana mostrou um aumento na altura do tecido semelhante à cartilagem no lado medial do joelho.

Atualmente não há terapia curativa disponível para o tratamento de OA. No entanto, a injeção percutânea de terapia de células-tronco com ASCs e ECM homogeneizado juntamente com HA e PRP análogo ativado com cloreto de cálcio pode fornecer uma alternativa à terapia de tratamento atual do tratamento do joelho OA.