Deteção de 3-Nitrotyrosine em ambientes atmosféricos através de alta performance sistema Detector eletroquímico-cromatografia líquida
30 de janeiro de 2019
Apresentamos um método para detectar modificações químicas 3-nitrotyrosine de proteínas atmosféricas com 6 rodadas de mm de diâmetro, cortadas de pré-filtros de amostrador de ar com um alto desempenho detector de eletroquímica-cromatografia líquido (HPLC-ECD).
Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em pesquisas ambientais sobre Nitrapyrin e 3-nitrotyrosina. A principal vantagem desta técnica é que ela é um método único e altamente sensível para detectar 3-nitrotilrose em filtros de amostra de ar. Para coletar partículas suspensas totais ou partículas de menos de sete mícrons de tamanho, primeiro pese um filtro de quartzo de 3 meses e fixe-o em um amostrador de ar de alto volume. Cubra o filtro com um seletor de tamanho de partícula para coletar PM7 ou deixe o filtro descoberto para coletar partículas suspensas totais. Execute o amostrador de ar a 1000 litros por minuto continuamente durante sete dias. Carregue os pré-filtros em uma unidade de classificação de tamanho e instale a unidade de classificação de tamanho e um filtro de backup no amostrador de ar de baixo volume. Execute o amostrador de ar a 116 ninhadas por minuto continuamente durante sete dias para coletar PM2.5 no filtro de backup. Quando a amostragem termina, regissou o volume total de fluxo. Pesar o filtro e calcular o peso das partículas coletadas. Sele o filtro em um saco plástico e armazene-o a 30 graus Celsius.Em seguida, prepare 500 microliters de coquetel de protease não específico 6X e tampão de acetato e coloque-o em uma membrana de dalase com um corte de peso molecular de 5000 daltons. Mergulhe a membrana preenchida em 1 L do tampão de acetato e mexa-a a 4 graus Celsius por 24 a 36 horas, substituindo o tampão a cada 12 horas para remover indogenos 3-Nitrotilrosina e Nitrítmite.Em seguida, meça a concentração de proteína na solução de protease dialícida com um ensaio de proteína de ácido bicinchonônnico. Depois disso, retire um filtro do congelador e deixe-o aquecer à temperatura ambiente enquanto ainda estiver lacrado no saco. Em seguida, soque até cinco círculos de 6 milímetros de largura a partir da área coberta de material particulado do filtro, e coloque os círculos em um tubo de micro centrífugas de 1,5 mililitros. Prepare 300 microliters de tampão de acetato contendo 50
Visão Geral
Este artigo apresenta um método altamente sensível para detectar modificações de 3-nitrotirosina em proteínas atmosféricas utilizando filtros prévios de amostradores de ar. A técnica utiliza cromatografia líquida de alta eficiência com detector eletroquímico (HPLC-ECD) para analisar as amostras coletadas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa ambiental
- Química analítica
- Ciência atmosférica
Antecedentes
- 3-nitrotirosina é um marcador de estresse oxidativo e de poluentes ambientais.
- A detecção dessa modificação pode fornecer informações sobre a qualidade do ar e os impactos à saúde.
- Os métodos atuais podem apresentar falta de sensibilidade ou especificidade para amostras atmosféricas.
- Este estudo tem como objetivo aprimorar as técnicas de detecção para um melhor monitoramento ambiental.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método sensível para detectar 3-nitrotirosina em amostras de ar.
- Aprimorar a compreensão das modificações proteicas atmosféricas.
- Contribuir para a pesquisa ambiental sobre poluentes como Nitrapyrin.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras de ar utilizando amostradores de alto volume.
- Uso de filtros de quartzo para capturar material particulado.
- Dialise das amostras para remover substâncias interferentes.
- Medição da concentração de proteína utilizando um ensaio de ácido bicinconínico.
Resultados Principais
- O método detecta com sucesso a 3-nitrotirosina com alta sensibilidade.
- Os resultados indicam níveis significativos de 3-nitrotirosina em amostras atmosféricas.
- A técnica é reprodutível e confiável para monitoramento ambiental.
- Os achados apoiam investigações adicionais sobre os efeitos dos poluentes do ar.
Conclusões
- Este método fornece uma ferramenta valiosa para pesquisadores ambientais.
- Pode ajudar a avaliar o impacto da qualidade do ar na saúde.
- Estudos futuros podem expandir as implicações da detecção de 3-nitrotyrosina.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a detecção sensível de 3-nitrotirosina, um biomarcador de dano oxidativo em proteínas, em material particulado atmosférico. Ele apoia a pesquisa em saúde ambiental ao associar a qualidade do ar a biomarcadores moleculares de inflamação e potencial alergênico. O ensaio fornece dados quantitativos úteis para estudos mecanicistas de desvio de risco em pesquisas de pneumotoxicologia e imunotoxicologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de estresse oxidativo em modelos expostos a bioaerossóis.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura de biomarcador para nitração proteica em misturas ambientais complexas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece medição quantitativa de 3-NT baseada em CLAE-ECD com sensibilidade de pg/m³.
- Valor Operacional: Utiliza perfuração padronizada de filtro e digestão com protease para preparo de amostra reprodutível.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a exposição ao MP ambiente com modificações proteicas detectáveis em modelos relevantes para o pulmão.
- Valor Operacional: Apoia a comparação entre estudos da carga oxidativa em diferentes frações de tamanho de partículas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, nos quais estímulos ambientais são avaliados quanto à sua relevância mecanicista para vias respiratórias ou imunológicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre a nitração proteica induzida por ozônio e NO2 em modelos de tecido pulmonar.
- Triagem: Permite a obtenção de amostras prontas para ensaio a partir de filtros com PM2,5 para triagem de biomarcadores.
- Análise: Oferece separação cromatográfica e detecção eletroquímica para quantificação específica de 3-NT.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados de exposição atmosférica a eventos moleculares iniciais nas vias de estresse oxidativo.
- Reutilização Empresarial: A plataforma HPLC-ECD pode ser adaptada para outras modificações pós-traducionais em amostras ambientais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Redução de riscos mecanicistas por meio de vínculos causais apoiados por biomarcadores entre poluentes atmosféricos e danos proteicos.
- Valor Operacional: Alta sensibilidade (1,13 pg/m³) permite a detecção em amostras ambientais de baixa abundância.
- Valor Estratégico: Informa a avaliação de riscos ao quantificar uma modificação oxidativa específica em misturas complexas.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de prosseguimento ou interrupção em programas voltados para patologias respiratórias relacionadas à poluição.
Considerações de Implementação
- Experiência em hidrólise proteica, diálise e operação de CLAE-DCE.
- Acesso a amostradores de ar de baixo volume, classificadores de tamanho e sistemas de digestão por protease.
- Padronização do tamanho do furo no filtro, condições de tampão e duração da diálise.
- Considerações de adaptação para diferentes tamanhos de material particulado e cargas proteicas.
- Limitação prática: exige a remoção de 3-NT endógeno e nitrito mediante diálise prolongada.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:28
Collection and Hydrolysis of Proteins in Particulate Matter (PM)
3:59
Determination of 3-Nitrotyrosine (3-NT) Content via a High-Performance Liquid Chromatography and Electrochemical Detection (HPLC-ECD) System
6:06
Results: Detection of 3-NT in PM2.5, PM7, and Total Suspended Particle (TSP) Samples Using HPLC-ECD
7:19
Conclusion
