Name: Imunização de alpaca (Lama pacos) com antígenos da proteína e a produção de anticorpos de domínio único antígeno-específicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprenda a produzir anticorpos de domínio único em alpacas (Lama pacos) por meio de imunização com antígenos e seleção por phage display. Este método permite gerar anticorpos contra até cinco proteínas distintas em um único animal.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (P30GM103486).

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Os Drs Whiteheart e Hersh são da Universidade de Kentucky e operam um núcleo no centro de Medicina Molecular que produz anticorpos único domínio em alpaca como uma taxa de serviço.

Como observado, a alta afinidade e especificidade dos anticorpos de domínio único, combinado com sua expressão facile e estabilidade, fazem-los reagentes ideais para as aplicações na investigação biomédica, como reagentes bioquímicos críticos, ferramentas de diagnóstico, ou agentes terapêuticos18. Para aplicações comerciais, existem alguns problemas relacionado ao intelectual propriedade que deve ser considerado. Além disso, os anticorpos de domínio único podem ser modificados para conter marcadores específicos ou tags que podem ser usados como repórteres em celulares ensaios ou no diagnóstico. A chave para estes usos é a capacidade de produzir anticorpos específicos de domínio único contra os antígenos de interesse. Um método é descrito aqui para produzir anticorpos único domínio usando alpacas, que produz uma resposta imune robusta contra uma grande variedade de antígenos da proteína. Considerações para manuseio de animal e conformidade normativa são descritas. Estas são a chave para o sucesso nesta parte do processo.
Existem outras estratégias para a produção de anticorpos de domínio único que não exigem a imunização, mas em vez disso, use bibliotecas semi-sintéticos com sistemas diferentes para a selecção e optimização iterativa de afinidades19,20 . No entanto, a vantagem de usar bibliotecas derivadas animais imunizados é a capacidade de isolar confiantemente anticorpos altamente enriquecido, diversificada e alta afinidade de domínio único. Além disso, não só são observadas variações de sequência significativa, mas uma maioria significativa de anticorpos específicos de domínio único isolado tinha exclusivas inserções e exclusões, particularmente em CDR3.
Além disso, o único domínio anticorpos podem ser produzidos através de um processo simples que exige apenas pequenas injeções do antígeno e após este processo, os animais podem ser devolvidos ao rebanho. Digno de nota, o animal pode ser usado livremente para a produção de fibra, mas deve ser excluído do uso como carne (cadeia alimentar) devido ao uso do teste de antígenos e não-FDA adjuvante aprovado para a produção de anticorpos de domínio único. Quando o procedimento é concluído, os animais deve ser monitorados por uma semana, dado a um exame final do veterinário e então podem ser retornou a sua casa de lavoura ou descansou durante seis meses antes de uma nova rodada de produção de anticorpos de domínio único.

Alpacas e outros membros da família camelid, tornaram-se uma fonte popular para a geração de anticorpos para pesquisa biomédica1,2,3. Camelídeos têm um exclusivo sistema imunológico em que eles produzem anticorpos normais, bem como da cadeia pesada anticorpos único que permitem a produção de anticorpos muito menores de domínio único, mantendo a alta especificidade e afinidade elevada. Assim, anticorpos camelid fornecem um versátil reagente útil para uma variedade de propósitos. Um método para imunizar alpaca e produzir anticorpos de domínio único para uma variedade de antígenos da proteína é descrito aqui. Estes anticorpos podem ser produzidos em camelídeos através de um processo relativamente simples que requer apenas a imunização através de pequenas injeções da proteína alvo (antígeno) e um empate de sangue4. Posteriormente, a construção de biblioteca, de exposição do fago M135 e panning contra o antígeno recombinante6 é usado para isolar e produzir anticorpos de domínio único com as características desejadas. Porque o processo aproveita o poder da tecnologia de exibição do fago, cinco ou mais antígenos podem ser utilizados simultaneamente por animal, reduzindo assim o número de animais utilizados e custos associados.
Típico dos mamíferos anticorpos ou imunoglobulinas são moléculas grandes, que consiste de dois tipos de correntes (2 correntes pesadas e 2 cadeias leves), que estão ligados entre si através de ligações de bissulfeto. Estes anticorpos são relativamente grandes, exibindo pesos moleculares de ~ 140-190 kDa para as espécies mais abundantes de IgG de seres humanos, ratos, cabras e coelhos. Devido à sua estrutura multi subunidade, alto peso molecular e ligações de bissulfeto, imunoglobulinas podem ser bastante desafiadoras para produzir em grandes quantidades, tornando seu custo elevado. Na década de 1990, foi descoberto que, além da imunoglobulina tipo típico dos mamíferos, uma nova forma de imunoglobulina que é mais simples na estrutura, possuindo apenas pesadas correntes7camelídeos, que inclui camelos, lhamas e alpacas fazem. Estes anticorpos camelid exclusivo possuem a mesma capacidade de vincular especificamente substâncias estranhas com alta afinidade, mas só são feitos de uma proteína de cadeia8. Além disso, anticorpos camelid podem ser truncados experimentalmente para um fragmento de unidade a VHH ainda menor, também chamado de um domínio único anticorpo9. Devido ao seu pequeno tamanho, único domínio anticorpos são úteis para uma ampla gama de aplicações de investigação biomédica e estão disponíveis em uma variedade de fontes acadêmicas e comerciais1,10. Uma exceção parece ser mancha ocidental desde que anticorpos único domínio mais frequentemente são direcionados contra epítopos dependente de conformação, que geralmente são perdidos nas condições desnaturação usadas em borrões ocidentais.
Uma vez que eles são constituídos por uma cadeia única de polipeptídeos, anticorpos específicos de domínio único podem ser selecionados e facilmente produzidos em grandes quantidades como proteínas recombinantes em bactérias. Anticorpos de domínio único também podem ser geneticamente modificados para conter marcadores específicos ou tags que podem ser usados como "grupos de repórter" para o diagnóstico de doenças11. Esta facilidade de manipulação, juntamente com sua flexibilidade de uso produz anticorpos de domínio único um recurso importante para pesquisadores em universidades e em outros lugares.
Como parte de um National Institutes of Health apoiado núcleo, os métodos existentes foram adaptados para produzir anticorpos de domínio único de alpacas3,4. Alpacas têm vantagens significativas em ambos facilidade de manuseio em relação ao maior camelid familiares bem como acessibilidade. Alpacas são amplamente levantadas para fibra e carne e, portanto, podem ser obtidos regionalmente os agricultores locais da alpaca, que podem ser identificados através de seus sites ou através de associações de criadores do estado. Existem duas raças de alpacas, Suri e Huacaya. Huacaya são mais comuns e foram usados para este protocolo, mas o protocolo é geralmente aplicável para qualquer raças e também mais amplamente aplicáveis aos outros camelídeos.

<table><tbody><tr><td>GERBU FAMA adjuvante</td><td>Biotechnik, Heidelberg, Alemanha&nbsp;</td><td>3003,6001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de coleta de soro</td><td>Becton Dickinson</td><td>367983</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de coleta de sangue</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de coleta de sangue Vacutainer</td><td>Becton Dickinson</td><td>368652</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorp Placas imunológicas</td><td>Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-lhama IgG de cabra conjugado com HRP&nbsp;</td><td>Bethyl Labs</td><td>A160-100P</td><td></td></tr><tr><td>TMB reagente substrato de peroxidase cromogênica&nbsp;</td>Leitor de Placas <td>KPL</td><td>50-76-03</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Spectramax</td><td>M5</td><td>Qualquer leitor compatível com UV/VIS é aceitável</td></tr><tr><td>Tubo de separação de lifócitos Uni-SepMAXI+</td><td>Kit Mini Novamed</td><td>U-17</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>QIAcoluna trituradora</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV transcriptase reversa&nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>solução AEBSF</td><td>Biosynth</td><td>A-5440</td><td></td></tr><tr><td>TG1 células competentes de exibição de fagos</td><td>Lucigen</td><td>60502</td><td></td></tr></tbody></table>

imunização de alpaca (lama pacos) com antígenos da proteína e a produção de anticorpos de domínio único antígeno-específicas

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Neste manuscrito, um método para a imunização de alpaca e o uso de métodos de biologia molecular para produzir anticorpos antígeno-específicos de domínio único é descrito e demonstrado. Camelídeos, como as alpacas e lhamas, tornaram-se um recurso valioso para a investigação biomédica desde que eles produzem um tipo de romance de anticorpo somente cadeia pesado, que pode ser usado para produzir anticorpos de domínio único. Porque o sistema imunológico é altamente flexível, anticorpos de domínio único podem ser feitos a muitos antígenos diferentes da proteína e até mesmo diferentes conformações do antígeno, com um alto grau de especificidade. Esses recursos, entre outros, fazem anticorpos único domínio uma ferramenta inestimável para a investigação biomédica. Relata-se um método para a produção de anticorpos de domínio único de alpacas. Um protocolo para imunização, coleta de sangue e células B isolamento é descrito. As células-B são utilizadas para a construção de uma biblioteca imunizada, que é usada na seleção de anticorpos específicos de domínio único através de garimpar. Anticorpos de putativo específico único domínio obtidos via panorâmica são confirmados pelo suspenso, ELISA, ou ensaios de gel-turno. Os anticorpos resultantes de domínio único então podem ser usados diretamente ou como parte de um reagente de engenharia. As utilizações de domínio único anticorpo e regentes de domínio único anticorpo-baseado incluem aplicações estruturais, bioquímicas, celulares, in vivo e terapêuticas. Anticorpos de domínio único podem ser produzidos em grandes quantidades, como proteínas recombinantes em sistemas de expressão procarióticos, purificado e usado diretamente ou pode ser projetada para conter marcadores específicos ou tags que podem ser usados como repórteres em estudos celulares ou em diagnósticos.

O protocolo aqui apresentado foi utilizado para gerar o único domínio os anticorpos contra uma variedade de antígenos da proteína. Cinco antígenos foram utilizados por alpaca. Monitoramento imune indicou que a maioria dos antígenos mostrou início de resposta robusta em três semanas (Figura 1). Sangramentos de produção e construção de biblioteca após aproximadamente seis semanas dá o melhor equilíbrio para os animais que têm vários antígenos injetados. Duas rodadas de garimpar foram executadas para cada antígeno e isoladas colônias exibido (Figura 2). Sequenciamento de colônias positivos identificado sequências de anticorpos diversos domínio único para os antígenos diferentes. Para obter exemplos, três clones originais foram isolados para o antigénio de referência Maltose ligação proteína (MBP) (Figura 3A). Como é frequentemente observado, os anticorpos de domínio único contêm sequência significativa diversidade e altamente variável comprimento CDR3 (Figura 3). Estas características são particularmente importantes nas interações de anticorpo/antigénio de domínio único como visto na referência domínio único anticorpo/CX3CL1 complexo17 (Figura 3B).
A maioria das sequências de anticorpo completos no domínio único pode ser expressas e purificada no 1-10 mg/L de cultura (Figura 4A). Devido à diversidade de comprimento CDR3, anticorpos diferentes único domínio mostram ligeira variação no peso molecular. Confirmação de ligação directa e desempenho de aplicativo específico é fundamental. Por exemplo, depois de duas rodadas de seleção contra o antígeno B, um painel de domínio único anticorpos foram identificados (Figura 2). Várias sequências idênticas foram identificadas, e o anticorpo de domínio único foi produzido e purificado. Em seguida foi testado através de tração direta para baixo com resina de afinidade do antígeno e mostrou robusta Associação dose-dependente (Figura 4B). Importante, o anticorpo de domínio único não mostrou nenhuma ligação para controlar a resina. Estes dados demonstram uma interação de ligação directa e que é bem adequado para captura de afinidade em formatos baseados em ELISA e suspenso.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> Figura 1 : Monitoramento imune representativo dos dois antígenos distintos mostrando significativa resposta imune específica a antígenos distintos no mesmo animal. Muitos antígenos mostram resposta robusta logo em três semanas após iniciar a imunização, com a maioria apresentando resposta máxima após seis semanas. Seis semanas também permite a maturação de afinidade e é o tempo recomendado para a produção sangrar e isolamento de células B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> Figura 2 : Confirmação de PCR-baseados de clones positivos. As primeiras demão abrangem os MCS do vetor pMES4, e um clone de nanobody positivo produz um amplicon de ~ 500 bp (marcados com *). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> Figura 3 : Sequências de antígeno-específicas destacam a diversidade de anticorpos de domínio único da alpaca. (A) alinhamento de sequências de anticorpo de Selecione único domínio isolado para MBP com uma referência domínio único anticorpo 4XT1, com estrutura e regiões determinante de complementaridade (Kabat) destacadas abaixo. (B) estrutura de alpaca domínio único anticorpo 4XT1 acoplado a CX3CL1 (PDB 4XT1), enfatizar o papel crítico da variável CDR loops na ligação de antígeno específico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> Figura 4 : Purificação e validação de anticorpos único domínio. (A) SDS-PAGE de anticorpos de domínio único do IMAC purificado, comparando os anticorpos diversos domínio único. Diferentes pesos moleculares são principalmente devido à variação de comprimento do loop CDR3. Diferentes níveis de expressão são também observados, com uma minoria de anticorpos de domínio único, mostrando rendimento pobre de proteína purificada. (B) verificação da vinculação direta usando uma afinidade de antígeno suspenso. Ligação de anticorpo robusto dose-dependente e único domínio é observada com resina acoplados do antígeno, mas não com resina de controle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um método para a produção de anticorpos de domínio único de alpacas, incluindo imunização, coleta de sangue, célula B isolamento e seleção é descrito.

Imunização de alpaca (Lama pacos) com antígenos da proteína e a produção de anticorpos de domínio único antígeno-específicas

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Os métodos que descrevemos aqui foram adotados pelo nosso NIH COBRE patrocinado, University of Kentucky Protein Core Facility para ajudar pesquisadores a produzir anticorpos de domínio único em alpacas. Anticorpos de domínio único são uma ferramenta importante usada para responder a perguntas-chave em pesquisas biomédicas. A principal vantagem das técnicas que demonstramos é que permite a produção de anticorpos de domínio único para até cinco proteínas distintas em uma única alpaca.As implicações dessa técnica se estendem à saúde humana e ao tratamento de doenças, uma vez que esses anticorpos de domínio único podem ser usados como terapêutica, como vacinas e diagnósticos. O obstáculo mais significativo para os investigadores biomédicos mais estabelecidos é o manuseio de animais de grande porte, como a alpaca. A demonstração visual do manuseio de uma alpaca, a injeção de antígenos e a coleta de sangue são fundamentais para a produção bem sucedida de anticorpos de domínio único nesses cameládes.Demonstrando o procedimento estarão o Doutor Jeff Smiley, Veterinário Universitário, Kathy Boaz, Técnica Veterinária, e a Srta. Erin Jones, Técnica de Animais de Laboratório. O manuseio do sangue será demonstrado pelo Doutor Martin Chao, Pesquisador Associado. As histórias reais desta produção são Olhos Azuis, Big Boy, ou carinhosamente conhecido como o Gorila, e Freddie, nossas alpacas de Kentucky.Para começar, contenha o animal com uma cabeçada e chumbo. Em seguida, corte o cabelo da alpaca com cortadores elétricos em um padrão lunar crescente ao longo da base de seu pescoço, de ombro a ombro. Segure cuidadosamente a alpaca pela cabeça e pescoço, e injete lentamente os antígenos subcutâneamente com uma agulha de calibre 22 ao longo da base do pescoço, perto dos linfonodos de arco.Realize cinco injeções de aproximadamente 200 microliters cada, cerca de cinco centímetros de distância. Depois disso, monitore o animal por cerca de 20 minutos para sinais de anafilaxia. Inspecione o local de injeção para inflamação localizada nos locais de injeção semanalmente.Para tirar sangue, corte o cabelo da alpaca e desinfete o local de coleta com cotonetes de álcool. Contenha a alpaca suavemente, garantindo que o pescoço seja mantido ereto e reto. Usando as projeções ventral do processo transversal das vértebras como um marco, oclui a veia aplicando pressão apenas medial ao processo ventral.Em seguida, insira a agulha em um ângulo de 45 graus, ligeiramente medial para a projeção, em direção ao centro do pescoço. Manipule a agulha até o sangue fluir. Primeiro, diluir 15 mililitros do sangue coletado com cinco mililitros de PBS.Em seguida, pipeta sangue em um tubo de separação linfócito para isolar linfócitos sanguíneos periféricos, ou PBLs, através de centrifugação gradiente de densidade. Remova suavemente a camada de plasma superior, salvando-a em um tubo separado. Em seguida, remova suavemente a camada PBL e transfira-a para um tubo estéril de 50 mililitros.Adicione 45 mililitros de PBS pré-refrigerados aos PBLs e gire o tubo por 20 minutos a 800 vezes G, e quatro graus Celsius. Remova o supernatante com uma pipeta, deixando a pelota contendo os linfócitos. Lave a pelota mais duas vezes com cinco mililitros de PBS pré-refrigerados para preparar os PBLs para o isolamento do RNA.Usando este protocolo, anticorpos de domínio único foram gerados contra uma gama de antígenos proteicos. O monitoramento imunológico indicou que a maioria dos antígenos apresentou resposta robusta a partir de três semanas, e que o momento ideal para obter sangue é de seis semanas. Sequenciando as colônias positivas identificou diversas sequências de anticorpos de domínio único para diferentes antígenos.Por exemplo, três colônias únicas foram isoladas à proteína de ligação de antigens. Geralmente, os anticorpos de domínio único continham uma diversidade de sequência significativa e comprimento altamente variável de laços de ligação de antígeno. Esses recursos são particularmente importantes em interações de anticorpos de domínio único.Este procedimento permite a produção de anticorpos de domínio único para até cinco antígenos por animal. Uma única coleta de sangue, e construção de biblioteca, é utilizada para cada animal. Com a seleção baseada em exibição de phage utilizada para identificar anticorpos específicos de antígeno e de cadeia única.Ao fazer as injeções de antígeno e amostragem de sangue, é importante manter as alpacas em grupo, o que as mantém mais calmas. Isso pode ser feito usando cabrestos e cabos, e amarrando-os em proximidade durante os procedimentos.

immunization-alpacas-lama-pacos-with-protein-antigens-production

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Linhagens determinados são capazes de resistir a indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) com proteína básica de mielina. Descrito aqui é um simples protocolo de imunização que reverte a apatia e induz a doença paralítica em vários típicos EAE manchas resistentes do mouse.

Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

Vacinação profilática e terapêutica, muitas vezes não estimulam fortes respostas imunes, devido à semana de drenagem da vacina para os gânglios linfáticos e, consequentemente, fraco envolvimento das células do sistema imunológico. Por injecção directa de vacina para os nódulos linfáticos, assim chamada injecção intralinfática, a eficácia da vacina pode ser fortemente melhorada e as doses de vacina podem ser reduzidos.

Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

Um protocolo otimizado é apresentado para a geração de anticorpos monoclonais baseados na tecnologia de hibridoma. Os camundongos foram imunizados com um imunoconjugado. As células do baço foram fundidas por PEG e um impulso elétrico com células de mieloma imortal. As células de hibridoma produtoras de anticorpos foram selecionadas por HAT e triagem ELISA antígeno-específica.

Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação e avaliação de anticorpos monoclonais contra produtos naturais para uso em diversos imunoensaios. Esse procedimento inclui imunização, fusão celular, indirecto ELISA competitivo para clone positivo triagem e preparação de hibridoma monoclonal. As especificações para a caracterização de anticorpo usando análises de ELISA e MALDI-TOF-MS também são fornecidas.

Geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais

Descrito, é a preparação de nanopartículas lipossomas antigênicas e seu uso em estimulando células B ativação in vitro e em vivo. Respostas consistentes e robustas anticorpo levaram ao desenvolvimento de um novo modelo de alergia ao amendoim. O protocolo para a geração de lipossomas antigênicos pode ser estendido para antígenos diferentes e modelos de imunização.

Antigênicos lipossomas para a geração de anticorpos específicos de doença

O desenvolvimento do ensaio ELISpot para cobaia PBMCs interferão-gama permite a caracterização das respostas de células T neste modelo altamente relevantes para o estudo de doenças infecciosas. Temos aplicado o ensaio para medir respostas de células T associadas a intradérmica entrega de vacinas de DNA.

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

O ensaio opsono-adesão é um método alternativo ao ensaio opsono-fagocítico de matar para avaliar as funções opsônicas dos anticorpos no desenvolvimento de vacinas.

Ensaio opsono-adesão para avaliar anticorpos funcionais no desenvolvimento de vacinas contra bacillus anthracis e outros patógenos encapsulados

Este artigo descreve e demonstra a administração de vacinas intranasais e a coleta de leite de coelhos lactadores (Oryctolagus cuniculus) como forma de avaliar a imunidade mucosa em um modelo translacionalmente apropriado de imunização materna.

Imunização Intranasal e Coleta de Leite em Estudos de Imunização Materna em Coelhos Brancos da Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus)

A proteína de anticorpos recombinantes expressa em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e anticorpos monoclonais produzidos usando a tecnologia tradicional de hibridoma pode reconhecer e ligar-se à proteína N aminopeptidase suína (APN).

Produção de anticorpos monoclonais contra aminopeptidase N no epitélio da mucosa intestinal suína

Aqui, apresentamos um protocolo alternativo para induzir ativamente encefalomielite autoimune experimental em camundongos C57BL/6, usando o epítopo imunogênico mielina oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspenso em adjuvante de Freund incompleto contendo a subespécie paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.

Atividade Adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis no Aumento da Imunogenicidade de Autoantígenos Durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Aprenda a produzir anticorpos de domínio único em alpacas (Lama pacos) por meio de imunização com antígenos e seleção por phage display. Este método permite gerar anticorpos contra até cinco proteínas distintas em um único animal.

Imunização de alpaca (Lama pacos) com antígenos da proteína e a produção de anticorpos de domínio único antígeno-específicas

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