Name: Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Aprenda a reprogramação direta de linhagem de fibroblastos de rato para progenitores eritroides usando fatores de transcrição. Este método simplifica o estudo da regulação transcricional no desenvolvimento eritroide.

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Agradecemos Evelyn Wang e Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) para clonagem e Harvey Lodish (Instituto Whitehead) fornecendo muitos o plasmídeo utilizado para gerar a biblioteca retroviral. Agradecemos leiliane Siva e Sofie Singbrant (departamento de Medicina Molecular e Gene Therapy, Universidade de Lund), Göran Karlsson e Shamit Soneji (departamento de Hematologia Molecular, Universidade de Lund) para os seus papéis na descrição da produção do iEP. Também gostaríamos de reconhecer e agradecer o Julian Pulecio (centro de medicina regenerativa, parque de pesquisa biomédica de Barcelona), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, Nova Iorque), Carl Walkley (Instituto de pesquisa médica de St. Vincent e Departamento de medicina, Hospital de St. Vincent, Universidade de Melbourne), Ángel Raya (instituição catalã de investigação e estudos avançados, Barcelona) e G. de Vijay Sankaran (Broad Institute do Instituto de Massachusetts de tecnologia e Harvard, Cambridge ) por suas contribuições anteriores a este trabalho. Este trabalho foi financiado pela Fundação Ragnar Söderberg (a J.F.); o sueco de pesquisa Conselho (J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (para J.F.); a Fundação sueca para a investigação estratégica (para J.F.); Fundação de Åke Wiberg (para J.F.); um subsídio de integração de Marie Curie (para J.F.).

1. estabelecimento e manutenção da cauda do rato principal dica culturas de fibroblastos
<ol><li>Prepare pratos de gelatina-revestido (recomendo um prato de 10 cm para uma cauda), cobrindo a superfície com 0.1% de gelatina e incubando os pratos por aproximadamente 20 min a 37 ° C. Aspirar a solução de gelatina do prato e deixe-o secar pelo menos 2 h.</li>
	<li>Eutanásia em ratos por deslocamento cervical. Retire o rabo com uma tesoura, corte na base da cauda. Coloque o rabo no fosfato salino de Dulbecco (DPBS) com 2% de soro fetal bovino (FBS) até estar pronto para usar. Nota: Para os melhores resultados, caudas devem ser tomadas de ratos em torno de 6 a 8 semanas de idade. Caudas podem ser tomadas de ratos mais de 8 semanas de idade, no entanto, como a idade de camundongos, a capacidade de proliferação dos fibroblastos e a eficiência de reprogramação diminuição11.</li>
	<li>Execute todas as etapas subsequentes do presente protocolo em uma capa de tecido cultura sob condições estéreis. Preparar uma solução diluída de tripsina de 0,02% do trypsin-EDTA em DPBS e adicionar 5 mL em um prato sem revestimento 10 cm.</li>
	<li>Lave o rabo, primeiro em etanol a 70% e, em seguida, em DPBS. Em um prato, coloque a cauda plana e usar fórceps para prendê-lo no lugar. Fazer uma incisão na cauda ao longo do eixo longitudinal da base até a ponta.</li>
	<li>Segure a cauda com um par de pinças e segurá-lo na vertical. Usando um segundo par de pinças, agarre a pele ao lado da incisão na base da cauda e descascá-lo de volta. Fazer isso em ambos os lados da incisão até que a pele pode ser removida, puxando para baixo em direção a ponta da cauda.</li>
	<li>Segure o rabo pelado com pinça sobre o prato que contém a solução de tripsina e cortar a cauda pedaços aproximadamente 1 cm longo. Com as peças de cauda na solução de tripsina, use tesoura para fragmentar as peças em partes menores. Incube as peças de cauda na solução de tripsina a 37 ° C por 10 min. Nota: As peças menores são preferidas por forma a fornecer a cada peça uma área de superfície elevada à relação do volume.</li>
	<li>Saciar a tripsina usando 2 volumes de meio de expansão (FEX) de fibroblasto (alta-glicose Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com 15% FBS, 2 mM L-glutamina, aminoácidos não essenciais (timina) e 100 U/mL penicilina/estreptomicina).</li>
	<li>Coletar todo o conteúdo do prato em um tubo de 50 mL e centrifugar 350 × g por 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os fragmentos de cauda em 10 mL de meio fresco FEX.</li>
	<li>Transferência de fragmentos de cauda em meio a um prato de gelatina-revestido e incubar a 37 ° C em 5% de CO2 e 4% O2, acrescentando meio fresco FEX a cada 2 dias. Nota: Depois de cinco a sete dias, fragmentos de cauda Anexei no fundo do prato e fibroblastos podem ser vistos afastando-os.</li>
	<li>Uma vez que os clusters de fibroblastos são identificados, agite suavemente o prato para desalojar as peças de cauda e aspire o meio e todos os fragmentos de osso, deixando os fibroblastos anexados à placa. Adicionar novo meio FEX e cultura de fibroblastos até confluente.</li>
	<li>Para garantir a não contaminação dos fibroblastos pelos progenitores hematopoiéticos, dissociar as células da placa usando 1 x do trypsin-EDTA por 5 minutos e coletar as células. Empobrecem para células expressando marcadores hematopoiéticas (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 e Ter-119) usando um sistema de separação magnética10.</li>
</ol>2. retrovírus produção
<ol><li>Células de empacotamento retroviral em aproximadamente 2,5 × 104 células/cm2 (2,0 × 106 células para um prato de 10 cm) em um prato de cultura de tecido-tratada (por vácuo-gás plasma) e a cultura durante a noite em alta-glicose DMEM com 10% de sementes FBS, 10mm de sódio Piruvato e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina em 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Na manhã seguinte, altere o meio para DMEM sem aditivos usando metade do volume utilizado para a cultura durante a noite (5 mL para um prato de 10 cm). À tarde, verifique se as células são 70-80% de confluencia e começam o transfeccao.</li>
	<li>Para cada fator de reprogramação, Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc, prepare uma mistura de 2:1 do vetor de expressão (pMX) e vetor auxiliar (contendo genes gag e pol). Por um prato de 10cm de fibroblastos, use 6 µ g de vetor de expressão e de 3 µ g do vetor auxiliar em um volume final de 100 µ l em meio DMEM.</li>
	<li>Para cada fator de reprogramação, preparar 300 µ l de temperatura (RT) DMEM em um tubo estéril de poliestireno e cuidadosamente adicionar 27 µ l de reagente de transfeccao comercial. Nota: O reagente de transfeccao deveria ser trazido para RT antes do uso e deve ser adicionado diretamente no meio de como as propriedades eletrostáticas do composto podem torná-lo a furar a parede do tubo plástica.</li>
	<li>Adicione a mistura do plasmídeo no tubo de contendo reagente de transfeccao, vórtice brevemente e incubar a mistura de reagente-DNA de Transfeccao para 15 min no RT. brevemente vórtice a mistura e adicioná-lo para as células de empacotamento retroviral gota a gota para que o transfection mistura de reagente-DNA é espalhada uniformemente sobre a cultura e incubar a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>24 h após a transfeccao, mudar o meio de DMEM com 20% FBS e 100 U/mL penicilina/estreptomicina. 48 h após a transfeccao, recolher o sobrenadante e filtrar através de um filtro de seringa de tamanho de poros de 0,22 µm. Nota: Sobrenadantes Viral podem ser congelados a-80 ° C e mantidos até necessária, embora transdução é mais eficiente se o sobrenadante viral fresco é usado.</li>
</ol>3. transdução GTLM e colheita do iEP
<ol><li>Semente a cauda dica fibroblastos de 1 × 104 células/cm2 em 0,1% gelatina pré-revestido pratos no meio de FEX e incuba a 37 ° C por 24 h.</li>
	<li>No dia seguinte, prepare uma mistura de transdução como segue.<ol>
<li>Adicione 1 volume de sobrenadante viral para cada fator reprogramação suplementado com 4 µ g/mL de reagente de infecção retroviral (40%) para 6 volumes de meio FEX (60%).</li>
		<li>Por um prato de 10cm de fibroblastos, adicionar 1 mL de cada sobrenadante viral (4 × vírus = 4 mL) suplementado com 4 µ g/mL de reagente de infecção retroviral para 6 mL de meio FEX, dando um total de 10 mL de mistura de transdução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspire médio FEX de cultura de fibroblasto e substituí-lo com a mistura de transdução. Incube a transdução por 4 h a 37 ° C em condições de hipóxicos (5% de CO2 e 4% O2).</li>
	<li>Aspirar a mistura de transdução e substituí-lo por meio de reprogramação fresco (média de expansão livre de soro (SFEM), 100 U/mLPenicillin/estreptomicina, 100 ng/mL murino Stem Cell Factor (mSCF), interleucina-3 de 10 ng/mL murino (IL3), 2 recombinante humana de U/mL Eritropoietina (hrEPO) e 100 nM dexametasona).</li>
	<li>Incube durante 8 dias 37 ° C em condições de hipóxicos, adicionando meio reprogramação fresco a cada 2 dias. Depois de cinco a oito dias, reprogramação bem sucedida irá produzir aglomerados de células que têm destacado da placa.</li>
	<li>Para coletar as células reprogramadas para análise, delicadamente Pipete acima e para baixo para colhê-las diretamente do prato. Colher os fibroblastos untransduced para comparação, dissociar as células da placa usando 1 x do trypsin-EDTA e recolher.</li>
</ol>

<ol><li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+We+Really+Vastly+Outnumbered%3F+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li>
<li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21057492">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li>
<li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li>
<li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+conversions%3A+unnatural+but+useful%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li>
<li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+reprogramming%3A+a+two-way+street%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li>
<li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+couples+erythropoiesis%2C+B-lymphopoiesis%2C+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li>
<li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li>
<li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li>
<li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83(2016).</li>
<li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li>
<li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890(2013).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse para o relatório.

Superexpressão de um cocktail de quatro fatores, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), é suficiente para reprogramar os fibroblastos murino e humanos diretamente ao iEPs10. As células reprogramadas eritroide assemelhava-se muito bona fide eritroide progenitores em termos de morfologia, fenótipo, expressão gênica e formadoras de capacidade. Esta constatação corrobora o raciocínio de usando ...

Glóbulos vermelhos (hemácias) são essenciais em todos os vertebrados e somam 84% de todas as células do corpo humano1. De embrionário para a vida adulta, nossa saúde é altamente dependente de regulação exata da homeostase de RBC. A produção contínua de hemácias maduras durante todo o desenvolvimento na idade adulta é conhecida como eritropoiese. Um grande desafio na pesquisa de eritropoiese é definir os mestre reguladores que coordene o desenvolvimento de RBC e o interruptor entre eritropoiese primitivo e definitivo. Reprogramação de linhagem direta dos progenitores eritroide apresenta uma oportunidade de entender melhor eritroide desenvolvimento em vivo.
Linhagem direta reprogramação (DLR), também conhecido como transdiferenciação celular, é o processo de reprogramação de um tipo de célula diretamente em outro, ignorando pluripotentes e multipotentes progenitoras estágios. DLR até agora tem sido usado para produzir vários tipos de células, incluindo neural2e nefrótica7, células progenitoras hematopoiéticas3,4,5, hepática6 . Para os biólogos do desenvolvimento, DLR tornou-se uma ferramenta importante para interrogar os aspectos de compromisso linhagem e processos de diferenciação terminal8,9. DLR pode complementar e substituir parcialmente na vivo estudos para mecanismos de compreensão do destino célula fatores determinantes durante o desenvolvimento. O protocolo DLR para reprogramação de progenitores eritroide descritos neste artigo fornece o campo um método complementar para estudos do desenvolvimento da eritropoiese.
Nós demonstramos anteriormente que a superexpressão de um cocktail de quatro fatores, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), é suficiente para reprogramar os fibroblastos murino e humanos diretamente de progenitores eritroide induzida (iEPs) 10. the GTLM-reprogramado eritroide células assemelham-se grandemente bona fide eritroide primitivo progenitores em termos de morfologia, fenótipo e gene expressão10. Assim iEPs tem limitada capacidade de proliferação e amadurecer-se hemácias nucleadas similares àqueles produzidos transitoriamente no embrião precoce antes do início da eritropoiese definitivo. Fazendo alterações nas condições de reprogramação (por exemplo, mutações pontuais em reprogramação fatores ou adição de outros factores), pode-se entender como isso leva a alterações no desenvolvimento eritroide e diferenciação. Por exemplo mostramos que a adição de Klf1 ou Myb ao coquetel GTLM altera o padrão de expressão de globina de predominantemente embrionário (primitivo) para principalmente adultos (definitivo). Esta constatação corrobora a validade do uso de DLR como uma ferramenta para a definição de fatores do desenvolvimento na eritropoiese.
Aqui, podemos descrever o processo de geração iEPs de fibroblastos de ponta de cauda de rato (TTF). Em nossos resultados representativos, realizamos a reprogramação de fibroblastos dos ratos da linhagem de rastreamento eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expressam a proteína fluorescente amarela (eYFP) do locus Rosa26 em todas as células que expressaram o receptor de eritropoetina, permitindo a fácil visualização do compromisso com a linhagem eritroide. Usando esse método, YFP positivo (EpoR +) células estão presentes logo em cinco dias depois de transdução. Este protocolo, portanto, oferece uma técnica rápida e robusta para a geração de eritroide progenitores em vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM sem piruvato de sódio</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Meio de cultura para células PhGP</td></tr><tr><td>DMEM com piruvato de sódio</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Meio de cultura para fibroblastos da ponta da cauda</td></tr><tr><td>StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9650</td><td>Mídia de reprogramação&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino HyClone</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30071.03HI</td><td>Fator de crescimento</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina HyClone (100x)</td><td>Ge Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Antiboiotic</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td>SNL media é complementado com este</td></tr><tr><td>Trypsin HyClone (1x)</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>Agente de dissociação celular</td></tr><tr><td>Fator de Células-Tronco Murinas (mSCF)</td> <td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>Adicionado ao meio de reprogramação</td></tr><tr><td>Murine Il-3 Recombinante</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>Adicionado ao meio de reprogramação</td></tr><tr><td>eritropoietina recombinante humana (hrEPO)</td> <td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>Adicionado ao meio de reprogramação</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>50-02-2&nbsp; &nbsp;</td><td>Adicionado à mídia de reprogramação</td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>Sigma</td><td>9000-70-8&nbsp;</td><td>Dissolvido em dH2O e usado para placas de revestimento. Garanta a esterilidade antes de usar.</td></tr><tr><td>Cloridrato de Blasticidina S</td><td>Sigma</td><td>3/9/3513</td><td>Antibiótico de seleção. Afeta tanto células pró- quanto eucarióticas</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Ge Life Sciences</td><td>SH30850.03</td><td>Usado para etapas de lavagem</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>Infecção / Transfecção&nbsp; Reagente</td></tr><tr><td>de transfecção de FuGENE HD Reagente de transfecção</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Reagente de transfecção para linha celular PhGP</td></tr><tr><td>Unidade de filtro de seringa Millex-GP 0,22 &micro; m</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td>Usado para filtrar o sobrenadante de vírus</td></tr><tr><td>BD Emerald Hypodermic Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>SKU: 307736</td><td>Usado para filtrar o sobrenadante de vírus</td></tr><tr><td>100 mm Placa</td><td>de cultura Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Falcon</td><td>10799541</td><td>Pinça de joalheiro de cultura de células</td></tr><tr><td>#5</td><td>Sklar</td><td>66-7642</td><td>Usado para manipulação de pequenos fragmentos de cauda</td></tr><tr><td>Tesoura de Íris Sklarlite</td><td>Sklar</td><td>23-1149</td><td>Usado para cortar a cauda em pequenos pedaços</td></tr><tr><td>Kit de Depleção de Células de Linhagem, camundongo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Para depleção de células hematopoiéticas em culturas de fibroblastos</td></tr><tr><td>CD117 MicroBeads, camundongo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-224</td><td>Para depleção de células hematopoiéticas em culturas</td></tr> <tr><td>de fibroblastosCélulas PheonixGP</td><td>ATCC</td><td>CRL-3215</td><td>linha celular de embalagem retroviral</td></tr><tr><td>EcoPAC vector (pCL-Eco)&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-29540</td><td>vetor auxiliar retroviral contendo genes gag e pol</td></tr><tr><td>pMX-Gata1</td><td>Clonado em laboratório</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-Tal1</td><td>Clonado em laboratório</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-Lmo2</td><td>Clonado em laboratório</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-cMyc</td><td>Clonado em laboratório</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software CellSens Standard 1.6&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Software de análise Cytospin</td></tr></tbody></table>

direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Diferenciação e compromisso de célula eritroide proceder através da ativação de uma rede de linhagem restrita transcriptional orquestrada por um grupo de destino célula determinando e fatores de maturação. Estabelecemos anteriormente para definir um conjunto mínimo de factores necessários para instruir o desenvolvimento de células vermelhas do sangue, usando a linhagem direta reprogramação de fibroblastos em eritroide induzido progenitores/precursores (iEPs). Nós mostramos a superexpressão de Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc (GTLM) podem rapidamente converter murino e humano fibroblastos diretamente para iEPs que se assemelham a bona fide eritroide de células em termos de morfologia, fenótipo, e expressão gênica. Pretendemos que iEPs irá fornecer uma ferramenta valiosa para estudar o Regulamento de eritropoiese e célula de destino. Aqui descrevemos o processo gradual de conversão de fibroblastos de ponta de cauda murino em iEPs através da transcrição orientada por fator linhagem direta reprogramação (DLR). Neste exemplo, podemos realizar a reprogramação de fibroblastos de camundongos de linhagem traçagem eritroide que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) sob o controle do promotor eritropoietina receptor gene (EpoR), permitindo a visualização da célula eritroide indução de destino após reprogramação. Na sequência deste protocolo, os fibroblastos podem ser reprogramados em iEPs dentro de cinco a oito dias.
Enquanto melhorias ainda podem ser feitas para o processo, nós mostramos que mediada por GTLM reprogramação é um processo rápido e directo, produzindo células com propriedades de bona fide células progenitoras e precursor de eritroide.

Aqui nós apresentamos um protocolo pode ser reproduzido para a produção de iEPs de fibroblastos adultos usando DLR orientado para a fator de transcrição. Avaliamos que a reprogramação de células usando citometria de fluxo, formadoras ensaios e gene análise da expressão. Para auxiliar a visualização da conversão ao destino de célula eritroide, realizamos a reprogramação de fibroblastos dos ratos da linhagem de rastreamento eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expressam a p...

Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Reprogramação direta de linhagem de fibroblastos para células progenitoras eritrópicas. É um novo método que desenvolvemos em nosso laboratório para estudar melhor os processos de regulação transcricional determinando o destino das células eritróides. A principal vantagem em usar a reprogramação direta de linhagem para estudar o desenvolvimento é que é uma técnica muito simples.Assim, em comparação com, por exemplo, a perda de estudos de função dentro de camundongos eliminatórios, aqui podemos muito facilmente manipular o fator, expressá-lo demais em determinado momento, e depois obter facilmente material suficiente para estudar efeitos a jusante, como modificações de cromatina ou mudanças de expressão genética. Embora este método se concentre na reprogramação de fibroblastos de ponta de cauda de rato para progenitores eritróides, ele também pode ser aplicado a outros tipos de células fibroblastos, e a outros organismos, incluindo humanos. As implicações dessa técnica se estendem para a medicina de transfusão, na forma de abrir caminho para a produção de glóbulos vermelhos in vitro.Demonstrando o procedimento será Alban Johansson do meu grupo de pesquisa. Comece cobrindo a superfície dos pratos com 0,1% de gelatina. Incuba-os a 37 graus Celsius por aproximadamente 20 minutos.Aspire a solução de gelatina e deixe os pratos secarem. Use uma tesoura para cortar na base da cauda de um rato eutanizado para removê-lo. Coloque a cauda em DPBS com 2%FBS até estar pronta para uso.Em uma capa de cultura de tecido em condições estéreis, prepare uma solução de trippsina diluída de 0,02% de trippsina EDTA em DPBS e adicione 5 mililitros em um prato de 10 centímetros não revestido. Em uma capa de cultura de tecido, lave a cauda em 70% de etanol em um tubo de 15 mililitros para cobri-lo e, em seguida, em DPBS. Coloque a cauda plana em um prato e use fórceps para mantê-lo no lugar.Use um bisturi para fazer uma incisão na cauda ao longo de seu eixo longitudinal da base até a ponta. Use um par de fórceps para agarrar a cauda e segurá-la verticalmente e usar um segundo par para segurar a pele ao lado da incisão na base da cauda e descascá-la de volta. Faça isso em ambos os lados da incisão até que a pele possa ser descascada puxando para baixo em direção à ponta da cauda.Segure a cauda descascada com fórceps sobre o prato contendo a solução de trippsina. Use uma tesoura de dissecção para cortar a cauda em pequenos pedaços. Use uma tesoura para fragmentar essas peças na solução de trippsina em pedaços ainda menores e, em seguida, incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos.Para saciar a trippsina, adicione dois volumes de fex médio, DMEM com suplementos e antibióticos. Colete o conteúdo inteiro do prato em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar o tubo a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Aspire o supernascimento e resuspenha a pelota contendo os fragmentos de cauda em 10 mililitros de meio FEX fresco. Transfira esta suspensão para um prato revestido de gelatina. Incubar a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e 4% de oxigênio, adicionando um fex fresco a cada dois dias.Observe a cultura após cinco a sete dias, em que os fragmentos da cauda se anexaram na parte inferior do prato, e os fibroblastos estão se afastando deles. Uma vez que os agrupamentos de fibroblastos são visíveis, agite suavemente o prato para desalojar peças de cauda. Aspire o meio com todos os fragmentos ósseos, deixando os fibroblastos presos à placa.Adicione 10 mililitros de fex fresco e cultive os fibroblastos até confluentes. Para garantir que não haja contaminação por progenitores hematopoiéticos na cultura do fibroblasto, dissociar as células da placa usando trippsina EDTA como descrito no manuscrito. Adicione o meio e colete as células e adicione contas magnéticas com anticorpos.Use um sistema de separação magnética para remover células expressando marcadores hematopoiéticos. Incluir esta etapa é absolutamente vital porque elimina quaisquer HSPCs que possam estar presentes na cultura e, portanto, a probabilidade de quaisquer falsos positivos no dia da análise facs. Células de embalagem retroviral de sementes a aproximadamente 25.000 células por centímetro quadrado em um prato tratado de cultura tecidual.Incubar as células em DMEM de alta glicose a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. Na manhã seguinte, remova o meio e adicione metade do volume usado para cultivar durante a noite do DMEM sem aditivos. À tarde, verifique as células quanto à confluência de 70 a 80% necessária para transfecção.Inicie a transfecção preparando uma mistura de dois a um de seis microgramas do vetor de expressão PMX e três microgramas do vetor auxiliar contendo genes gag, pol e envelope para cada fator de reprogramação. Em seguida, para cada fator de reprogramação, adicione 300 microliters de DMEM de temperatura ambiente em um tubo de poliestireno estéril. Em seguida, adicione cuidadosamente 27 microliters de reagente comercial de transfecção de temperatura ambiente diretamente no meio para evitar o contato com a parede do tubo.Adicione a mistura de plasmídeos no reagente de transfecção contendo tubo. Vórtice brevemente e incubar a mistura por 15 minutos em temperatura ambiente. Vórtice a mistura de DNA do reagente transfecção novamente.Adicione-o dropwise às células de embalagem retrovirais para que ela se espalhe uniformemente sobre a cultura e incubar a 37 graus Celsius. 24 horas após a transfecção, retire o médio e adicione DMEM com 20% FBS e 100 unidades por estreptomicina de penicilina mililitro. 48 horas após a transfecção, colete o supernascer e filtre-o através de um filtro de seringa de tamanho de poro de 0,22 micrômetro.Comece a transdução semeando os fibroblastos da ponta traseira a 10.000 células por centímetro quadrado em pratos pré-revestidos de gelatina de 0,1% em meio FEX. Incubar a 37 graus Celsius por 24 horas. Ao realizar esta etapa, é importante adicionar os quatro supernantes retrovirais em uma proporção igual para garantir que todos os quatro transgenes contribuam igualmente para o processo de reprogramação.No dia seguinte, prepare uma mistura de transdução adicionando primeiro um volume de supernanato viral para cada fator de reprogramação suplementado com quatro microgramas por mililitro de reagente de infecção retroviral a seis volumes de fex médio. Depois disso, aspire o meio FEX da cultura do fibroblasto e adicione a mistura de transdução. Incubar a reação de transdução por quatro horas a 37 graus Celsius em condições hipoxilicas a 5% de dióxido de carbono e 4% de oxigênio.Após quatro horas, aspire a mistura de transdução e adicione meio de reprogramação fresco. Incubar a 37 graus Celsius em condições hipoxicas por oito dias, adicionando meio de reprogramação fresco a cada dois dias. Observe a reprogramação bem sucedida com aglomerados de células separadas da placa.Para colher células reprogramadas do prato para análise mais aprofundada, pipeta-as suavemente para cima e para baixo e, em seguida, coletar as células. Após a reprogramação bem-sucedida dos iEPs, as células YFP positivos são observáveis até cinco dias após a transdução. Eles se tornam redondos, levantam da superfície da placa, começam a formar aglomerados, e exibem uma morfologia precursora eritróida.A hemoglobinização de algumas células é evidente pela coloração positiva da benzidina. Uma pequena fração expressa o marcador de superfície específico do eritróide TER-119. No oitavo dia, grandes aglomerados YFP positivos podem ser vistos.Dia 8, os IEPs têm um fenótipo eritródo mais diferenciado do que o quinto dia iEPs. Eles são significativamente menores, acumularam mais hemoglobina, e mostram maior expressão do TER-119. A análise da expressão genética por qPCR de iEPs coletados no oitavo dia mostra que eles quase desligaram a expressão de genes de fibroblasto e têm regulado muitos genes eritróid.Depois de realizar ensaios de formação de colônias BFU-e nas células reprogramadas, os oito dias formam dois tipos de colônias, distintamente vermelhas e não visivelmente vermelhas. Enquanto as células das colônias vermelhas exibiam morfologia eritroblast, as células de colônias não vermelhas não. Aproximadamente um em cada 1.000 dias cinco iEPs formaram colônias vermelhas, enquanto apenas aproximadamente uma em cada 10.000 colônias se formaram a partir do oitavo dia iEPs.A eficiência de reprogramação de fibroblastos de ponta traseira ou TTFs é influenciada pelo número de passagem. Os TTFs que haviam sido passagens nove vezes mostraram uma redução dramática na capacidade de produzir clusters de iEPs em comparação com as células que haviam sido passagemdas três vezes. Além disso, diferentes condições culturais podem afetar a eficiência da reprogramação.Os TTFs transduzidos cultivados na normoxia são muito mais lentos para reprogramar e os clusters IEP são observados após 10 dias em vez de cinco a oito dias. Após esse procedimento, métodos como ensaios de formação de colônias, análise de qPCR e FACS podem ser aplicados para determinar o estado de diferenciação celular. Desde o seu desenvolvimento, essa técnica está abrindo caminho para pesquisadores no campo da eritropoiese na compreensão da troca entre células eritróides primitivas e definitivas em camundongos e humanos.

direct-lineage-reprogramming-adult-mouse-fibroblast-to-erythroid

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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