Name: Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a desenvolver um sistema dominante-negativo induzível para inativação condicional de proteínas em células NIH3T3. Este método permite a expressão reversível de mutantes dominante-negativos, preservando atividade endógena residual para estudos de função proteica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O pCS2 + CB-Myc6 vector foi um presente do Marshall Horwitz (Universidade de Washington, Seattle, WA, Estados Unidos da América). As células de IES-OC1 foram gentilmente cedidas por Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, EUA). Suporte técnico foi fornecido por UNMC Mouse genoma engenharia núcleo (C.B. Itala, Don Harms, Rolen Quadros) e a Creighton University Biomedical Imaging usina integrada (Richard Hallworth, John Billheimer). A engenharia de genoma UNMC Mouse foi apoiado por um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do NIH/NIGMS, conceda número GM103471 P20. A usina integrada de imagem biomédica foi apoiada pela escola de medicina e doações GM103427 e GM110768 do NIH/NIGMS Universidade Creighton. A instalação foi construída com o apoio de subsídios do centro nacional para recursos de pesquisa (RR016469) e o NIGMS (GM103427). As linhas de rato geradas neste estudo foram mantidas em instalações de recurso Animal da Universidade de Creighton, cuja infra-estrutura foi melhorada através de uma concessão pelo NIH/NCRR G20RR024001. Este trabalho recebido passado apoio através de um NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE conceder (a Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) e uma bolsa de investigação emergentes da Fundação de saúde auditiva (de S. Jorge). O conteúdo desta pesquisa é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Geração de transgênicos CBRb mouse e todos os cuidados com animais e experiências associadas com o estudo foram aprovadas pelos cuidados institucionais do Animal de Creighton University e uso Comité (IACUC) e realizado por suas orientações.
1. transgênicos CB-Myc6-construção de Rb1
Nota: A clonagem em um vetor de pTet_Splice de CBRb foi feita em um processo de várias etapa (figura 1A e 1B).
<ol><li>
Realize a clonagem do primeiro estágio, no pCS2 + CB-Myc6 vector.
	<ol>
<li>Para criar a construção CBRb do transgene, amplificar um fragmento de cDNA de Rb1 1583-bp-long (528 aminoácidos correspondente à região de aminoácido 369-896) da proteína RB1 usando o primer seguinte conjunto: para EcoRI +RB 1243F, use GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCe XbaI + EcoRV +RB 2826R, use CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.</li>
		<li>Clone o fragmento gerado (1546 bp) entre os locais de restrição EcoR1 e XbaI do pCS2 + CB-Myc6 vetor, como descrito anteriormente,1,12. Nota: A construção de CB-Myc6 de 1012-bp-long (337 aminoácidos) fundida-se para o fragmento de Rb1 resultou em uma proteína de cerca de 865 aminoácidos (cerca de 108 kDa), que é ligeiramente menor do que a proteína endógena do RB1 (~ 110 kDa) (Figura 1 Um), com um tag de6 CB-Myc no N-terminal e Rb1 no C-terminal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realize a segunda fase subcloning no vetor pTet-Splice.
	<ol>
<li>Para amplificar o fragmento de fusão CB-RB-Myc6 e ganhar o Tet-promotor, amplificar a fita, consistindo o CB-myc6-Rb1 usando cartilhas contendo o EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) e sites de SalI : para SalI +CBF, Use o CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.</li>
		<li>Subclone o fragmento gerado (2567 bp) para o vetor pTet-Splice, entre os locais de restrição SalI e EcoRV , de tal forma que sinalizam o transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 inteiro, incluindo o intrão SV40 e a PolyA, podem ser isolados através de uma simples digestão com NotI (Figura 1B). Nota: O fragmento NotI foi usado para gerar os financiadores de transgénicos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. em Vitro testes do Transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1
<ol><li>
Dox-Regulamento: Linha de celular NIH3T3 Nota: Salvo indicação contrária, todos os volumes foram ajustados para uma placa de 6.<ol>
<li>Desenvolvem-se células NIH3T3 seguindo as especificações do fornecedor, utilizando o meio de cultura celular recomendado contendo 10% de soro bovino fetal a 37 ° C, com 10% de CO2.</li>
		<li>Cotransfect as células com pTet-Splice e vetores de pCMV-Tet3G (da etapa 1) por 24 h. sigam os passos abaixo mencionados para cotransfection.<ol>
<li>Misture 2 – 4 µ l do reagente baseado em lipídios transfeccao/poço e 1 mL de incompleta (sem o soro) Dulbecco modificado águia médio (DMEM) por 5 min à temperatura ambiente. Por um prato de 24 ou 12 --bem, use 250 ou 500 µ l de meios de cultura, respectivamente e ajustar o volume de reagente de Transfeccao de acordo.</li>
			<li>Adicionar 2-3 µ g de Plasmideo DNA/bem para o reagente de transfeccao-DMEM e incubar durante 20 min à temperatura ambiente.</li>
			<li>Adicione a mistura que contém DNA e o reagente de transfeccao em DMEM a cada poço. Após 3-4 h de incubação, adicione 1 mL de mídia completa (de modo que o volume final é 2 mL/poço). Manter as alíquotas de estoque Dox (1 mg/mL) e adicionar 2 µ l em cada um dos poços (+ Dox). Incube a 37 ° C com 5% CO2células. Nota: Amostras de controlo devem consistir de cotransfected células não tratadas com Dox (-Dox), bem como NIH3T3 células transfectadas apenas com o vetor de pCMV-Tet3G liberada e tratadocom com Dox, por um período de 24h. Para pCMV-Tet3G, as concentrações de 0,1 a 1 µ g/mL Dox deve ser suficiente para induzir a expressão do transgene.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Teste a reversibilidade da construção usando a linha de células HEK293.
	<ol>
<li>Para testar a reversibilidade do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , células de cultura HEK293 do águia mínimo essencial médio (EMEM) seguindo as especificações do fornecedor e cotransfect com vetores tanto pTet-Splice e pCMV-Tet3G para 24h, conforme descrito acima (passo 2.1.2).</li>
		<li>Para a inactivação de transgene, remova a mídia contendo Dox após 24 h, lavar a células 2 x-3 x com solução salina tamponada fosfato (PBS) e incube-os em media Dox-free para um adicional 24h. Nota: Em cima da Dox-remoção, o transgene inactivação e expressão da proteína regular devem ser retomados nesse prazo de 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para avaliar a funcionalidade da construção de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 em promover a proliferação celular não-programada, realize as análises funcionais usando uma linha de celular HEI-OC1, conforme descrito abaixo.
	<ol>
<li>Células de cultura HEI-OC1 em 10% DMEM sob permissiva condições (33 ° C com 10% CO2). Para estudos de proliferação celular, conte as células usando um contador de célula e placa 10.000 HEI-OC1 células numa placa de 96 poços em um volume de 200 µ l. Incube as células durante a noite.</li>
		<li>No dia seguinte, realizar uma cotransfection transitória de vetores pTet-Splice e pCMV-Tet3G, usando um reagente de transfeccao baseada em lipídios (ver passos 2.1.2). Em um poço separado, execute pmR-ZsGreen1 do transfection at2-µ g usando o reagente de transfeccao baseada em lipídios (etapas 2.1.2) para calcular a taxa de transfecção. Use células não transfectadas como controles.</li>
		<li>Detectar a presença de fluorescência verde sob um microscópio de fluorescência (excitação = 485 nm, emissão = 530 nm) para o transfectadas pilhas 24h depois do transfection. Registar a presença ou ausência de fluorescência verde e calcular a taxa de transfecção como o número total de células GFP-positivo (células transfectadas) sobre as células rotuladas com DAPI (células totais). Nota: Estimamos uma taxa de transfecção de ~ 70%.</li>
		<li>Para induzir a expressão do transgene, adicionar 1 µ g/mL Dox para um subconjunto de células transfectadas enquanto estiver usando o outro subconjunto como controle (-Dox). Use células de IES-OC1 não tratadas como controles adicionais.</li>
		<li>Para avaliar a proliferação celular, use um kit de proliferação de células de acordo com o protocolo do fabricante.<ol>
<li>Em breve, 48 h após a transfeccao, remover o meio de cultura celular e adicionar 100 µ l de solução corante-vinculação de 1x a cada poço do microplate. Incubar durante 1 h a 37 ° C.</li>
			<li>Depois disso, medir a intensidade de fluorescência de cada amostra, usando um leitor de microplacas de fluorescência (excitação = 485 nm, emissão = 530 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para avaliar usando imunocitoquímica de proliferação celular, células de IES-OC1 em um vidro de tampa em uma placa de 12 da placa e incubar durante uma noite a 37 ° C.<ol>
<li>No dia seguinte, cotransfect com a tala pTet e pCMV-Tet3G e realizar o tratamento de Dox (+ Dox). Use células untransfected como controles. Processo HEI-OC1 células para a rotulagem de Ki-67.</li>
			<li>Fixe as células com paraformaldeído 4% (PFA) em PBS, pH 7,4, durante 10 minutos à temperatura ambiente. Lavar as células 3 x com PBS gelado e incube as celulas em 0,25% de detergente não-iônico em PBS por 10 min.</li>
			<li>Lavar as células novamente, 3 x em PBS por 5 min e bloco usando 10% de soro em uma câmara umidificada por 1h à temperatura ambiente.</li>
			<li>Incube as celulas em 500 µ l do anticorpo primário do Ki-67 (diluição de 1: 200) para 3h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.</li>
			<li>Lavar as células 3 x por 5 min com PBS. Depois disso, Incube as celulas com o anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente no escuro.</li>
			<li>Remover a solução de anticorpo secundário e lavar as células 3 x com PBS por 5 min no escuro.</li>
			<li>Para a rotulagem faloidina, Incube as celulas de IES-OC1 em 1: 200 faloidina por 30 min. Para rotular os núcleos das células, Incube as celulas com 5 µ g/mL DAPI durante 10 minutos à temperatura ambiente. Nota: Certifique-se de que o conjugado de tintura faloidina é diferente do que o conjugado anticorpo secundário.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. geração de /ROSA-CAG-rtTA de CBRb++ (CBRb) ratos transgênicos e em testes de Vivo da abordagem DN-CBRb
<ol><li>Após a confirmação do Regulamento Dox eficaz do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , purificar o fragmento NotI e microinjeção-los em zigotos de rato, que depois são transferidos para as fêmeas grávidas pseudo. Nota: Esses procedimentos foram realizados na Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC) Mouse genoma engenharia Core instalação.</li>
	<li>Após o parto, os filhotes usando um primer conjunto específicos para a região de fusão do CB-Rb1 de genótipo: para F CBRb, use CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ' 5' e para CBRB R, use 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3 '. Nota: Tamanho do produto do PCR observado em gel de agarose é 401 bp (região de CB 60-bp + 341-bp Rb1 região (tabela 1). Foram identificadas dez linhas de fundador independente, baseado na presença do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . Em cinco destas linhas, descendência herdou o transgene, que confirmou a transmissão do germline do transgene. Uma das linhas transgénicas, finalmente, foi usada para estabelecer e manter a linha e gerar animais experimentais de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 para estudos adicionais.</li>
	<li>Reproduzem os ratos adultos TetO-DN-CB-myc6-Rb1 à linha ROSA-CAG-rtTA tetraciclina indutor (Stock #006965) (Alternativamente, raça para uma linha de indutor de tTA) para gerar experimental DN-CBRb ratos. Genótipo a prole desta cruz usando o seguinte conjunto de primeira demão: para rtTA-WT R, use GGAGCGGGAGAAATGGATATG; para rtTA mutante R, use GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; e para rtTA comum, use AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Os tamanhos do produto PCR são 340 bp (mutante), 340 bp e 650 bp (heterozigoto) e 650 bp (tipo selvagem).</li>
	<li>Gere uma curva de dose-resposta da proteína RB1 Dox no tratamento para determinar a hora e a duração do tratamento necessária para eliciar uma expressão do transgene Dox. Nota: Neste experimento, borrão ocidental e qRT-PCR foram utilizados para avaliar o tecido-específica do transgene ativação e expressão de RB1.</li>
	<li>Execute a fluorescência em situ da hibridação (peixe) para confirmar a inserção genômica do transgene. Nota: Isto foi realizado no centro de genômica aplicada do Hospital para crianças doentes (Toronto, Canadá). ELISA ou mancha ocidental (usando anticorpos específicos de proteínas) pode ser usado para avaliar a ativação do transgene, tecido-especificidade e alterações nos níveis do POI endógeno. Para a construção de DN-CB-myc6-Rb1 , foi utilizado um anticorpo anti-RB1.</li>
</ol>

<ol><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li>
<li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+retinoblastoma+%28rb%291-inducible+dominant-negative+%28DN%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li>
<li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li>
<li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+ciliogenesis%2C+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122%2FWdr10%2C+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1%2FMbd4%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li>
<li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li>
<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li>
<li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20813881">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15190215">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+retinoblastoma+1+%28Rb1%29+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+%28Skp2%29+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li>
<li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1%28%2B%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li>
<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+%28RB%29+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li>
<li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts%3A+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li>
<li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li>
<li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+therapeutics%3A+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li>
<li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li>
<li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animal+models+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li>
<li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li>
<li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Para contornar as limitações associadas com as estratégias tradicionais de transgénicas, procuramos gerar um modelo de mouse em que um POI endógena pode ser condicionalmente inativado pela superexpressão uma forma mutante de DN do de uma forma spatiotemporal. Suprimir a função de POIs endógenas, várias opções foram propostos15,16,17. Modificamos um anterior estratégia genética1 , combinando o sistema tran...

A maioria das abordagens visando os gene e proteína ablações dependem de processos de permanentes, que geralmente levam à eliminação completa ou truncamento do gene, sequências de RNA ou proteína de interesse (POI). O objetivo geral deste método é engenheiro uma proteína recombinante para suprimir a função da proteína endógena, selvagem-tipo. Nós temos revisitado e renovada uma estratégia alternativa1,2, que permite a ablação temporária de um POI através da inibição de DN. Esse método funciona para ambos multiméricas e peptídeos monoméricos, mas é o mais adequado para as proteínas que funcionam em um assembly multiméricas.
O método consiste em fundir a protease lisossômica CB para uma subunidade de uma multiméricas POI (fusão de CB complexo). A fusão de CB resultante complexa pode interagir com e proteoliticamente digerir a proteína endógena ou desviar todo o complexo para o lisossoma para ser degradada3CB-POI. Além disso, uma combinação da fusão CB complexa com a natureza inducible do sistema controlado por tetraciclina ativação transcricional (TetO) permite uma expressão inducible e controlada do transgene em uma moda reversível2. Embora útil em muitas circunstâncias, a completa eliminação de genes ou proteínas in vivo pode resultar em letalidade4,5,6. Da mesma forma, exclusão condicional, tecido-específica de alguns genes ou proteínas utilizando o sistema Cre/Lox pode não ser simples, como, em última análise, conduzirá à perda permanente de elementos críticos de genômica7. Portanto, dependendo do gene ou POI, nenhuma dessas abordagens será eficaz em fornecer um modelo útil para estudos posteriores, particularmente dos genes ou dos proteínas estudos funcionais em camundongos adultos e pós-natal atrasados.
Para contornar os problemas associados com tais abordagens e fornecer prova de princípio sobre a eficácia do método proposto, decidimos testar o método apresentado aqui, gerando uma versão DN condicional da proteína do Retinoblastoma 1 (RB1). Várias opções foram propostos8,9,10 para abolir a função de RB1 endógena; no entanto, todos eles enfrentaram algumas das mesmas limitações discutidas acima: exclusão permanente germline de RB1 é embryonically letal, e, coerente com seu papel de supressor de tumor, permanente exclusão condicional RB1 leva a uma variedade de tumores11. Apesar de uma versão do DN de RB1 não parece ocorrer naturalmente, uma alternativa melhor para as estratégias atualmente disponíveis deve permitir uma inativação temporalmente controlada do RB1 endógena e fornecem um mecanismo alternativo para eventualmente restaurar sua função. A base para tal uma construção foi descrita há mais de duas décadas atrás1. No entanto, devido às limitações tecnológicas, faltava-lhe um mecanismo de controle do transgene ativação de resposta e especificidade de tecido. Este estudo é o primeiro a combinar a elegância de doxiciclina (Dox)-sistema transcriptional dependente com uma engenharia construção transgênica de protease lisossômica CB e Rb1 proteínas. O modelo resultante do rato CBRb permite um temporariamente regulamentado RB1 mediada por Dox regra2. A vantagem de usar uma abordagem baseada em proteoma para estudar a função dos genes é que pode ser adotado para qualquer gene de interesse, com informações mínimas sobre a sua actividade.
A estratégia proposta do transgene DN oferece muitas vantagens sobre as abordagens tradicionais. Primeiro, inibição da proteína de DN leva a apenas uma ablação parcial na atividade da proteína, preservando assim uma expressão residual endógena. Esse resultado é altamente desejável em situações onde uma eliminação completa da atividade da proteína leva a letalidade embrionária, limitando grandemente qualquer investigação para estudar a função do gene em um rato vivo. Em segundo lugar, a presença do sistema de TetO permite ativação do transgene apenas na presença de um antibiótico, o que permite um controle eficiente e reversível da atividade do transgene. Assim, por cessar a administração de antibióticos, o sistema transgênico pode ser desativado, e uma expressão normal de RB1 está de volta em casa. Em terceiro lugar, a especificidade da expressão do transgene pode variar dependendo do promotor da escolha. Enquanto nós escolhemos o promotor ROSA-CAG onipresente para prova de princípio, colocar o transgene sob um promotor de tecido-específica é susceptível de restringir a expressão do transgene indesejados e facilitar estudos sobre a aplicação terapêutica deste transgene metodologia.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM</td><td>GIBCO-BRL</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle, MEME&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F2442&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina&nbsp;</td><td>DharmaFECT</td><td>T-2010-03</td><td></td></tr><tr><td>Sal I</td><td>Roche</td><td>11745622</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>Roche</td><td>13090730</td><td></td></tr><tr><td>CaspaTag&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>APT523</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma&nbsp;</td>Kit de proliferação celular <td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant NF</td><td>Invitrogen</td><td>C35007</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo para retinoblastoma 1</td><td>Abcam</td><td>Ab6075</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo c-Myc</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M5546</td><td></td></tr><tr><td>b-actina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Phallodin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas de fluorescência</td><td>FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência&nbsp;</td><td>NikonEclipse80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A linha de camundongos TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) está disponível no Jackson Laboratory como JAX#032011.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (dn)

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inibição de proteína dominante negativo (DN) é um método poderoso para manipular a função da proteína e oferece diversas vantagens sobre outras abordagens de genoma. Por exemplo, embora quimérico e Cre-LoxP alvos estratégias têm sido amplamente utilizadas, as limitações intrínsecas destas estratégias (ou seja, atividade de promotor gotejante, expressão Cre de mosaico, etc) têm significativamente restringido sua aplicação. Além disso, uma eliminação completa de muitos genes endógenos é embryonically letal, tornando impossível para estudar a função dos genes na vida pós-natal. Para enfrentar estes desafios, temos fez mudanças significativas para um protocolo de engenharia genética precoce e uma versão curta (transgênica) do gene Rb1 aliada a uma protease lisossômica procathepsin B (CB), para gerar um modelo de mouse DN de Rb1 (CBRb). Devido à presença de uma protease lisossômica, a proteína de fusão CB-RB1 inteira e seu complexo de interação são roteadas para degradação mediada por Proteassoma. Além disso, a presença de um elemento de indutor (rtTA) tetraciclina na construção transgênica permite um regulamento inducible e reversível da proteína RB1. A presença de um promotor de ROSA-CAG onipresente no modelo do rato de CBRb torna uma ferramenta útil para realizar ablação de gene Rb1 transitória e reversível e fornecer um recurso de pesquisadores para a compreensão de sua atividade em praticamente qualquer tipo de célula onde RB1 é expresso.

Geralmente, a concepção de uma mutação de DN exige uma quantidade considerável de informações sobre a estrutura e função do POI. Em contraste, a estratégia de DN apresentada aqui é particularmente útil quando as informações estruturais e funcionais para o POI são limitadas. Se o POI é uma proteína multiméricas, uma fusão de uma subunidade de uma protease lisossômica dominante pode inibir o multimer montado e, potencialmente, outros ligantes através de uma combinação de proteólise das subu...

Aqui nós apresentamos um protocolo para desenvolver um sistema inducible negativo dominante, em que qualquer proteína pode ser condicionalmente inativada pela superexpressão reversivelmente uma versão mutante dominante negativo dele.

Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em uma ampla variedade de campos que requerem inativação condicional e transitória de um gene de interesse, expressando reversivelmente uma versão negativa dominante dele. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite apenas uma ablação parcial na atividade proteica, preservando assim uma expressão endógena residual. Embora, aqui descrevemos a condição de inativação da proteína RB, que funciona em um conjunto multimédico, essa metodologia também pode ser aplicada a proteínas monoméricas.Umesh Pyakurel, nosso técnico de laboratório e coautor do manuscrito demonstrará os procedimentos. Para começar, cresça células NIH3T3, seguindo as especificações do fornecedor, a 37 graus Celsius com 5% de CO2, utilizando o meio de cultura celular recomendado contendo 10% de soro bovino fetal. Para cotransfectar as células usando os vetores pTet-Splice e pCMV-Tet3G, primeiro misture dois a quatro microliters do reagente de transfecção à base de lipídios por poço, e um mililitro de DMEM incompleto por poço em um tubo de 15 mililitros, e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente.Adicione dois a três microgramas de DNA de plasma por poço à mistura de DMEM deste reagente de transfecção. Misture e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. Adicione um mililitro da mistura contendo DNA e o reagente de transfecção em DMEM a cada poço de placa de seis poços com células NIH3T3.Após três a quatro horas de incubação a 37 graus Celsius com 5% de CO2, adicione um mililitro de meio completo. Em seguida, adicione 2 microliters de estoque de doxiciclina a cada poço e marque a placa como plus-doxiciclina. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de CO2.Para avaliar a funcionalidade da construção TetO-DN-CB-myc6-Rb1 na promoção da proliferação celular não programada, cultura células HEI-OC1 no DMEM contendo 10% de FBS, em condições permissivas. Para estudos de proliferação celular, conte as células HEI-OC1 usando um contador celular. Placa 10.000 células HEI-OC1 por poço em uma placa de 96 poços em 200 microliters de volume cada.Incubar as células durante a noite a 33 graus Celsius com 5% de CO2. Para induzir a expressão transgênica, adicione um micrograma por mililitro de doxiciclina a um subconjunto de células HEI-OC1 transfectadas. Use o outro subconjunto rotulado como menos-doxiciclina e as células HEI-OC1 não transfectadas como controles, e incubar as células como 33 graus Celsius com 10% de CO2.Para avaliar a proliferação celular, 48 horas após a transfecção, remova o meio de cultura celular e adicione 100 microliters de solução de ligação de corante 1x de um kit de proliferação celular a cada poço da microplacante. Siga o protocolo do fabricante e incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Use um leitor de microplaca de fluorescência para medir a intensidade da fluorescência de cada amostra.Para avaliar ainda mais a proliferação celular usando a imunocitoquímica, aplaque as células HEI-OC1 em um copo de cobertura colocado em cada poço de uma placa de 12 poços em DMEM. Incubar as células durante a noite a 33 graus Celsius. No dia seguinte, cotransfecte para as células em dois poços com os vetores pTet-Splice e pCMV-Tet3G, e então realizar o tratamento de doxiciclina em um bem como feito com as células NIH3T3.Use um não transintratado, bem como um controle. Para processar as células para rotulagem Ki-67, fixe-as com 4% de paraformaldeído em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente. Depois disso, lave-os três vezes com PBS gelado por cinco minutos cada.Adicione 0,25% de detergente noniônico na PBS e incubar por 10 minutos. Repita a lavagem três vezes em PBS por cinco minutos cada. Use 10% de soro para bloquear as células.Em uma câmara umidificada por uma hora em temperatura ambiente. Adicione 500 microliters de anticorpos primários Ki-67 e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Lave as células novamente três vezes em PBS por cinco minutos cada.Adicione um mililitro do anticorpo secundário e incuba as células por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Depois de remover a solução de anticorpos secundários, lave as células novamente três vezes por cinco minutos em PBS no escuro. Para rotular as células HEI-OC1 com fábula, incuba-as em 1:200 phalloidin por 30 minutos em temperatura ambiente.Para rotular os núcleos celulares, incubar as células com cinco microgramas por mililitro de DAPI por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a entrega dos camundongos transgênicos, o genótipo dos filhotes usando um conjunto de primer específico para a região de fusão CBRb1, conforme descrito no manuscrito. Crie camundongos TetO-DN-CB-myc6-Rb1 para a linha de indutor ROSA-CAG-rtTA e tetrecycline para gerar camundongos DN-CBRb experimentais, e genótipo de seus descendentes, conforme descrito no manuscrito.NIH3T3 não expressa proteína RB1 endógena, por isso a expressão robusta RB1 vista aqui se deve à indução transgênica na presença do Dox, mas não na sua ausência, confirmando a ativação eficiente da construção do mix RB1 TetO-DN-CB-myc6-Rb1. Em contraste, as células HEK293 têm expressão RB1 endógena. A adição de doxycycline levou à ativação TetO-DN-CB-myc6-Rb1 e à regulação de down-regulation RB1.A expressão RB1 foi retomada 21 horas após a doxilalina ser removida da mídia. As células HEI-OC1 cotransfectadas com os mesmos vetores, apresentaram um aumento modesto, mas significativo no número de células, seguindo o tratamento da doxiciclina em comparação com as células transfeinadas não tratadas com doxiciclina, e as células não transtravadas. A hibridização fluorescente in situ confirmou a inserção genômica do transgene TetO-DN-CB-myc6-RB1 em camundongos.Houve um aumento inicial na expressão total da proteína RB1 na cóclea dos camundongos transgênicos tratados com doxiciclina por três dias em comparação com o grupo controle. Entretanto, em grupos tratados com doxociclina durante sete e 10 dias, observou-se uma redução significativa na expressão RB1. Independentemente do tecido analisado, observou-se redução significativa da proteína RB1 em camundongos transgênicos tratados com doxocycline, mas não no grupo controle, confirmando a eficiência da construção TetO-DN-CB-myc6-RB1.Ao tentar este procedimento, é importante verificar se cada um dos elementos de codificação do transgene estão em quadro entre si. Se as regiões de codificação de Cathepsin B e retinoblastoma descritas neste relatório estivessem, por acaso, conectadas fora do quadro, não produziria a proteína de fusão pretendida. Assim, a verificação da sequência de DNA deve ser feita antes de injetar o transgene em embriões de camundongos unicelulares.Após esse procedimento, o onipresente promotor cag pode ser substituído por promotores específicos, a fim de estudar a função genética de forma específica de uma célula.

inducible-and-reversible-dominant-negative-dn-protein-inhibition

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Uma maneira rápida e simples para gerar linhas de células humanas com sobre-expressão de cDNA induzido e reversível ou shRNA mediada knock-down do gene de interesse. Este método permite aos investigadores linhas celulares de modo fiável e altamente reprodutível manipular que são difíceis de alterar pelos métodos de transfecção transiente ou convencionais knockdown / knockout estratégias.

A geração de linhas de células humanas estáveis ​​com tetraciclina induzível (Tet-on) ou shRNA Expression cDNA

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

Descrevemos aqui um sistema que utiliza um bloco de proteína in vivo reversível e específico do local para parar e colapsar garfos de replicação em Escherichia coli. O estabelecimento do bloco de replicação é avaliado por microscopia de fluorescência e eletroforese em gel de agarose bidimensional neutro-neutro é usada para visualizar intermediários de replicação.

Induzir um bloqueio de replicação de site específico no<i&gt; E. coli</i&gt; Usando um sistema fluorescente repressor de operador

Este protocolo serve como um esquema para a criação de um sistema funcional de Tet-ON em linhas de células de câncer e sua utilização posterior, em especial para estudar o papel das proteínas derivado de células de tumor no recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do tumor.

Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor

Este protocolo descreve as etapas necessárias para gerar um modelo de sistema em que a transcrição de um gene endógeno de interesse pode ser condicionalmente controlada em animais vivos ou células usando reforçada ALC repressor e/ou sistemas de ativador de tet .

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

Aqui, descrevemos uma ferramenta de edição de genomas baseada na estabilização temporal e condicional da re repetição palindômica curta interespaçada regularmente interespaçada ( CRISPR-) (Cas9) sob a pequena molécula, Shield-1. O método pode ser usado para células cultivadas e modelos animais.

Um novo kit de ferramentas para avaliar funções genéticas usando estabilização condicional cas9

A interação de um remodelador de cromatina dependente de ATP com um ligante de DNA é descrita usando espectroscopia de CD. As alterações conformais induzidas em um promotor genético analisado pelos picos gerados podem ser usadas para entender o mecanismo de regulação transcricional.

Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína

Aqui, apresentamos um protocolo para a seleção in vitro de repressores transcricionais projetados (ETRs) com alta, longa duração, estável, eficiência de silenciamento no alvo e baixa atividade fora do alvo em todo o genoma. Esse fluxo de trabalho permite reduzir um repertório inicial e complexo de ETRs candidatos a uma lista curta, adequada para avaliação adicional em cenários terapeuticamente relevantes.

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

Este estudo descreve métodos para a co-expressão mediada por T7 de múltiplos genes de um único plasmídeo em Escherichia coli usando o sistema de plasmídeo pMGX.

Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

Aprenda a desenvolver um sistema dominante-negativo induzível para inativação condicional de proteínas em células NIH3T3. Este método permite a expressão reversível de mutantes dominante-negativos, preservando atividade endógena residual para estudos de função proteica.

Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)

Explorar mais vídeos